GB/T 26612-2011
基本信息
标准号： GB/T 26612-2011
中文名称：纯血马DNA亲子鉴定技术规程
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.rar .pdf
下载大小：192KB
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
GB/T 26612-2011 纯血马DNA亲子鉴定技术规程
GB/T26612-2011
标准压缩包解压密码：www.bzxz.net
标准图片预览
标准内容
ICS 65. 020. 30
中华人民共和国国家标准
GB/T 26612--2011
纯而马DNA亲子鉴定技术规程
Prucedures of Thoroughbred parentage verilicationwith DNA lesling techniques
2011-06-16 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2011-11-01实施
本标准的附求 A,附求B,附求 C,附求 D、附求 E为资料性附录。本标准出中华人氏共和国表业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业太学马研究中心，中国马业协会本标准主要起草人：赵春江、某常信，韩国才、张浩、吴克亮、杜丹、韩文期。TTKONKAcA
GH/T26612—2011
1范围
纯而血马A亲子鉴定技术规程
本标准规定了纯市与DVA亲子定所用的方法、过程，绍果的记录和解读等，本标难适用缩血药的亲了鉴定。2规范性引用文件
GB/T 26612—2011
下列文件中的案款通过水标准的引用而成为本标准的条数。凡是注日期的引用文件，儿其随斥所有的修改单不包括期退的内或修订最均不适用十本标准，然而，鼓励根据本核谁达成协这的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡烂不注日期的引用文件，其最新版牛适用丁本标雅。GA/T383送庭科学[NA实验室检验规范SN/T1119进口劲物源性饲料中牛羊源性成分检测方法PCR方法SN/T1118基因检验实验室技术要求3术语和定文
下列术语和定义适用于本标注
纯血马Ihoroughtarcd
符合国际纯血马登记委员会（Internatiana!StulBookComnittee，1SBC)规定，在ISBC批准的成员国登记委员会资记广的马匹。
微卫星DAA亲子鉴定方法ParentagctestingwithDNAtechnique以微卫翌DNA多态性及孟德尔遗传规律为基础的亲子鉴定方法。4廉理
根据微卫型DNA的侧案序刻设计引韧.对微卫虽LNA位点进行扩增，其中包括国际动物遗传协会(Internazional Fociety of Animal Genctics,ISAG)和[SBC要求的九个微卫星位点。通过凝胶电泳判定个体的基因型。根据孟墓尔遗传规律，比对亲代个牛和子代个体各微卫DNA位点的恭因型是否相符，从而这到亲子签定的目的。5试剂与器材
5. 1 试剂
艺醇（ethanol），分析纯。
异丙醇isopoa)分析纯
氨氧化(NaOH),分析纯。
乙二胺四乙酸二钠（FDTA）,分析纯。飘化销(NaC$，分析纯。
5. 1. 6十二烷甚毓酸钠TTKANYKACA
GB/T 26612—2011
5. 1. 9 氢化钾(KCI),分析纯。5.1.10氛化（MgC），分折纯。
5.1.1130%（质叠分数>丙烯酰胺溶液：将29%内烯酷胺和1%N，N^-亚甲双内烯肢溶十去离水，充分搅拌溶解非过滤去杂质，避光保存。5. 1.12
过磁酸铵，分析纯。
硼酸(boriacid)分折纯。
乙酸,分析纯。
廿泊,分析纯.
