GB/T 25877-2010
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GB/T 25877-2010 淀粉胶电泳同工酶分析
GB/T25877-2010
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标准内容
ICS65.150
中华人民共和国国家标准
GB/T 25877—2010
淀粉胶电泳同工酶分析
Starch gel electrophoresis isozyme analysis2011-01-10 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2011-06-01实施
本标准的附录 A,附录 B、附录 C、附录 D 和附录 E均为规范性附录。本标推由中华人民共和国农业部出。本标准由全国水产标准化技术委员会归口本标准起单位：中国海洋大学、黄海水产研究所。本标准主萎起草人！高天期、张智、韩志强、肖永效、张。TYKAoNYKAa
GB/T25877—2010
1范围
淀粉胶电泳同工酶分析
GB/T 25877—2010
本标准规定了淀粉胶电泳同工酶分析的试剂和材料，仪器、抽样.分析步骤及结果判定。本标准适用于常见淡、海水水生生物的水平既胶电泳常见的同工酶分析。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修改版均不适旧于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T18654.12008养殖鱼类种质检验第1部分：检验规则GB/T18654.2-2008养殖鱼类种质检验第2部分,抽样方法3原理
利用同工酶所带电荷的不尚与分子大小的不同，在电场作用下，凝胶中出现的同工酶迁移率不同，经催化、染色，扫插，获得各简工酶谱带，数目及吸收强度等，经比较分析，判定鱼类的遗传特性。4试剂和材料
除另有说明外，所有试剂均为分析纯或以上级别，水为蒸馏水或去离了水或相当纯度的水。4.1水解马铃薯淀粉。
4.2柠檬酸。
4.3乳酸。
4. 4 乙二胺四乙酸。
乙二胺四乙酸二钠。
4.6苹果酸。
乳酸锂。
4. B磷酸氨氢二钠。
4. 9 磷酸二氨钠。
辅醇I。
辅酵亚。
崂嗪甲酯硫酸盐。
氯化硝基四氮唑蓝。
异柠檬酸三钠。
6-磷酸葡萄糖酸钠。
乙醇。
丙酮。
素乙酸。
α瓣酸甘油。
6-磷酸葡萄糖。
山梨糖醇。
GB/T 25877—2010
固蓝RR盐。
4.23冰乙酸。
4.24盐酸。
4.25氢氧化钠。此内容来自标准下载网
4.26肝素。
4.27氯化镁。
4.283-氨甲基-吗啡嘛。
TC-7.0制胶缓冲液：配制方法见附录A。4.29
\TC-8.0 制胶缓冲液:配制方法见附录 A。CAPM-6.0制胶缓冲滋：配制方法见附录A，4.31
CAPM-7.0制胶缓冲液;配制方法见附录A，4.33
TC-7.心电漆缓冲滤，配制方法见附录B。4.34
TC-8.0电冰势冲液：配制方洗见蔚录B4.35
CAPM-6.0电泳缓冲液:配制方替见附录B。CAPM-7.0电泳缓冲液：配制方法见附录B。淀粉凝胶:配制方法见附录亡。
染色缓冲液：配制方法见附录D。染色液：几种常见同工酶染色液配制方法见附录E。4.39
5仪器
5.1 微量匀浆机。
5. 2高速冷冻离心机(转速 12 000 1/ min)。5. 3 多用电泳仪。
5.4真空抽气机（泵）。
5.5电炉或微波炉。
5.6制胶器。
5. 7 多层滤纸。
5.8激光扫描仪。
5. 9 pH 计,精度为 0. 01。
5.10制胶模具。
5.11染色盒。
24 记冷藏冰箱。
低温冰箱：冰室温度在一20℃以下。5. 14
恒温培养箱。
分析天平：精度为0.0001g。
6电子天平：特度为0.1g。
摄影装置：数码照相机。
