GB/T 27517-2011
基本信息
标准号： GB/T 27517-2011
中文名称：鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR方法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准简介
GB/T 27517-2011 鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR方法
GB/T27517-2011
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标准内容
ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T 27517-2011
鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR方法
A multiplex RT-PCR method to differentiate the highlypathogenic and classical porcine reproductive andrespiratory syndromevirus
2011-11-21 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2012-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出，本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口：本标准起草单位：河南省动物疫病预防控制中心，GB/T27517—2011
本标准主要起草人：吴志明、闫若潜、张志凌、张健、荆汝顶、刘光辉、赵明军、曹杰伟、钱勇、程俊贞、赵雪丽、张盼。
TTKONKACA
1范围
鉴别猪整殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR方法
GB/T 27517—2011
本标规定了检测以基因组非结构蛋白Nsp2编码区缺失30个氮基酸为特征的猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性毒株与非缺失30个基酸的猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株复合RT-PCR鉴别诊断方法。
本标难适用于疑似猪紧殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染猎血清及临床病料等样品中的病毒核酸检测，
2试剂和仪器设备
除另有规定外,所用化试剂均为分析纯。提取RNA所用试剂均应使用无RNA酶的容器进行分装。
2.1试剂
2.1.1找于悉液（见附录A）,组织忌获（见附录A）,以上试剂常温保存2.1.2阿氏液见附录A），裂解液（TriZl)1×TAE核酸电泳缓冲液（见附录A），氯仿，0.01mol/L(pH7.2)的PBS(见附录A),DEPC处理永（见附录A），以上试剂4C保存。2.1.3异丙醇，75%乙醇，DNA分子量标准，6×电泳上样绥冲液，以上试剂一20℃保存。2.1.4阳性对照、阴性对照(见附录A)。2. 1. 5复合RT-PCR扩增用上、下游引物序列参见附录B。2. 1. 62
鉴别猪繁蕴与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR反应体系组成、说明及使用注意事项参见附录C。
2.2仪器设备
PCR扩增仪.高速冷冻离心机（离心力在12000g以上），核酸电泳仪和水平电泳槽，慎温水浴锅，2℃~8℃冰箱，—20℃冰箱，单道微量秘液器(.5μL--10μL;2μL~20μL,20μL~200μL;100μL~1000μL），组织句浆器或研钵，凝胶成像系统（或繁外透射仪），真空干燥器（非必备）。3样品的采集、处理，存放及运输3.1样品采集及处理过程的注意事项采样过程中样本不得交污榮，来样及样品处理过程中成裁·-次性手套、口罩，辑子。3.2样品的来集及处理
3.2.1拭子样品
3.2.1.1拭了采样时要将棉拭子深人鼻腔来刮3-5次，取鼻腔分泌物。1免费标准下载网bzxz
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GB/T 27517—2011
3.2. 1.2肛门拭于:将栉拭子深人肛门转一圈沾取龚便。3.2.1.3将鼻腔拭子和肛门拭子一起微人盛有1.0mI拭子悬液的Eppendorf管中，然后将拭子悬液转人无菌Eppcndorl管中4℃条件下5000r/min离心10min,取上转人新的无菌Eppendo管中，编号备用：
3.2.2组织样品
组织样品来集时成来取有明显病变的淋巴结，扁桃体、肺脏、脾脏肾脏、胸腺等组织品，用无菌的剪刀和子剪取待检样品0.5g左右于组织句浆器或研钵中充分匀浆或研磨，再加0.3mL~0.5mLPBS滤匀，然后将组织暴箍转人无菌Eppendorf管中，4七条件下5Door/min离心10min，取上消转人新的无菌Eppendarf中，编导备用：3.2.3血清或抗凝血
用无菌注射器白耳静脉或前腔静脉采集而液3mL～5mL，待血清析出后直接圾取至无南Eppen-dorf管中，编号备用；用无菌注射器先吸人抗凝剂（氏液）2ml.3mL，再自耳静脉或前腔脉采集等量血液，快速混匀后转人无嘴Eppendorf管中，编号备用，3.3存放与运送
采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应政置一70℃冰箱.但应避免反复冻融。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实险索。4操作方法
4.1样品RNA的制备
4.1.1取1.5mL次菌Eppendorf管，每管加人300μI.裂解液，然后分别加入测样品、阴性对照样品、阳对照样品各100μL，吸头反复吸打混匀（一份样品换用一个吸头），再加人100L氯：充分题倒混匀（不宜过于强烈）于4C条件下，12000/min离心15min。4.1.2吸取离心店各替中的.比清液150μl.转移至新的1.5m.灭菌Eppendorf管中（注意不要吸出中间层），加人150μL一20预冷的异丙醇，颠倒混勾·室温放置15min。4.1.34℃条件下12000r/tnin离心15nin（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清，置于吸水纸上.吸干液体，不同样品应登于吸水纸不同地方沾于。加人1ml.75%乙么醇，轻轻颠倒洗涤。