研酸钠，分析纯。
硝酸银（AgNO）,分析纯。
甲醛·分析纯
溴化艺锭，分析绰，
Taq DNA 亲合。
漠酚蓝，分析纯。
盐酸（ICI),分析纯。
兰(羟基甲基)氨基中烷Tris B2),分析绝Trs-HCl片TrisBasu和H组成的缓冲液。三磷酸脱氧核苷酸糖合物（dNTIs):等量的三磷酸鸟嘌玲脱氧核苷酸（dGTF)、三磷酸脉隙呤脱氧核骨酸(dATP)、二磷破脑腺密啶脱氧核甘酸（dTTP）磷酸胞嘧啶脱氧核昔较,2CTP)的混合糊。
名囊裂解液:200 mmal/l.Natl。中和液;2uummol/LHCl.lcommal/I.Tris-HCi,FH.5.發冲液！
血较裂解缓次液(3t:ffer A): 10 mmol/L Ts-H(l(n1 7. 5),100 mrno/L EITA, 1r m:nal/LN0.5%（质量分数）S
蛋洗淀缇钟滋（BufferB).200L5mol/LCH:CO0K,500L6nol/LLiC:混匀后便用：NA溶解缓种液(TE):1 rmnl/L Tris-HCi,1 mmnl/L EPTA,H-8. U;电浓解线种液 b × TRE:446 rmol/[. [*is Hase,445 mmnl/. Pnric A.id,13 mmol/1. FJYlA(pH 8.0) :
泳解缓冲被 X×TAE,2 mol/L Tris 碱,l nul/L. 冰Z酸,0 1 mol/L EDTA<μFH 8. 0>:上样缓冲液：30tmma1/1.FI)A，36实（体积分数）丙三醇，0.05%（质堂/体积分数）浪酚蓝f）
10XPCR缓冲液:103 I1Iul/L -is-HCl(pH 8.0),0.5 ul/L KCl,15 mEol/L MgCl2 5. 1. 29
琼脂糖(分析继)。
5. 1.30N,N,N,N'-μ甲基乙—胺(TEMED),球糖胶：琼脂糖加人电球解冲液,加热熔解冷却后制成的胶状物，可用于DNA电泳。5. 1. 31
5.2器材
5. 2. 1 企自动 IIKA分析仪议。5.2. 2离心机离心力10 00g。
5.2.3紫外可见分光光计，
5. 2. 4 移液器,量种 0, 1 μI,~I (00 μI..5.2.5PCR仪,96 孔热褥环。
5.2.6水平电冰槽，长度31cm
TTIKANYKACA
5.2.7乘直电冰槽，长度24cm，
5.2.8慢胶戒像系统。
5.2.9漩涡振荡仪。
5.2.10剪刀。
6DNA 亲子鉴定规程
6.1DNA的提取
GB/T266122011
采取血获或带有毛塞的马百发,从中提取 DNA。其体方法释见附录 A。DNA样品操作注意享项见 SN/T 1119。
6. 2亲于鉴定所用 DNA微卫尽位点亲了鉴定所用 TNA 微卫星位点应包括 LSAG 和 IS1L: 要求的如 卜九个微早位点:AHT1,AHT5.ASB2，HMS3，HMS6：HMSY，HTG4，HTG10，VHL20。在所扩增的位点中还可包括HITGG,HTG7,HMS2 等三个微卫显位点或其他若于个已被正实在纯而马群体中多态性丰常的撤卫星位点，以进一步提高亲子鉴定的准确性。引动序列参无附求B。6. 3 DNA 微卫星位点的扩增
可用荧光物质标记用于扩增「.违12个位点的引物，来用PCR方法扩塔这些微星位点：PCR条栏参除求。PCR乐作中防止污染等往意事项见GA/T383。6.4基因型的检测
使用根据荧光信号探测PCR产物大小的辛自动INA分析仪或聚丙烯胺凝胶电泳后锻染（参见紧录D)等叫检测两个狱基长度差并的方法检测上述12个位点的基因型。在分析中设置对照样本，速染价技术要求呢SN,T1193。
6.5基因型的表示方法
基国型片国际通用的母表示。在所检测的微卫卫位点中，等位基因数为奇数的，片段长度居中的基因型记为“M”妇等位基因数为数，虑中的两个莱因型中片段较小的定义为“M”。其他等位获因对照\M\安升序排例。微卫位点基因型的记录素见附录E。6.6亲美系的判断
根据两亲本及子代个体的基因型判断是否存在烹子关系。基因型的读取和亲子关系的判断白两人分别独立完成，具结果4相印证：6. 7否定个素的重复检测