6抽样
6. 1 样品的抽样
按GB/T18654.2—2008的规定执行。6.2取样
取样品组织 1 g～2 g 试样,于低温冰箱中(一25 ℃以下)保存:对于血液试样,加肝素抗髋,于 4 ℃2
TYKAONYKAC
冰箱中保存,备用。
7分析步骤
了.1分析样品的制备
GB/T25877—2010
电泳前取0.3g左右样品放人1.5mL离心管，加人等体积的蒸馏水或提取液后置于冰浴中研磨，研磨混合减置于冷冻离心机中，在4℃，12Q00r/min的条件下离心直至上清液澄清，取上滑液冷冻保存备电泳用，
对于血液试样，待分离出血清后上样。7. 2凝胶制备
凝胶制备见附录 C。
7.3电泳步票
用手术刀在避胶距离边缘三分之一（约2.5cm)妊切开，用适当大小的滤纸片蘸取7.1制备的样品提取液（或直接用适当大小的滤纸片取冷冻肌肉肉汁）插入切口中。上样完毕后，向电泳槽内加人电泳缓冲液，用滤纸搭盐桥，在 4t条件下以恒定电流（40 mA)进行电泳，电泳时间依酶的种类而不同。7.4染色、固定
电泳结束后，用割胶弓将凝胶水平切割为1.3mm厚的薄片，置于染色盒中，将配制好的染色液倒人染色盒后置于37℃的恒温箱中进行染色。待显色充分后，用7%的冰乙酸溶液然止反应。各种酶的染色液配制方法见附录D和附录E。7.5剃干胶片
取染色后的避胶放于大小合适的玻璃纸上，压制封膜，风干后综号保存。7. 6摄影、扫描
用照相近视镜头对凝胶及其谱带照相，或用激光扫描仪对风于片电泳谱带进行扫描。7.7结果分析
7.7.1酶位点与等位基因分析
根据酶的结构组成和间工酶在组织中所表现的酶谱特征，确定每种同工酵的编码基因位点、多态位点的等位基因频率。
7.7.2群体遗传特异性
多态位点比例(P)、平均杂合度观察值（H。）、平均杂合度期望值（H,)分别按式(1)、式(2)和式（3）计算；
P -Ni/n× 100%
式中：
多态位点比例：
多态位点数；
检测位点总数。
式中t
平均杂合度观察值！
第个位点上第个等位基因的纯合基因型的频率，q
第1个位点上的等位基因总数；
n·检测位点总数。
GB/T 25877—2010
式中：
平均杂合度期望值；
第i个位点上第；个等位基因的纯合基因型的频率；-第主个位点上的等位基因总数；检测位点总数。
8结果判定
8.1个体测定结果的判定
按GB/T18654，1-2008中6.1的规定执行。-(3)
将所有测定结果逐一与标准对照，凡符合或接近标准规定的，判定为合格；凡不符合标准，或与标准规定有显著差异的，判定为不合格。8.2样品群体的判定
根据8、1的判定结果，计算出被检样品合格品的百分比，用百分数表示。4
YKAONYKACa
A, 1TC-7.0制胶缓种滋
附录A
（规范性附录）
制胶缓冲液的配制
GB/T25877-2010
三羟甲基氨基甲烷1.09名·用蒸馏水溶解并用柠檬酸调至pH7.0，蒸馏水定容至1L。2TC-8. 0制胶缓冲液
三羟甲基氨基甲烷1.21B·用蒸馏水溶解并用柠檬酸谢至pH8.0,蒸馏水定容至1L。3CAPM-6.0制胶缓冲液
柠檬酸0.42，用蒸馅水溶解并用3-氨甲基-吗啡啉调至PH6.2,蒸水定容至11..A.4CAPM-7.0胶缓冲液
柠檬酸0,42g，用蒸馏水溶解并用3-氮甲基-吗啡琳调至PH7.0，蒸馏水定穿至1L。GB/T 258772010
TC-7.0电泳缓种液
附录B
（规范性附录）
电泳缓冲液配制
三羟甲基氨基甲烷16. 35 g,用蒸馏水溶解并用柠檬酸谢至 pH7. 0,蒸馏水定容至 1 L。TC-8,0电泳缠冲液
三羟甲基氨基甲烧20g用蒸密水溶解并用柠橡酸调至PH8.0,蒸馏水定容至1L。CAPM-6.0电泳缓冲液
柠檬酸8.4g用蒸馏水溶解并用3-氨甲基-吗啡调至pH6,2,蒸馏水定容至1L。fCAPM-7.0电泳缓冲液
酸8.4g+用蒸馏水溶解并用3-氨甲基-吗嘛调至pH7.0,蒸馏水定容至1L。6