4.1.44℃条件下12000r/min离心5min(Eppendorf管开口保持朗离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上滑液，倒置于吸水纸上，吸十液体，不尚样品应在吸水纸不同地方吸于。4. 1. 54 C条件下 12 000 r/min 离心 30 日,特臂壁上的残余液作用到管底部,用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，真空抽干3min5min或室温下燥10min。不宜过下千燥.以免RNA不易溶解：4.1.6加入11μLDEPC处理水.轻轻混匀，落解管壁上的RNA，2000r/min离心5，冰上保存备用。提取的RNA应在 2 h 内进行RI-PCR扩增或政置于一70 C冰箱备用。4.2反转录（cDNA的合成）
配制反转录反成体系(参见附录 C),间每管中加人 4. 1. 6中相应RNA 10 μL,37℃水浴 1 h或署于 PCR 议中 37 ℃ 1 h,反应结束后,70 ℃ 15 min 灭活反转录酶,直接脏于下面的 PCR 扩增或-~20 ℃冻存备用。
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4.3复合PCR扩增
GB/F27517—2011
配制复合PCR反应体系（参见附录C）：在室温下融化后，瞬时离心使液休全部聚集在管底部.向每管中加人4,2中相应cDVA4μL，经充分混勾后避时离心使液体全部桑集于管底，加人25μL的石蜡油覆盖液面（若PCR仪具有热盖加热功能时PCR反应管中也可不加石蜡油，但排荐采用加石蜡油的方法）。
PCR扩增条件：95℃预变性5min后,94℃455,59℃45s.72℃45s共35个循环，最后72℃延伸10 rnin。扩增反应结束后取出放置于4。4. 4PCR扩增产物的电泳检测
称取1.2琼脂糖加人100mL核酸电泳缓冲液中加热，充分溶化后稍效凉，加入适量的溴化乙链(终浓度 0. 5 μg/ mL),例入胶糖制备避胶板。 在电泳精中加人 1 × TAE核酸电泳缓冲液,使液自刚刚没过凝胶。 取 5 μL--10 μI. PCR扩增产物分别和 1 μL~2 μL 6×电泳上样缓冲液混合后,分别加样到各凝胶孔-取 5 μL DNA 分子量标准加到一避胶孔中。 5 V/ur 恒压下屯冰 30 min 左右。 将电好的凝胶放到紫外透射仪或凝胶成像系统上观察结果，进行判定并做好试验记录。5结果判定
5.1试验结果成立条件
猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株F[性对照的PCR扩增产物，经电泳后分别在400bP和 264 bp 位置出现特异性条带,同时阴性对照的 PCR 扩增产物电泳后没有任何条带(参见附录 D),则试验结果成立否则结果不成立。5.2阳性判定
在试验结果成立的前提下，如果样品的PCR产物电泳后在400bp和264bp的位置上同时出现特异性条带,判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典案株核酸检测双阳性;若 400 bp位置出现特异条带而264bp位置尤特异条带,判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性毒株核酸检测阳性;若264bp位置出现特异条带而400bp位置无特异条带，判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株核酸检测阳性，
5.3阴性判定
在试验结果成立的前提下,如果 400 bp 和 264 bpP位置均未出现特异性条带,判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株核酸检测阴性。TTTKAONATKACA
GB/127517--2011
A.1拭子悬液
附录A
(规范性附录）
试剂的配制
在0.01mol/L FBS液中添加以上所有的抗生索，浓度提高5倍;加人抗生素后调pH值至7,2~7.4。A.2组织忌液
在0.01mol/LPBS液中添加青霉素（2000IU/mL），链素（2mg/ml）、庆大霖素<50Pg/mL)和制菌素（1000IU/mL)。
A.3阿氏液
葡萄糖2.05名，柠檬酸钠0.8区，柠檬酸0.055，氯化钠0.42，加蒸馏水至100mL，溶解后调pH值至6.1,69kPa15min高压灭案，4℃保存备用，A.41XTAE核酸电球缓冲液
Tris碱,24.2冰乙酸，5.71mL0.5mol/LEDTA(p18.0),10mL加蒸馏水至100mL，使用时用蒸馏水作50倍稀释，即为1×TAE核酸电泳缓冲液。A. 50. 01 moI/L(pH7. 2)的磷酸盐缓冲液(PBS)A.5.1A液（0.2mol/I.磷酸二氢钠水溶液）:NaH.PO·H.O)27.6g先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馅水稀释至1000mL。
A,5.2B液(0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液):Na.HIO,-7H053.6g.(或Na,HPO,-12Ha071.6g或NazHPO·2H.035.6g>先用适量蒸馏水落解，最后用蒸馏水稀释至1000LA.5.30.01mo1/LPBS的配制A液14mL,B液36mL，加氯化钠CNaC1)8.5g，最后用蒸馏水稀释至1000mL:121℃，15min高压灭菌，4保存备用。A.6DEPC处理水
用 0. 1% DEPC处理后的蒸馏水,经 121 ℃ 15 min 高压处理,用于溶解 RNA。A.7阳性对照
经 Marc-145 细胞传代培养的第8 代 PRRSV 商致病性和经典毒株,灭活细胞率。A.8阴性对照
Mearc-115细胞液。
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附录B
（资料性附录）
GB/T27517-2011
鉴别猪殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR方法所用引物表B, 1
鉴别猪缝殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR方法所用引物引物名称
PCR扩增E引物P1
PCR扩增上萨引物P
PCR扩增其用下游引物P
强物浓度
20pol/μL
20 pmol/μL
20 pmol/μl.