对丁亲本和子代个体的基因型不符的个案,重新采取DNA样品进行鉴定,两次鉴定结果一致方能确定为不存在亲子关系。
7亲子鉴定结果的记录
7. 1亲、子代基因型相符的个案些定结果的记录对于亲本和于代个休的萃因型相符的个案，记录亲本及于代个体的上述已测定的薇卫望位点的基因型，并记坐“根据述微卫单位点的苹因型检测，不能排除子代个伍与两亲季行在亲子关系”，并出亲子鉴定独责人签字。
7.2亲、子代基因型不相符的个率鉴定结果的记录对于亲本和子代个体的基因型不符的个案，记录亲本及子代个体的F.述已测定的微卫显位点的基齿型,并记录“根据上述微卫显位点的基因型检测,可排除了代个体与两亲本存在衰子关系“,并士亲子监定负武人签字。
TTTKAONYKACA
GR/T 26612—2011
A.1马血液样品DSA的提取
附录A
【资料性附录】
从血液或毛囊中提取DNA
A.1.1从马颈静脉采取血样5mL:用移液器量取100μ1.15%(项量分数)EI)TA抗疑。A.1. 2取50μm滋样品放人1.5m离心管中。A.1.3如人100uLBufferA，充分混合至凝块消失。A. 1. 465 ℃ 温裕 2 h--4 h,
A1.5加入80oLBuerB,额倒混合，然后冰浴10min（或放入--20C冰籍内5min~10min）。A. 1. 6用离心机在室温下以 12 000 r/min离心 15 min。A.1.7吸取！ml.上消液」另一新的1.5ml.离心管中，注意不要吸到下层沉淀物或表层漂浮物.必要时可重复离心大除江淀物：
A,1. 8加人 Eon 异丙醇(isopropanol),题倒混合几次。4, 1, 9 室温 12 000 r/ min 离心 15 m.in。A.1.10弃上消液，然码用7（休积分数）乙醇（ethan2l)清洗两次，室温十爆加入:50μl.TE室温溶解33min.
A.1.11在水实向泳谱内用1.0%（质量分数）琼脂糖胶电泳检测DNA的质量，用紫外可见分光光度，以260/280吸光度检测1NA浓度。A. 1. 12 -20 ℃保荐,
A, ?马毛囊样 DNA 的提取
A,2。1采取马的案毛，应该带有避，10支以上。4.2.2取0.2mL离心管，榜记样品号。A, 2. 3 取 根~10 根带有毛囊的毛样,在根部用剪刀剪划约 安. 5 cm(避免粘在剪力 [.),改人离心，
A.2.4加人60 pL毛套裂解液（此浓度为照毛样品的用量，要毛如2/3越度的毛覆裂解被)于毛摄处，游涡振荡仪上迅速游涡混合3min。A.2.5在PR仪上用如下程序进行一个热循环：75℃1mia,:2min.90℃1min,9710minsA，2.6从热循环仪上取下样品，加人80L巾和波（此浓度为黑毛样品的用盘，栗毛加2/3浓度的中和液），游涡派合$min.
A. 2. 7—20 1保存。
TTTKAONYKACA
附录B
（资料性附录）
用于扩增纯血马亲子鉴定的 12 个微卫星位点的引物用十扩增纯止马亲子监定的12 个微卫星位点的引物如表 B.1所示。表B.1用于扩增纯血马亲于签定的12个微卫星位点的引物位点名称
正间,AACCGCETLAGEAAGGAAGT
反向:GCTGCAGAGAGTTTACCCT
正商，ACGGACACATCTCTGCKTCK
序5'—3\
成：ATCTAGCAGGGTAAGGAGGCICAC正间:CCTTCCTGTAGTTTALAGCITCTG反向:GATCATATGCOXTTATCTCTTTGCGC正向：CCTGAAGCAGAACATOCCTCCTIGF前:ATAAAGTGTCTGGGCAGAGCTGCT正可:CC4AGTCTTTGTEAEA-AACAAGA:CCATCCTCAGTTTTTCACTTT+TT
正,GAAGCTGLEAGTAITEAAUCATTC
反间:GTCCATGTTGTGAAGTGTAACA
正向:CAGGAAACTCATGTTGAALCATCR可:FCTTGFFGAAALATACCIIGACTGTE向:GTATITCAGTCTTGATTGCAGGAC后向:CTCCCTCCCTCCCTCTGTTCTC
正向:AOGGTGGCAACTGCCAAGGAAF
CTTGCAGTCGAATGTGTATTAAATG
