GB/T 24864-2010
基本信息
标准号： GB/T 24864-2010
中文名称：鸡胴体分割
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准简介
GB/T 24864-2010 鸡胴体分割
GB/T24864-2010
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标准内容
ICS 65.020.30
中华人民共和国国家标准
GB/T25876—2010
牛早期胚胎性别的鉴定
巢式PCR法
Method of nested PCR for sex identification of early cattle enbryo2011-01-10发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2011-06-01实施
本标准的附录B为规范性附录,附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部摄出本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归比。本标准起草.单位：华中农业大学。本标准主要起草人：张淑君、杨利国、李翔，刘辩,刘文举、胡修忠。TYKAONYKAa
GB/T25876—2010
1范围
牛早期胚胎性别的鉴定巢式 PCR 法本标准规定了牛早期脏胎性射鉴定的巢式PCR方法。本标准适用于奶牛和肉牛旺胎或胎儿的性别鉴定。2规范性引用文件www.bzxz.net
GB/T25876—2010
下列文件中的条款通过本标推的引用而成为本标准的条款。凡是注且期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括谢误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是香可使用这些女件的最新版本。凡是不注甘期的用文件，其最新版本适用于本标推。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本标推。3.1
巢式 PCRnested polymerase chaln reaction利用两套PCR引物(巢式PCR引物对)进行两轮PCR扩增反应，在第一轮扩增中,外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下,作为DNA模板：进行第二轮扩增。3.2
SRY基因
SRYgene
哺乳动物Y染色体上决定雄性性别的基因。3.3
aHBBgene
HBB基因
β珠蛋白基因,位于常染色体上。A原理
利用巢式PCR反应的敏感性高和特异性强的特性，对少量胚胎细胞的SRY基因片段进行扩增，以HBB基因的扩增作为阳性参照，电泳检测PCR扩增产物，根据扩增产物电泳条带鉴定胚胎性别。5引物
5'CTACTCCCCAACCGTCAGAAC 3
5AGCCCAAACCCATCAACCTA 3
5'CCAGGGAACTGCTTGGGTA 3
5'TGCTTCTCCACTTAGGCTCAA3
5'TATCCCACTTACAAGGCAGGTT 3
GB/T25876-2010
5'GCAGACAACAGAGAACAAGAATGA 36试剂和仪器
6.1主要试剂
水应符合GB/T6682中灭菌双蒸水的要求，T2q DNA聚合酶及PCR缓冲液、100 bp梯度DNA标记物。TE缓冲液、TAE缓冲液、加样缓冲液、漠化乙锭等。具体制备方法参见附录A。6.2主要收器
冷冻离心机、梯度PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、pH计、电子天平、恒温水浴锅、双蒸馏水器、微量移液器。
7检测方法
7.1试样的割备与保存
从待检胚胎中分离 4 个(或 4 个以上)细胞,用无菌超纯水冲洗 3 次后,放入 D. 5 mL PCR 管中,加入10μL无菌超纯水,100C煮沸10 min～15min,立即置于碎冰中,冷却后4C离心(8228 g)5min,取上清疲保存于4冰箱中备用。
7. 2SRY 基因片段 PCR 扩增
第一次扩增体系为20μL：0.8mmol/L的dNTP、2U的TaqDNA案合,0.2μmol/L的SRY基因外引物SRY1和内参照引物HBB，10×PCR缓冲液，2.5mtmaI/L的氛化，加适蛋效水反应程序为95预变性5min.94℃变性30$.60℃退火30s72延伸30s.20个错环结束后，72亡再延伸10min,4℃保温2min~10min