TYKAONYKAa
（规范性附录）
淀粉凝胶的配制
GB/T25877—2010
加淀粉30名和制胶缓冲液254mL，在维形烧瓶内混匀，加水定容至1L，加热至沸腾完全溶解，抽气后注人制胶模具（见图C.1）中，冷却后，保鲜膜密封保存备用。图C.1制胶模具示意图
GB/T 25877—2010
D. 10, 2 mol/L Tris-HClpH8. 0附录D
（规范性附录）
染色缓冲液配刺
三羟甲基氨基甲烷24.22名，用蒸馏水溶解并用盐酸调至pH8.0，蒸馏水稀释至1LD. 20. 2 mal/L Tris-HClpH8. 5三羟甲基氮基甲烷24.22g，用蒸馏水溶解并用盐酸调至pH8.5，蒸馏水稀释至1LD.30.2 mol/L Tris-HCl,pH9.5
三羟甲基氨基甲烷24.22g.用蒸馏水解并用盐酸调至pH9.5，蒸馏水稀释至1L。D, 40. 1 mol/L磷酸缓冲液,pH7. 0磷酸氢二钠17.91g和磷酸二氢钠8.05g，蒸馏水溶解定容至1L。TYKAONYKAa
附录E
（规范性附录）
常见同工酶的染色液配制方法
常见同工酶的染色滤配制方法见表 E. 1。表 E.1常见同工酶的染色液
同工酶
乙醇脱
甘油醛-3-
磷酸脱
苹果酸脱
乳酸脱
异柠檬酸
脱氢脾
超氧化物
歧化腰
磷酸葡萄
糖变位酶
英文名和缩写
lcohol dchydrocna5e;
glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase:
malale dehydrogenate:
lactate dehydrogenase;
isocitrate dehydrogenase;
superoxide dismutase
phosphoglucomutase,
乙酶（99%）
Tris-HCl
NAD基本保存容液
PMS基本保存游液
甘油磷酸
Tris-HCl
NAD 基本保存溶被
PMS 基本保存溶液
苹果酸
Tris-HCl
NAD基本保存溶液
PMS 基本保存落被
乳酸鯉
Tris-HCL
NAD 基本保存容液
PMS基本保存溶液
异酸三钠
Tris-HCt
NADP 基本保存溶液
激化姨
PMS 基本保存溶液
氧化硝基四氨唑蓝
乙二胺四乙醇二盐
Tris-HCI
PMS 基本保存溶液
6-磷酸葡萄糖酸销
Teis-HCl
氯化美
0. 2 rnol/L,pH8. 3
0, 25%
0. 2 mol/L+pH8. 5
0. 2 mol/L,pH9, 5
0. 2 mol/L,pH8. 5
0. 2 mol/L,pH8. 0
1mol/L
0.2 mol/L.pH9. 5
0. 2 mol/L+pH8. 0
1 mol/L
GB/T 25877—2010
1 mL-2 mL
25 ing
100 tng
GB/T 25877—2010
磷酸葡萄
精变位醛
苹果酸酶
山梨醇
脱氢酶
6-磷散
葡葡糖
脱氢酶
英文名和写
phusphogluconutage;
esterase+
malicenzyme:
sarbitol dehydrogenase:
glucose-6-phosphate
dehydrogenase;
表E. 1 (续)
NADP 基本保存容液
葡萄糖-6-磷改脱氨酶
PMS 基本保存溶液
固牛RR盐
磷酸螺神冲液
蔡乙酸
苹果酸
Tris-HCI
氧化镁
NADP 基本保存溶液
PMS基本保存溶液
山梨糖醇
Tris-HC1
NAD 基本保存溶液
PMS 基本保存溶液
葡药糖-6-磷酸
Tris-HCl
戴化铁
0.1 mol/L,pH7. 0
0. 2 mol/L,pH8, 5
1 mol/L
0.2 mo1/L,pH8.0
0. 2 mol/L,pH8. 0
1 mal/L
PMS 基本保存溶液
TTYKAONYKAa
