GB/T 27817-2011 化学品 免疫毒性试验方法 GB/T27817-2011 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net
本标准规定了化学品免疫毒性试验方法的术语和定义、试验原则、试验方法和试验报告。 本标准适用于检测化学品的免疫毒性。
class="f14" style="padding-top:10px; padding-left:12px; padding-bottom:10px;"> 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。
本标准与美国环境保护局(USEPA)预防、农药及有毒物质预防办公室发布的生物化学品试验指南
OPPTS880.3550(1996)免疫毒性(EPABiochemicalsTestGuidelinesOPPTS880.3550:1996,Immunotoxicity)(英文版)技术性内容一致。
本标准作了下列结构和编辑性修改:
———将原文中的下列内容作为本标准的“引言”内容:“前言”;(a)标题下(1)“适用性”和(2)“背景”;(b)标题下的(1)“产品登记对免疫毒性试验的要求”、(2)“目的”和(5)“受试物”;(f)标题下的内容:“免疫毒性试验的阶段性”;
———增加了范围一章(见第1章)和规范性引用文件一章(见第2章);
———计量单位改成我国法定计量单位。
本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。
本标准起草单位:中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所、中国化工经济技术发展中心、中国检验检疫科学研究院。
本标准主要起草人:侯粉霞、李朝林、林铮、王晓兵、陈会明。
下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本标
准。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。
美国环境保护局(USEPA)生物化学品试验指南OPPTS880.3800(1996)免疫反应(EPABiochemicalsTestGuidelinesOPPTS880.3800:
1996,ImmuneResponse)

ICS13.300;11.100
中华人民共和国国家标准
GB/T27817—2011
化学品
免疫毒性试验方法
Chemicals-Test method of immunotoxicity2011-12-30 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2012-08-01实施
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。GB/T 27817—2011
本标准与美国环境保护局（USEPA）预防、农药及有毒物质预防办公室发布的生物化学品试验指南OPPTS880.3350(1996)免疫毒性(EPABiochemicalsTestGuidelinesOPPTS880.3550:1996,lnml-notoxieity)（英文版）技术性内容一致。本标准作了下列结构和编辑性整改：将原文中的下列内容作为本标准的\引音\内容，“前言”，（a）标题下（1）“适用性\和（2)“背录\，（h）标题下的（1)“产品登记对免疫薄性试验的要求”，（2)“目的\和（5）“受试物”；（f)标题下的内容“免疫毒性试验的阶段性”；一增加了范围-章（见第1章）和规范性引用文件一章（见第2章），：计量单位改成我国法定计量单位。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口，本标准起草单位：中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所、中国化工经济技术发展中心、中国检验检疫科学研究院。
本标准亡要起掌人+侯粉醛.李朗林、林铮.王晓兵陈会明。1
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GB/T 27817—2011