正间,CCTGCTTGGAGGCTGTGATAAGAT向:GTTCACTGAATGTCAAATTCI:I
正前:CAATTCCCGCCCCACCCECGGCA友向TTTTTATTCIGATCIGTCAEATTT正间:CAAGTCCTCTTACTTGAAGATAG反用:AACTCAGGGAGAATCTICCCAG
GB/T 26612-2011
GE/T 26612—2Q11
C. 1 PCR 条件
附录C
【资料性附录】
扩增纯血马亲子鉴定的 12个微卫星位点的[CH亲件扩增纯血马亲于签定的12个微卫量位点的PCR条件如表C.1所示。表C.1用于纯血马亲子鉴定的荧光标记引物扩增条件和扩增产物片段大小位点名称
C, 2 PCR 反应体系
标记颜色
开翌大小/bp
151--137
133~117
212~218
115~-128
165--172
159~-173
173--185
123--141
215·~238
97--105
退火湿度
Mg!|瓶度/mmol/L
PCR 反应体系如 下:5 μL:反应体系:10 X FLR 缓冲被 5 μ,dNTPe (5 mmol/L) 1 μL,引暂(50ml/)2TagD>A亲合5U/uL)0.5μ模板DNA1oL(0ng-b0ng）.dH031.3μL，扩增每个位点所得的最生镁离子浓度参见表C.1。反应条件：FCR反应录件随仅器个同略有改变。94预变性1min-~3miz。94变性3，退火309增每个位点所需的最佳退火温度参见衰C.1），72延伸453，0个循坏。72延伸30m切.4 r保存。
检测过程中分别设所性对照、阴性对照和空白对照。用口知可减功扩增的马DV样品作阳性对照;用等体积的重蒸瘤水代替模板INA作空白对照。C.3PCR扩增产物的电承检测
PCR扩增产物电泳检测：取2.56琼脂糖，放入100mL泳缓冲液（将电泳缓冲液50×工AL用去离子水稀释50铲）加热充分熔解后剂胶：在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面没过疑胶，将4μIPCR扩增产物和适量上样绥冲液混合后1.样：9 V/cIm 恒压电泳,溴厨蓝迁移至胶中部停止。将胶放人滨化乙链溶疫（浓度为0.5\g/mL)中染色15min，采用凝胶破像系统观察电泳结果井记录5
附录D
(瓷料性附激）bZxz.net
采用染进行缴卫星INA基因型的分析方法D.112%(质量分数>聚丙端胺凝胶(25mL体积,0.1m胶条)制作及电泳乃,1.1清洗制胶用的皱璃板并用蒸水冲选于净,晾十后上垫涤,用夹了夹好。CB/T 26612-2011
. 1. 2在 100 mL烧杯内加入 30%(质量分数)桑丙两烯酰胺 10 mL:2.5 mL 5U%(体积分数)的廿油电泳解經冲液 5×TBE 5mL，10另(质分数）过硫酸铵 ,175 mnL,IEMEI)&μL,加人蒸馏水7.325mL，混合均句底迅速谜胶：上述为一决胶的量·多快胶时按比例加倍：D,1.3当誉胶至玻璃短1沿0.1心1时停止插人梳于,室温故至其聚合D，1.4凝胶案合好后，向垂直电泳情加人1×TBE,用注射器冲洗如样孔。D, 1. 5 均电球 10 ii,然后上样,电泳。D.2硝酸银染色方法
用去离了水冲洗胶。
用25%（体积分数)的2醇漫范胶2min~~3 min-D. 2. 3
去离于水冲浒2遍。
D.2.4用0.1%（质量分数）AgNt)染色液染色30ma~40min。去离子水冲洗2遍，
5用显色被(段15 g >u0H,;去离子永至500 mlL溶解,加 0, 076 g四酸钠 8:0 μL 甲醛)业D. 2.6
色10 rain-~20 min。
D.2.7用去高子水冲洗多余的显任液。显色的胶用保鲜膜封好，观察利照机。D. 2, 8
G/T 26612--2011
附录E
（资料性附录）
纯血马亲子监定微卫星DNA基因型登记统血马亲子鉴定微卫星DNA基内型登记如表E.1所示。表E.1
纯血马亲子鉴定微卫星DNA基因型登记表位点称
了代基因型
孕马基丙型
公马基因型
于化基西型
马英因塑
公！因型
HVSAHT5HM$6
ASB2HrG10HMS3HMS?