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中华人民共和国国家标准
GB/T 25877—2010
淀粉胶电泳同工酶分析
Starch gel electrophoresis isozyme analysis2011-01-10 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2011-06-01实施
本标准的附录 A,附录 B、附录 C、附录 D 和附录 E均为规范性附录。本标推由中华人民共和国农业部出。本标准由全国水产标准化技术委员会归口本标准起单位：中国海洋大学、黄海水产研究所。本标准主萎起草人！高天期、张智、韩志强、肖永效、张。TYKAoNYKAa
GB/T25877—2010
1范围
淀粉胶电泳同工酶分析
GB/T 25877—2010
本标准规定了淀粉胶电泳同工酶分析的试剂和材料，仪器、抽样.分析步骤及结果判定。本标准适用于常见淡、海水水生生物的水平既胶电泳常见的同工酶分析。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修改版均不适旧于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T18654.12008养殖鱼类种质检验第1部分：检验规则GB/T18654.2-2008养殖鱼类种质检验第2部分,抽样方法3原理
利用同工酶所带电荷的不尚与分子大小的不同，在电场作用下，凝胶中出现的同工酶迁移率不同，经催化、染色，扫插，获得各简工酶谱带，数目及吸收强度等，经比较分析，判定鱼类的遗传特性。4试剂和材料
除另有说明外，所有试剂均为分析纯或以上级别，水为蒸馏水或去离了水或相当纯度的水。4.1水解马铃薯淀粉。
4.2柠檬酸。
4.3乳酸。
4. 4 乙二胺四乙酸。
乙二胺四乙酸二钠。
4.6苹果酸。
乳酸锂。
4. B磷酸氨氢二钠。
4. 9 磷酸二氨钠。
辅醇I。
辅酵亚。
崂嗪甲酯硫酸盐。
氯化硝基四氮唑蓝。
异柠檬酸三钠。
6-磷酸葡萄糖酸钠。
乙醇。
丙酮。
素乙酸。
α瓣酸甘油。
6-磷酸葡萄糖。
山梨糖醇。
GB/T 25877—2010
固蓝RR盐。
4.23冰乙酸。
4.24盐酸。
4.25氢氧化钠。此内容来自标准下载网
4.26肝素。
4.27氯化镁。
4.283-氨甲基-吗啡嘛。
TC-7.0制胶缓冲液：配制方法见附录A。4.29
\TC-8.0 制胶缓冲液:配制方法见附录 A。CAPM-6.0制胶缓冲滋：配制方法见附录A，4.31
CAPM-7.0制胶缓冲液;配制方法见附录A，4.33
TC-7.心电漆缓冲滤，配制方法见附录B。4.34
TC-8.0电冰势冲液：配制方洗见蔚录B4.35
CAPM-6.0电泳缓冲液:配制方替见附录B。CAPM-7.0电泳缓冲液：配制方法见附录B。淀粉凝胶:配制方法见附录亡。
染色缓冲液：配制方法见附录D。染色液：几种常见同工酶染色液配制方法见附录E。4.39
5仪器
5.1 微量匀浆机。
5. 2高速冷冻离心机(转速 12 000 1/ min)。5. 3 多用电泳仪。
5.4真空抽气机（泵）。
5.5电炉或微波炉。
5.6制胶器。
5. 7 多层滤纸。
5.8激光扫描仪。
5. 9 pH 计,精度为 0. 01。
5.10制胶模具。
5.11染色盒。
24 记冷藏冰箱。
低温冰箱：冰室温度在一20℃以下。5. 14
恒温培养箱。
分析天平：精度为0.0001g。
6电子天平：特度为0.1g。
摄影装置：数码照相机。
6抽样
6. 1 样品的抽样
按GB/T18654.2—2008的规定执行。6.2取样
取样品组织 1 g～2 g 试样,于低温冰箱中(一25 ℃以下)保存:对于血液试样,加肝素抗髋,于 4 ℃2
TYKAONYKAC
冰箱中保存,备用。
7分析步骤
了.1分析样品的制备