取第一次PCR扩增产物8μL，作为第二次扩增模板，同时妞人10×PCR缇冲液、2.5mmol/L的氯化镁,0. 8 mmal/L 的 dNTP 1,6 μL2U 的 Tag DNA 聚合酶,0. 2 μmol/L 的 SRY 基因内引物SRY2和内参照引物HBB,适量的双蒸水至 20 μLt反应程序为95C预变性5min,94变性30s,60它退火30s,72C延伸30s，34个循环后，72℃再廷伸10min，4它保温2min~10min。7.3结巢判定
取 5 μL PCR 扩增产物,1. 0%~1. 5%琼脂糖凝胶电泳(3 V/cm~～5 V/cm,电泳 20 min～30 min) ,汉化乙锭染色，凝胶成像系统检查，电泳图谱见附录B中的图B,1。电泳图谱中出现558bp(HBB扩增产物）和219bp(SRY扩增产物)条带，判定为雄性胚胎；电泳图谱中且出现558bp条带，判定为雌性胚胎。2
TYKAONYKACA
TE 缓冲液
10×PCR塑冲液
球脂糖电泳缓冲液
加样羲冲液
溴化乙链
谢录A
（斑料性附录）
试剂和材料
表 A. 1 试剂和材料
10 mtmol/L Tria-HCl(pH 8. 0),1 mmol/L EDTA(pH 8. 0)GB/T 25876--2010
200 mmol/L Tis-HCl(pH 8. 4),200 tmtml/L 氧氯化钾,100 mrmol/L 硫酸铵+15 mmol/L 戴化镁242. 28 g Tris碱,57. 1 mI.冰乙酸,110 mL 0. 5 tno1/L EDTA(pH 8, 0).加双热水定容至1000mL使用时50倍帮释
0.25%漠酚蓝（质量浓），40%蔗糖（质量依度）。100 mL双蒸水中其人0,1多误化乙疑，稳拌使完全溶解，转人棕色试剂瓶，解箱包裹、备用GB/T25876—2010
附录B
（规范性附录）
SRY基因和内参基因巢式PCR产物电泳图谱与结果判断示意图M
M为1cobp梯度DNA标记物，
脉道1--4均为雌性胚胎样本，检出558bp条带；4
泳道5~8均为雄性压胎样本，检出558bp和219bp两个条带图B.1SRY基因和内参基因巢式PCR产物电泳图谱与结果判读示意图YKAoNYKAea
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中华人民共和国国家标准
GB/T25876—2010
牛早期胚胎性别的鉴定
巢式PCR法
Method of nested PCR for sex identification of early cattle enbryo2011-01-10发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2011-06-01实施
本标准的附录B为规范性附录,附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部摄出本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归比。本标准起草.单位：华中农业大学。本标准主要起草人：张淑君、杨利国、李翔，刘辩,刘文举、胡修忠。TYKAONYKAa
GB/T25876—2010
1范围
牛早期胚胎性别的鉴定巢式 PCR 法本标准规定了牛早期脏胎性射鉴定的巢式PCR方法。本标准适用于奶牛和肉牛旺胎或胎儿的性别鉴定。2规范性引用文件www.bzxz.net
GB/T25876—2010
下列文件中的条款通过本标推的引用而成为本标准的条款。凡是注且期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括谢误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是香可使用这些女件的最新版本。凡是不注甘期的用文件，其最新版本适用于本标推。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本标推。3.1
巢式 PCRnested polymerase chaln reaction利用两套PCR引物(巢式PCR引物对)进行两轮PCR扩增反应，在第一轮扩增中,外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下,作为DNA模板：进行第二轮扩增。3.2