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。
中华人民共和国国家标准
GB/T 26612--2011
纯而马DNA亲子鉴定技术规程
Prucedures of Thoroughbred parentage verilicationwith DNA lesling techniques
2011-06-16 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2011-11-01实施
本标准的附求 A,附求B,附求 C,附求 D、附求 E为资料性附录。本标准出中华人氏共和国表业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业太学马研究中心，中国马业协会本标准主要起草人：赵春江、某常信，韩国才、张浩、吴克亮、杜丹、韩文期。TTKONKAcA
GH/T26612—2011
1范围
纯而血马A亲子鉴定技术规程
本标准规定了纯市与DVA亲子定所用的方法、过程，绍果的记录和解读等，本标难适用缩血药的亲了鉴定。2规范性引用文件
GB/T 26612—2011
下列文件中的案款通过水标准的引用而成为本标准的条数。凡是注日期的引用文件，儿其随斥所有的修改单不包括期退的内或修订最均不适用十本标准，然而，鼓励根据本核谁达成协这的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡烂不注日期的引用文件，其最新版牛适用丁本标雅。GA/T383送庭科学[NA实验室检验规范SN/T1119进口劲物源性饲料中牛羊源性成分检测方法PCR方法SN/T1118基因检验实验室技术要求3术语和定文
下列术语和定义适用于本标注
纯血马Ihoroughtarcd
符合国际纯血马登记委员会（Internatiana!StulBookComnittee，1SBC)规定，在ISBC批准的成员国登记委员会资记广的马匹。
微卫星DAA亲子鉴定方法ParentagctestingwithDNAtechnique以微卫翌DNA多态性及孟德尔遗传规律为基础的亲子鉴定方法。4廉理
根据微卫型DNA的侧案序刻设计引韧.对微卫虽LNA位点进行扩增，其中包括国际动物遗传协会(Internazional Fociety of Animal Genctics,ISAG)和[SBC要求的九个微卫星位点。通过凝胶电泳判定个体的基因型。根据孟墓尔遗传规律，比对亲代个牛和子代个体各微卫DNA位点的恭因型是否相符，从而这到亲子签定的目的。5试剂与器材
5. 1 试剂
艺醇（ethanol），分析纯。
异丙醇isopoa)分析纯
氨氧化(NaOH),分析纯。
乙二胺四乙酸二钠（FDTA）,分析纯。飘化销(NaC$，分析纯。
5. 1. 6十二烷甚毓酸钠
GB/T 26612—2011
5. 1. 9 氢化钾(KCI),分析纯。5.1.10氛化（MgC），分折纯。
5.1.1130%（质叠分数>丙烯酰胺溶液：将29%内烯酷胺和1%N，N^-亚甲双内烯肢溶十去离水，充分搅拌溶解非过滤去杂质，避光保存。5. 1.12
过磁酸铵，分析纯。
硼酸(boriacid)分折纯。
乙酸,分析纯。
廿泊,分析纯.