GB/T25877—2010
电泳前取0.3g左右样品放人1.5mL离心管，加人等体积的蒸馏水或提取液后置于冰浴中研磨，研磨混合减置于冷冻离心机中，在4℃，12Q00r/min的条件下离心直至上清液澄清，取上滑液冷冻保存备电泳用，
对于血液试样，待分离出血清后上样。7. 2凝胶制备
凝胶制备见附录 C。
7.3电泳步票
用手术刀在避胶距离边缘三分之一（约2.5cm)妊切开，用适当大小的滤纸片蘸取7.1制备的样品提取液（或直接用适当大小的滤纸片取冷冻肌肉肉汁）插入切口中。上样完毕后，向电泳槽内加人电泳缓冲液，用滤纸搭盐桥，在 4t条件下以恒定电流（40 mA)进行电泳，电泳时间依酶的种类而不同。7.4染色、固定
电泳结束后，用割胶弓将凝胶水平切割为1.3mm厚的薄片，置于染色盒中，将配制好的染色液倒人染色盒后置于37℃的恒温箱中进行染色。待显色充分后，用7%的冰乙酸溶液然止反应。各种酶的染色液配制方法见附录D和附录E。7.5剃干胶片
取染色后的避胶放于大小合适的玻璃纸上，压制封膜，风干后综号保存。7. 6摄影、扫描
用照相近视镜头对凝胶及其谱带照相，或用激光扫描仪对风于片电泳谱带进行扫描。7.7结果分析
7.7.1酶位点与等位基因分析
根据酶的结构组成和间工酶在组织中所表现的酶谱特征，确定每种同工酵的编码基因位点、多态位点的等位基因频率。
7.7.2群体遗传特异性
多态位点比例(P)、平均杂合度观察值（H。）、平均杂合度期望值（H,)分别按式(1)、式(2)和式（3）计算；
P -Ni/n× 100%
式中：
多态位点比例：
多态位点数；
检测位点总数。
式中t
平均杂合度观察值！
第个位点上第个等位基因的纯合基因型的频率，q
第1个位点上的等位基因总数；
n·检测位点总数。
GB/T 25877—2010
式中：
平均杂合度期望值；
第i个位点上第；个等位基因的纯合基因型的频率；-第主个位点上的等位基因总数；检测位点总数。
8结果判定
8.1个体测定结果的判定
按GB/T18654，1-2008中6.1的规定执行。-(3)
将所有测定结果逐一与标准对照，凡符合或接近标准规定的，判定为合格；凡不符合标准，或与标准规定有显著差异的，判定为不合格。8.2样品群体的判定
根据8、1的判定结果，计算出被检样品合格品的百分比，用百分数表示。4
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A, 1TC-7.0制胶缓种滋
附录A
（规范性附录）
制胶缓冲液的配制
GB/T25877-2010
三羟甲基氨基甲烷1.09名·用蒸馏水溶解并用柠檬酸调至pH7.0，蒸馏水定容至1L。2TC-8. 0制胶缓冲液
三羟甲基氨基甲烷1.21B·用蒸馏水溶解并用柠檬酸谢至pH8.0,蒸馏水定容至1L。3CAPM-6.0制胶缓冲液
柠檬酸0.42，用蒸馅水溶解并用3-氨甲基-吗啡啉调至PH6.2,蒸水定容至11..A.4CAPM-7.0胶缓冲液
柠檬酸0,42g，用蒸馏水溶解并用3-氮甲基-吗啡琳调至PH7.0，蒸馏水定穿至1L。GB/T 258772010
TC-7.0电泳缓种液
附录B
（规范性附录）
电泳缓冲液配制
三羟甲基氨基甲烷16. 35 g,用蒸馏水溶解并用柠檬酸谢至 pH7. 0,蒸馏水定容至 1 L。TC-8,0电泳缠冲液
三羟甲基氨基甲烧20g用蒸密水溶解并用柠橡酸调至PH8.0,蒸馏水定容至1L。CAPM-6.0电泳缓冲液
柠檬酸8.4g用蒸馏水溶解并用3-氨甲基-吗啡调至pH6,2,蒸馏水定容至1L。fCAPM-7.0电泳缓冲液
酸8.4g+用蒸馏水溶解并用3-氨甲基-吗嘛调至pH7.0,蒸馏水定容至1L。6
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（规范性附录）
淀粉凝胶的配制
GB/T25877—2010