本标准参考了USEPAOPPTS880.3550：1996免疫寿性试验（英文版），技术内容与试验指南OPPTS880.3550(1996)免疫毒性相一致该试验指南是美国环境保护局受试物：应测定受试物中每一种有效成分的技术等级，免疫毒性试验的阶段性：如果第一·阶段的任何一项免疫毒性试验证明受试物具有免疫毒性，则应开展第二阶段的免疫毒性试验（0PPTS880.3800)。如果第一阶段免疫筹性试验的结果不能被明确解释或有资料证明受试物或其结构类似物其有免疫葬性时，也许也应进行第二阶段免疫囊性试验。如果第一阶殷试验明确证明受试物没有免疫毒性，或没有相关资料可以证明受试物或其结构类似物具有免疫毒性时，不需要进行第二阶段试验，TTTKAONYKACA
1范围
化学品免疫毒性试验方法
GB/T27817—2D11
本标准规定了化学品免疫性试验方法的术语和定义、试验原则、试验方法和试验报告。本标雄造用于检满化学品的免疫毒性。2规范性引用文件bzxZ.net
下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。美国环境保护晟(USEPA)生物化学品试验指南OPPTS880.3800(1996)免疫反应(EPABiochemicalsTestGuidelines(PPTS880.3B00.1996,ImmuneResponse）3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
免疫毒性immunotoxicity
受试物诱导免疫系统发生功能紊乱或不合适的抑制性或刺激性反应的能力。4试验原则
本标准中的免疫毒性试验，可以评价受试物是否改变或损伤免疫系统的机能状态。评价指标包括：免疫织，免疫器管的重其细跑结构临保点独生化分析血减学检查体减免疫功细胞免装功熊。不同组的动物染毒不同剂量的受试物至少30d，每天对动物进行观察，记录所出现的任何临床毒性表现。染获结束后，处死动物，对上述的评价指标进行检测或分所；其中有些试验中需要用抗原将动物致敏。
5试验方法
5.1实验动物
5.1.1种属和品系
首选小鼠或大鼠，并使用常用的动物品系，如果使用他种厨的动物则成说明理由。所有动物应无寄生虫和病原菌。雌性动物应未产、未挚。5.1.2年龄
应使用健康的动物。在试验开始时，单只动物的体重不应超过平均体重的士20%。于6周龄～8周龄时开始染毒。
5. 1. 3 性别
使用单一性别的动物。如果已知受试物对其中一种性别的动物更敏感，则应使用这种性别的动物。TTTKANTKACA
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5.1.4数虽
对照组及各剂量组的每个观察指标测定时至少应包含10只动物。5.2对照组
应设立剂对照组，而且猝剂对照组中还应另外包含一些动物，用于评价免疫毒性的可恢复性，持续性以及退发性时作为对照[见OPPTS880.3800(d)(1)。溶剂案性未知时，应设立一个不作任何染毒的对照组。为了说明方法的敏感性，应使用已知的免疫抑制剂（如，环磷酰胺）设立阳性对照组，每个观察指标至少需要5只动物。
5.3附加组
高剂量组应设立附加组，至少包含20只动物以高剂量组的剂量染毒30d，染毒结束后继续观察-段时间（3Ud)，以评价免疫毒性作用是否可以恢复、是否持续存在、是否具有迟发性等情说[见PPTS880, 3800(d)(1) 1.
5.4剂量水平
对于亚慢性毒性试验，常常期望得到受试物剂量-反应关系和无免疫毒性作用的剂量水平，因此，至少应设3个剂量和1个阴性对照组。高剂量应不使动物产生明显的应激、营养不良或死亡，但最好可使动物产生一些可测尽的--般中毒表现，
低剂最最好不使动物产生任免疫毒性作用。5.5染毒
受试物或溶剂经口和/或经皮和/或经吸人染毒至少30（一般经口染毒），其体的染毒途径应与90d亚慢性毒性试验的染毒途径相一致。5.6规察期限
观赛期限至少为30d。
附加组动物在停止染毒受试物后至少再观察30d，以观察免疫毒性作用是否恢复、是否持续存在、是否具有选发性。
5.7动物的观寒
每天对动物至少进行一次细致的临床观察，记录中牵症状的出现时间、严重程度及其持续时间。观察应包括如下方面但并不仅限于此：—皮、毛；
眼.黏膜；
—呼吸系统；
自主性和中枢神经系统：
循环系统；
—肢体运动功能；
一行为特征：
抗感染能力等。
每周测盘一次动物的摄食量和饮水量。动物染毒前称体重，之后每周1次，处死前再次称体重。任何频死动物一被发现就应与其他动物分开并被安乐死。对试验过程中的任何预死的或死亡的动物都应进行大体解部。
5.8临床检验
试验结束后，各剂量组和对照组各取10只动物进行临床检验。动物处死前应隔夜禁食。2