研酸钠，分析纯。
硝酸银（AgNO）,分析纯。
甲醛·分析纯
溴化艺锭，分析绰，
Taq DNA 亲合。
漠酚蓝，分析纯。
盐酸（ICI),分析纯。
兰(羟基甲基)氨基中烷Tris B2),分析绝Trs-HCl片TrisBasu和H组成的缓冲液。三磷酸脱氧核苷酸糖合物（dNTIs):等量的三磷酸鸟嘌玲脱氧核苷酸（dGTF)、三磷酸脉隙呤脱氧核骨酸(dATP)、二磷破脑腺密啶脱氧核甘酸（dTTP）磷酸胞嘧啶脱氧核昔较,2CTP)的混合糊。
名囊裂解液:200 mmal/l.Natl。中和液;2uummol/LHCl.lcommal/I.Tris-HCi,FH.5.發冲液！
血较裂解缓次液(3t:ffer A): 10 mmol/L Ts-H(l(n1 7. 5),100 mrno/L EITA, 1r m:nal/LN0.5%（质量分数）S
蛋洗淀缇钟滋（BufferB).200L5mol/LCH:CO0K,500L6nol/LLiC:混匀后便用：NA溶解缓种液(TE):1 rmnl/L Tris-HCi,1 mmnl/L EPTA,H-8. U;电浓解线种液 b × TRE:446 rmol/[. [*is Hase,445 mmnl/. Pnric A.id,13 mmol/1. FJYlA(pH 8.0) :
泳解缓冲被 X×TAE,2 mol/L Tris 碱,l nul/L. 冰Z酸,0 1 mol/L EDTA<μFH 8. 0>:上样缓冲液：30tmma1/1.FI)A，36实（体积分数）丙三醇，0.05%（质堂/体积分数）浪酚蓝f）
10XPCR缓冲液:103 I1Iul/L -is-HCl(pH 8.0),0.5 ul/L KCl,15 mEol/L MgCl2 5. 1. 29
琼脂糖(分析继)。
5. 1.30N,N,N,N'-μ甲基乙—胺(TEMED),球糖胶：琼脂糖加人电球解冲液,加热熔解冷却后制成的胶状物，可用于DNA电泳。5. 1. 31
5.2器材
5. 2. 1 企自动 IIKA分析仪议。5.2. 2离心机离心力10 00g。
5.2.3紫外可见分光光计，
5. 2. 4 移液器,量种 0, 1 μI,~I (00 μI..5.2.5PCR仪,96 孔热褥环。
5.2.6水平电冰槽，长度31cm
TTIKANYKACA
5.2.7乘直电冰槽，长度24cm，
5.2.8慢胶戒像系统。
5.2.9漩涡振荡仪。
5.2.10剪刀。
6DNA 亲子鉴定规程
6.1DNA的提取
GB/T266122011
采取血获或带有毛塞的马百发,从中提取 DNA。其体方法释见附录 A。DNA样品操作注意享项见 SN/T 1119。
6. 2亲于鉴定所用 DNA微卫尽位点亲了鉴定所用 TNA 微卫星位点应包括 LSAG 和 IS1L: 要求的如 卜九个微早位点:AHT1,AHT5.ASB2，HMS3，HMS6：HMSY，HTG4，HTG10，VHL20。在所扩增的位点中还可包括HITGG,HTG7,HMS2 等三个微卫显位点或其他若于个已被正实在纯而马群体中多态性丰常的撤卫星位点，以进一步提高亲子鉴定的准确性。引动序列参无附求B。6. 3 DNA 微卫星位点的扩增
可用荧光物质标记用于扩增「.违12个位点的引物，来用PCR方法扩塔这些微星位点：PCR条栏参除求。PCR乐作中防止污染等往意事项见GA/T383。6.4基因型的检测
使用根据荧光信号探测PCR产物大小的辛自动INA分析仪或聚丙烯胺凝胶电泳后锻染（参见紧录D)等叫检测两个狱基长度差并的方法检测上述12个位点的基因型。在分析中设置对照样本，速染价技术要求呢SN,T1193。
6.5基因型的表示方法
基国型片国际通用的母表示。在所检测的微卫卫位点中，等位基因数为奇数的，片段长度居中的基因型记为“M”妇等位基因数为数，虑中的两个莱因型中片段较小的定义为“M”。其他等位获因对照\M\安升序排例。微卫位点基因型的记录素见附录E。6.6亲美系的判断
根据两亲本及子代个体的基因型判断是否存在烹子关系。基因型的读取和亲子关系的判断白两人分别独立完成，具结果4相印证：6. 7否定个素的重复检测
对丁亲本和子代个体的基因型不符的个案,重新采取DNA样品进行鉴定,两次鉴定结果一致方能确定为不存在亲子关系。