加淀粉30名和制胶缓冲液254mL，在维形烧瓶内混匀，加水定容至1L，加热至沸腾完全溶解，抽气后注人制胶模具（见图C.1）中，冷却后，保鲜膜密封保存备用。图C.1制胶模具示意图
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D. 10, 2 mol/L Tris-HClpH8. 0附录D
（规范性附录）
染色缓冲液配刺
三羟甲基氨基甲烷24.22名，用蒸馏水溶解并用盐酸调至pH8.0，蒸馏水稀释至1LD. 20. 2 mal/L Tris-HClpH8. 5三羟甲基氮基甲烷24.22g，用蒸馏水溶解并用盐酸调至pH8.5，蒸馏水稀释至1LD.30.2 mol/L Tris-HCl,pH9.5
三羟甲基氨基甲烷24.22g.用蒸馏水解并用盐酸调至pH9.5，蒸馏水稀释至1L。D, 40. 1 mol/L磷酸缓冲液,pH7. 0磷酸氢二钠17.91g和磷酸二氢钠8.05g，蒸馏水溶解定容至1L。TYKAONYKAa
附录E
（规范性附录）
常见同工酶的染色液配制方法
常见同工酶的染色滤配制方法见表 E. 1。表 E.1常见同工酶的染色液
同工酶
乙醇脱
甘油醛-3-
磷酸脱
苹果酸脱
乳酸脱
异柠檬酸
脱氢脾
超氧化物
歧化腰
磷酸葡萄
糖变位酶
英文名和缩写
lcohol dchydrocna5e;
glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase:
malale dehydrogenate:
lactate dehydrogenase;
isocitrate dehydrogenase;
superoxide dismutase
phosphoglucomutase,
乙酶（99%）
Tris-HCl
NAD基本保存容液
PMS基本保存游液
甘油磷酸
Tris-HCl
NAD 基本保存溶被
PMS 基本保存溶液
苹果酸
Tris-HCl
NAD基本保存溶液
PMS 基本保存落被
乳酸鯉
Tris-HCL
NAD 基本保存容液
PMS基本保存溶液
异酸三钠
Tris-HCt
NADP 基本保存溶液
激化姨
PMS 基本保存溶液
氧化硝基四氨唑蓝
乙二胺四乙醇二盐
Tris-HCI
PMS 基本保存溶液
6-磷酸葡萄糖酸销
Teis-HCl
氯化美
0. 2 rnol/L,pH8. 3
0, 25%
0. 2 mol/L+pH8. 5
0. 2 mol/L,pH9, 5
0. 2 mol/L,pH8. 5
0. 2 mol/L,pH8. 0
1mol/L
0.2 mol/L.pH9. 5
0. 2 mol/L+pH8. 0
1 mol/L
GB/T 25877—2010
1 mL-2 mL
25 ing
100 tng
GB/T 25877—2010
磷酸葡萄
精变位醛
苹果酸酶
山梨醇
脱氢酶
6-磷散
葡葡糖
脱氢酶
英文名和写
phusphogluconutage;
esterase+
malicenzyme:
sarbitol dehydrogenase:
glucose-6-phosphate
dehydrogenase;
表E. 1 (续)
NADP 基本保存容液
葡萄糖-6-磷改脱氨酶
PMS 基本保存溶液
固牛RR盐
磷酸螺神冲液
蔡乙酸
苹果酸
Tris-HCI
氧化镁
NADP 基本保存溶液
PMS基本保存溶液
山梨糖醇
Tris-HC1
NAD 基本保存溶液
PMS 基本保存溶液
葡药糖-6-磷酸
Tris-HCl
戴化铁
0.1 mol/L,pH7. 0
0. 2 mol/L,pH8, 5
1 mol/L
0.2 mo1/L,pH8.0
0. 2 mol/L,pH8. 0
1 mal/L
PMS 基本保存溶液
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