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5.8.1血液学检测
可包括下列指标：
—红细胞压积：
血红蛋白浓度：
红细胞计数；
白细胞总数及分类计数
血小板计数。
5.8.2血较生化分析
可包括下列指标：
- 血糖;
一谷丙转氨酶；
—尿素氮;
一白蛋白：
一总蛋白！
蒂要时可进行其他的临床生化分析。5.9大体解韵
所有动物都应进行人体解剖，包括：一测量体重：
：一测量胸腺和脾脏的湿重，取出后应尽快称最以免脏器干燥。5、10组织制备
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各剂量组和对照组各取10只动物，取下列组织器官以及病变器官，用适当的固定液进行周定保存，用于织病理学检套。这些组织器官包括：一胸腺，
—脾脏；
—肝脏，
—一肺脏；
一肾脏；
一骨髓(股骨、胸骨或肋软骨部位的骨髓);一有代表性的琳巴结（黏膜附近的琳巴结或周闺淋色结）—肾上腺；
。一垂体；
一卵巢或睾丸
所有肉眼可见的摘伤。
5. 11检测脾脏、胸腺和骨髓的细胞构及细胞活力。5.12对任何肉眼可见的摄伤进行传统的组织病理学检查5.13如果特异性和非特异性细胞免疫反应受到了影响，则应对上述组织或器官进行组织病理学观紊，5.14免疫毒性试验
5.14.1体赖免疫试验
首先用抗原免疫动物，然后来用抗体形成细胞检测（AntibadyPlaqueForrningCell,简称PFC试验，也称溶血空斑试验）方法或酶联免疫吸附（EnzymeLinkedImmunogorbcntAssay，ELISA)检测抗体滴度的方法评价受试物对体液免疫的影响。5. 14. 1. 1 PFC 试验
杰尼(Jcrne)和诺尔丁（Nordin）的PFC方法经卡尼海姆（Cunningham）和森博格（Szcuberg）修改TTTKONYKAA
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后[1-21,被用于检测亚像性染毒受试物（30d)对脾脏内产生抗体的细胞的毒性作用。试验时，应对如下因索进行考虑：
—-: 于染毒的第 26 天经静脉注射 T细胞依赖性抗原绵羊红细胞(sheep red blood cells,SRBCs);应对各种种屏和品系的动物在注射抗原后测定PFC的最佳时间作出评价。—测定每批补体的活性。
一对上述所引用的PFC方法存在一些静改(如参考文献[22]中特目普(Temple)的方法)221,这些改可能是有用的。但是，引用某种方法时应对方法进行整体引用，对方法所做的任何修改都应了以说明并能证明其合法性和合理性；应说明主要试剂的来源，最好也能说明这些试剂的活性或惑纯度。
一为了验证试验方法的敏感性，应设立经免疫抑制剂(如，环磷酰胺染毒的阳性对照组。一使用双育法进行 PFC计数。
一：测定脾细胞的活性。
5.14.1.2定量测定免疫球蛋白
通过该试验评价受试物是否影响抗体对抗原的反应性。在染毒结束前4d～5d,用适当的胸腺依赖性抗原免疫动物后,经过适当的时间再次用抗原免疫动物,然后测定每只动物血清中 IgG和IgM的滴度。测定抗体滴度的时间点应足够多，以便对染毒组和对照组动物的初级抗体反应和次级抗体反应进行比较。测定抗体时受就物的染毒时间至少为30d。试验时，应对如下因素进行考虑，测定血清中 IgG和 IgM 滴度的方法应足够敏感以便测得每只动物的 IgG和 IgM滴度。ELISA方被认为是一种灵敏、可靠、重复性好的方法：5.14.2特异性细胞免疫反应
为了评价亚慢性染霉受试物（30d>对特异性细胞免疫反应的影响，应采用下列三种方法中的·-种进行试验。
5.14.2.1单向混合淋巴细胞培养法(Onc-wayMixed LymphocyteCulture,MLC)该方摆可以证明亚慢性架藓受试物（对同种异晶系琳细胞刺微引起的游巴细胞增值能力的影响。通过量放射性标记物(一般为 3H-胸腺嘧啶)掺人 DNA 的最来说明淋巴细胞的增殖。试验时，应对如下因素进行考虑；
应答细胞来白对照组和染毒组动物的脾细胞,在无菌条件下制备脾细胞。应答细胞的 DNA合成设有采取阻断处理
刺激细胞来自未经染毒的同种异品系动物的脾细跑，在无菌条件下制备脾细胞。刺细胞的DNA合成用丝裂避素或X线处理进行阻断测定应答细胞和刺激细胞的活力；应设3份或4份对照，用于证明收获细胞的效益、保证刺微细胞的非反应性、测定DNA合成的基础水平；