7亲子鉴定结果的记录
7. 1亲、子代基因型相符的个案些定结果的记录对于亲本和于代个休的萃因型相符的个案，记录亲本及于代个体的上述已测定的薇卫望位点的基因型，并记坐“根据述微卫单位点的苹因型检测，不能排除子代个伍与两亲季行在亲子关系”，并出亲子鉴定独责人签字。
7.2亲、子代基因型不相符的个率鉴定结果的记录对于亲本和子代个体的基因型不符的个案，记录亲本及子代个体的F.述已测定的微卫显位点的基齿型,并记录“根据上述微卫显位点的基因型检测,可排除了代个体与两亲本存在衰子关系“,并士亲子监定负武人签字。
TTTKAONYKACA
GR/T 26612—2011
A.1马血液样品DSA的提取
附录A
【资料性附录】
从血液或毛囊中提取DNA
A.1.1从马颈静脉采取血样5mL:用移液器量取100μ1.15%(项量分数)EI)TA抗疑。A.1. 2取50μm滋样品放人1.5m离心管中。A.1.3如人100uLBufferA，充分混合至凝块消失。A. 1. 465 ℃ 温裕 2 h--4 h,
A1.5加入80oLBuerB,额倒混合，然后冰浴10min（或放入--20C冰籍内5min~10min）。A. 1. 6用离心机在室温下以 12 000 r/min离心 15 min。A.1.7吸取！ml.上消液」另一新的1.5ml.离心管中，注意不要吸到下层沉淀物或表层漂浮物.必要时可重复离心大除江淀物：
A,1. 8加人 Eon 异丙醇(isopropanol),题倒混合几次。4, 1, 9 室温 12 000 r/ min 离心 15 m.in。A.1.10弃上消液，然码用7（休积分数）乙醇（ethan2l)清洗两次，室温十爆加入:50μl.TE室温溶解33min.
A.1.11在水实向泳谱内用1.0%（质量分数）琼脂糖胶电泳检测DNA的质量，用紫外可见分光光度，以260/280吸光度检测1NA浓度。A. 1. 12 -20 ℃保荐,
A, ?马毛囊样 DNA 的提取
A,2。1采取马的案毛，应该带有避，10支以上。4.2.2取0.2mL离心管，榜记样品号。A, 2. 3 取 根~10 根带有毛囊的毛样,在根部用剪刀剪划约 安. 5 cm(避免粘在剪力 [.),改人离心，
A.2.4加人60 pL毛套裂解液（此浓度为照毛样品的用量，要毛如2/3越度的毛覆裂解被)于毛摄处，游涡振荡仪上迅速游涡混合3min。A.2.5在PR仪上用如下程序进行一个热循环：75℃1mia,:2min.90℃1min,9710minsA，2.6从热循环仪上取下样品，加人80L巾和波（此浓度为黑毛样品的用盘，栗毛加2/3浓度的中和液），游涡派合$min.
A. 2. 7—20 1保存。
TTTKAONYKACA
附录B
（资料性附录）
用于扩增纯血马亲子鉴定的 12 个微卫星位点的引物用十扩增纯止马亲子监定的12 个微卫星位点的引物如表 B.1所示。表B.1用于扩增纯血马亲于签定的12个微卫星位点的引物位点名称
正间,AACCGCETLAGEAAGGAAGT
反向:GCTGCAGAGAGTTTACCCT
正商，ACGGACACATCTCTGCKTCK
序5'—3\
成：ATCTAGCAGGGTAAGGAGGCICAC正间:CCTTCCTGTAGTTTALAGCITCTG反向:GATCATATGCOXTTATCTCTTTGCGC正向：CCTGAAGCAGAACATOCCTCCTIGF前:ATAAAGTGTCTGGGCAGAGCTGCT正可:CC4AGTCTTTGTEAEA-AACAAGA:CCATCCTCAGTTTTTCACTTT+TT
正,GAAGCTGLEAGTAITEAAUCATTC
反间:GTCCATGTTGTGAAGTGTAACA
正向:CAGGAAACTCATGTTGAALCATCR可:FCTTGFFGAAALATACCIIGACTGTE向:GTATITCAGTCTTGATTGCAGGAC后向:CTCCCTCCCTCCCTCTGTTCTC
正向:AOGGTGGCAACTGCCAAGGAAF
CTTGCAGTCGAATGTGTATTAAATG
正间,CCTGCTTGGAGGCTGTGATAAGAT向:GTTCACTGAATGTCAAATTCI:I