SRY基因
SRYgene
哺乳动物Y染色体上决定雄性性别的基因。3.3
aHBBgene
HBB基因
β珠蛋白基因,位于常染色体上。A原理
利用巢式PCR反应的敏感性高和特异性强的特性，对少量胚胎细胞的SRY基因片段进行扩增，以HBB基因的扩增作为阳性参照，电泳检测PCR扩增产物，根据扩增产物电泳条带鉴定胚胎性别。5引物
5'CTACTCCCCAACCGTCAGAAC 3
5AGCCCAAACCCATCAACCTA 3
5'CCAGGGAACTGCTTGGGTA 3
5'TGCTTCTCCACTTAGGCTCAA3
5'TATCCCACTTACAAGGCAGGTT 3
GB/T25876-2010
5'GCAGACAACAGAGAACAAGAATGA 36试剂和仪器
6.1主要试剂
水应符合GB/T6682中灭菌双蒸水的要求，T2q DNA聚合酶及PCR缓冲液、100 bp梯度DNA标记物。TE缓冲液、TAE缓冲液、加样缓冲液、漠化乙锭等。具体制备方法参见附录A。6.2主要收器
冷冻离心机、梯度PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、pH计、电子天平、恒温水浴锅、双蒸馏水器、微量移液器。
7检测方法
7.1试样的割备与保存
从待检胚胎中分离 4 个(或 4 个以上)细胞,用无菌超纯水冲洗 3 次后,放入 D. 5 mL PCR 管中,加入10μL无菌超纯水,100C煮沸10 min～15min,立即置于碎冰中,冷却后4C离心(8228 g)5min,取上清疲保存于4冰箱中备用。
7. 2SRY 基因片段 PCR 扩增
第一次扩增体系为20μL：0.8mmol/L的dNTP、2U的TaqDNA案合,0.2μmol/L的SRY基因外引物SRY1和内参照引物HBB，10×PCR缓冲液，2.5mtmaI/L的氛化，加适蛋效水反应程序为95预变性5min.94℃变性30$.60℃退火30s72延伸30s.20个错环结束后，72亡再延伸10min,4℃保温2min~10min
取第一次PCR扩增产物8μL，作为第二次扩增模板，同时妞人10×PCR缇冲液、2.5mmol/L的氯化镁,0. 8 mmal/L 的 dNTP 1,6 μL2U 的 Tag DNA 聚合酶,0. 2 μmol/L 的 SRY 基因内引物SRY2和内参照引物HBB,适量的双蒸水至 20 μLt反应程序为95C预变性5min,94变性30s,60它退火30s,72C延伸30s，34个循环后，72℃再廷伸10min，4它保温2min~10min。7.3结巢判定
取 5 μL PCR 扩增产物,1. 0%~1. 5%琼脂糖凝胶电泳(3 V/cm~～5 V/cm,电泳 20 min～30 min) ,汉化乙锭染色，凝胶成像系统检查，电泳图谱见附录B中的图B,1。电泳图谱中出现558bp(HBB扩增产物）和219bp(SRY扩增产物)条带，判定为雄性胚胎；电泳图谱中且出现558bp条带，判定为雌性胚胎。2
TYKAONYKACA
TE 缓冲液
10×PCR塑冲液
球脂糖电泳缓冲液
加样羲冲液
溴化乙链
谢录A
（斑料性附录）
试剂和材料
表 A. 1 试剂和材料
10 mtmol/L Tria-HCl(pH 8. 0),1 mmol/L EDTA(pH 8. 0)GB/T 25876--2010
200 mmol/L Tis-HCl(pH 8. 4),200 tmtml/L 氧氯化钾,100 mrmol/L 硫酸铵+15 mmol/L 戴化镁242. 28 g Tris碱,57. 1 mI.冰乙酸,110 mL 0. 5 tno1/L EDTA(pH 8, 0).加双热水定容至1000mL使用时50倍帮释
0.25%漠酚蓝（质量浓），40%蔗糖（质量依度）。100 mL双蒸水中其人0,1多误化乙疑，稳拌使完全溶解，转人棕色试剂瓶，解箱包裹、备用GB/T25876—2010
附录B
（规范性附录）
SRY基因和内参基因巢式PCR产物电泳图谱与结果判断示意图M
M为1cobp梯度DNA标记物，
脉道1--4均为雌性胚胎样本，检出558bp条带；4
泳道5~8均为雄性压胎样本，检出558bp和219bp两个条带图B.1SRY基因和内参基因巢式PCR产物电泳图谱与结果判读示意图YKAoNYKAea
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