对空白对期和溶剂对照同时进行通定：用每个培养Ⅲ中择人应答细胞的放射性标记物的量来表示脾细胞的增殖程度，表示为每分钟居里数(curie per mintte,CPM)。要计算静 CPM(n CPM),,应答细胞被刺激细胞刺激后参人的CPM均值减去未经朝激的牌细胞参人CPM的均值。染毒组与对照组差异的百分比表示为：[1-{染毒组αCPM/对照组nCPM]：一一不同的单向混合淋巴细脑培养法中存在许多不尚，应说明所引用的试验方法及详细的试验步骤，说明主要试剂的来源，最好也说明这些试剂的纯度；一为了证明方祛的灵敏性，应设立阻性对照组，用已知的免疫抑制剂进行架毒。5. 14.2.2退发型过敏(Dclaycd-type Hypcrscnsitivity,DTH)反应该方法是一种检测受试物对实验动物诱导性DTH影响的体内方法。一般来说，动物被胸腺依赖4
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性抗原致数，之后用相同的抗原进行微发，激发斥24 h~48 h，比较染毒组和对照组 DTH反应的差异。开展该试验时，应对如下因案进行考虑：一-DTH检测方法有数种，应选用灵嫩度高、可重复性好、并适用于所选用实验动物品系的方法：…-不同的方法中下列参数也可能不同，如，致敏及激发动物所用抗原的性质，免疫性注射的次数没途径，免装邀发的时间同位系的使用等。试验时选用的这些荐数及基他相关的参数质可吗使所选用的实验动物产生足够的DTH反应；测定DTH反应前，应对动物染毒至少30d。5. 14. 2. 3细胞毒性 T淋巴细跑(Cytotoxic T-lytmphocyte,CTL)检测该方法用于证明亚慢性染受试物(30 d)对CTL生成的影响。该试验中使用同种异品系肿瘤抗原对CT工进行诱导（体内或体外诱导），然后，来自染铸组和对照组动物的脾细胞与Cr标记的同种异品系肿瘤细胞共孵育,1 h后,肿瘤细胞所释放的放射性标记物的堡可以说明 T 淋巴细胞溶解肿瘤细胞的能力，试验时，应对如下因素进行考虑.-应设文对照组来避定效应细跑不存在时靶细胞释放的效射性标记物的本底量和效射性标记钩的总的释故量；
一成可以证明试验中所选用的动物可产生CTL5，所选用的试验方法应适合于诱导动物CTL的生成！
一CIL检测有数种不同的方法，引用某一种方法时应做到完全引用，对方法进行修改时应予以说明，合适的情说下应说明主要试剂的来源，活性和/或纯度。5. 14. 3非特异性细胞免疫反应通过测定NK细胞的功能,巨噬细胞数及其噬作用可以评价亚慢性染萃(30 d)受试物对非特异性细胞免疫的影喇。
5.14.3.1NK细胞的活性(naturalkillercell artivity)建议采用瑞纳尔兹（Reynolds)和贺拍门(Herberman)的微量培养法-17l来检测亚慢性染毒(30d)受试物对NK细胞活性的影响。架毒组和未染毒组动物的脾细胞与\Cr标记的YAC-1淋巴痛细胞共培养。靶细胞与效应细胞共培养4h后，靶细胞中释放的放射性标记物的量可用于表示NK细胞杀伤肿瘤细胞的能力。开展该试验时，应对如下因进行考虑：一一应设立孔个对照以说明在没有效应细胞存在时，靶细胞释放放射性标记物的本底垫以及放射性标记物总的释改量：
：一试验使用除YAC-1淋巴瘤细胞之外的靶细胞也许是合适的。在何情况下都应谢定靶细胞的存活力，
也许需要对方法的某些步骤进行修改,但是，引用某种方法时应对方法进行整体引用，对方法所做的任何修改都应予以说助并能证明其合法性和合理性；应说明生要试剂的来源，最好也能说明这些试剂的活性或纯度。
5. 14. 3.2巨噬细胞检测
该试验可以评价亚慢性染毒(30)受试物对巨噬细胞数及其吞噬功能的影响。应对如下方面进行检泌：
-：试验中应计数腰腔细胞的总数及分类计数；一评价在有或没有促进因子（如，?-于扰素或细菌脂多糖）存在的情况下跛腔细胞对颗粒（如，荧光乳液珠)的右噬作用。
…一有数种不同的巨噬细胞检测方法，因此，应对所选用的方法进行措述并说明方法引证的来源；如果对所选用的方法作了一些整政，则应说明修改的合理和合法性。5
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试验报告
除总则规定的一般项目外，鉴定报告还应包括以下内容：统计方法，
动物级别及饲养条件的详细信息实验室免疫毒性试验历史资料的测定值：·减少免疫毒性测定值波动的方法。参考文献
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