正前:CAATTCCCGCCCCACCCECGGCA友向TTTTTATTCIGATCIGTCAEATTT正间:CAAGTCCTCTTACTTGAAGATAG反用:AACTCAGGGAGAATCTICCCAG
GB/T 26612-2011
GE/T 26612—2Q11
C. 1 PCR 条件
附录C
【资料性附录】
扩增纯血马亲子鉴定的 12个微卫星位点的[CH亲件扩增纯血马亲于签定的12个微卫量位点的PCR条件如表C.1所示。表C.1用于纯血马亲子鉴定的荧光标记引物扩增条件和扩增产物片段大小位点名称
C, 2 PCR 反应体系
标记颜色
开翌大小/bp
151--137
133~117
212~218
115~-128
165--172
159~-173
173--185
123--141
215·~238
97--105
退火湿度
Mg!|瓶度/mmol/L
PCR 反应体系如 下:5 μL:反应体系:10 X FLR 缓冲被 5 μ,dNTPe (5 mmol/L) 1 μL,引暂(50ml/)2TagD>A亲合5U/uL)0.5μ模板DNA1oL(0ng-b0ng）.dH031.3μL，扩增每个位点所得的最生镁离子浓度参见表C.1。反应条件：FCR反应录件随仅器个同略有改变。94预变性1min-~3miz。94变性3，退火309增每个位点所需的最佳退火温度参见衰C.1），72延伸453，0个循坏。72延伸30m切.4 r保存。
检测过程中分别设所性对照、阴性对照和空白对照。用口知可减功扩增的马DV样品作阳性对照;用等体积的重蒸瘤水代替模板INA作空白对照。C.3PCR扩增产物的电承检测
PCR扩增产物电泳检测：取2.56琼脂糖，放入100mL泳缓冲液（将电泳缓冲液50×工AL用去离子水稀释50铲）加热充分熔解后剂胶：在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面没过疑胶，将4μIPCR扩增产物和适量上样绥冲液混合后1.样：9 V/cIm 恒压电泳,溴厨蓝迁移至胶中部停止。将胶放人滨化乙链溶疫（浓度为0.5\g/mL)中染色15min，采用凝胶破像系统观察电泳结果井记录5
附录D
(瓷料性附激）bZxz.net
采用染进行缴卫星INA基因型的分析方法D.112%(质量分数>聚丙端胺凝胶(25mL体积,0.1m胶条)制作及电泳乃,1.1清洗制胶用的皱璃板并用蒸水冲选于净,晾十后上垫涤,用夹了夹好。CB/T 26612-2011
. 1. 2在 100 mL烧杯内加入 30%(质量分数)桑丙两烯酰胺 10 mL:2.5 mL 5U%(体积分数)的廿油电泳解經冲液 5×TBE 5mL，10另(质分数）过硫酸铵 ,175 mnL,IEMEI)&μL,加人蒸馏水7.325mL，混合均句底迅速谜胶：上述为一决胶的量·多快胶时按比例加倍：D,1.3当誉胶至玻璃短1沿0.1心1时停止插人梳于,室温故至其聚合D，1.4凝胶案合好后，向垂直电泳情加人1×TBE,用注射器冲洗如样孔。D, 1. 5 均电球 10 ii,然后上样,电泳。D.2硝酸银染色方法
用去离了水冲洗胶。
用25%（体积分数)的2醇漫范胶2min~~3 min-D. 2. 3
去离于水冲浒2遍。
D.2.4用0.1%（质量分数）AgNt)染色液染色30ma~40min。去离子水冲洗2遍，
5用显色被(段15 g >u0H,;去离子永至500 mlL溶解,加 0, 076 g四酸钠 8:0 μL 甲醛)业D. 2.6
色10 rain-~20 min。
D.2.7用去高子水冲洗多余的显任液。显色的胶用保鲜膜封好，观察利照机。D. 2, 8
G/T 26612--2011
附录E
（资料性附录）
纯血马亲子监定微卫星DNA基因型登记统血马亲子鉴定微卫星DNA基内型登记如表E.1所示。表E.1
纯血马亲子鉴定微卫星DNA基因型登记表位点称
了代基因型
孕马基丙型
公马基因型
于化基西型
马英因塑
公！因型
HVSAHT5HM$6
ASB2HrG10HMS3HMS?
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。