5'-GGTECCGAAGAAACTGTCGG-3
S-ACCAGCTGGAAGAAGCGAATC-3
S-GAGCTGAGTATTTGEGUGTG 3
扩增片段大小
P1/P3引物对扩增片段
40c bp:
P2/P3引物对扩增片段
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附录C
（资料性附录）
鉴别繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR反应体系组成、说明及使用时注意事项
试剂盒组成
表C.1试剂盒组成
组成或分
反转录反应体系
FCR反应体系
阳性对照
阴性对脏
裂解液
舜丙醇
了5%乙
DEPC 处理水
5C倍TAE电泳缓冲液
澳化乙淀资液
上样缓冲桩
右蜡袖
C.2说明
20管（10/）
20昔(21μL/)
SCO pL
40 μL
120μL
C.2. 1 反转录反应体系分: M-MLV 5X Reaction buIfcr(含 Mg2-),4 μL,2. 5 mmol/L dNTPs,4 μL;M-MLV,0. 5 μL;RNA 酶抑制剂,0,5 μL,共用反转录引物(P3,也是复合 PCR共用下游引物)1；总体积10μ。
C.2.2 复合 PCR反应体系成分:10×PCR 缓冲液(含 Mg+),2.5 μL;2. 5 mmol/L NTPs,2 μI:Pl,D.5uL;P2,0.5μI;P3,1μExTaqDNA聚合，0.5μ(2.5U)，灭菌双蒸水，14.0μL总体积为21 μl..
C,2. 3裂解液的主要成分是 TriZnl,为 RNA 提取试剂,外观为粉红色,于 4 C保存。C.2.4反转录反应体系中含猪繁殖与呼吸综合征病毒高病性与经典毒株共用反转录引物、反转录酶及各种离子。
C. 2. 5 PCR 反应体系中含猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典率殊特异性引物对、ExTaq 酶及各种离子。
使用时的注意事项
C,3.1由于阳性样品中模板浓度相对铰高，注意检测过程中不得交叉污染。C.3.2注意防止试剂盒组分受污，试剂盒之间的成分勿混用。GB/T27517--2011
C. 3. 3请按照说明书要求分别在 4℃一20 ℃保存不间的试剂,试剂盒有效期为 6 个月。使用时在室温下融化,暂放暨于冰上使用店立即放回。C. 3. 4 反转录反应体系与 PCR 反应体系应避免反复冻融，在使用前应瞬时离心,以保证反应波集于在管底，
GB/T27517—2D11
附录D
（资料性附录）
猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR产物电泳图M
400 bp
DNA分于量标难（DL2000Me:kcr）：1——PRRSV高致病性和经典毒袜混合物阳性对照；PRRSV高致病性毒株阳性对照：
-PRRSV经典毒株阳性对恶；
4—明性对照。
图D.1紧殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR产物电泳图
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A multiplex RT-PCR method to differentiate the highlypathogenic and classical porcine reproductive andrespiratory syndromevirus
2011-11-21 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2012-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出，本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口：本标准起草单位：河南省动物疫病预防控制中心，GB/T27517—2011
本标准主要起草人：吴志明、闫若潜、张志凌、张健、荆汝顶、刘光辉、赵明军、曹杰伟、钱勇、程俊贞、赵雪丽、张盼。
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1范围
鉴别猪整殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR方法
GB/T 27517—2011
本标规定了检测以基因组非结构蛋白Nsp2编码区缺失30个氮基酸为特征的猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性毒株与非缺失30个基酸的猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株复合RT-PCR鉴别诊断方法。
本标难适用于疑似猪紧殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染猎血清及临床病料等样品中的病毒核酸检测，
2试剂和仪器设备
除另有规定外,所用化试剂均为分析纯。提取RNA所用试剂均应使用无RNA酶的容器进行分装。
2.1试剂
2.1.1找于悉液（见附录A）,组织忌获（见附录A）,以上试剂常温保存2.1.2阿氏液见附录A），裂解液（TriZl)1×TAE核酸电泳缓冲液（见附录A），氯仿，0.01mol/L(pH7.2)的PBS(见附录A),DEPC处理永（见附录A），以上试剂4C保存。2.1.3异丙醇，75%乙醇，DNA分子量标准，6×电泳上样绥冲液，以上试剂一20℃保存。2.1.4阳性对照、阴性对照(见附录A)。2. 1. 5复合RT-PCR扩增用上、下游引物序列参见附录B。2. 1. 62
鉴别猪繁蕴与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR反应体系组成、说明及使用注意事项参见附录C。
2.2仪器设备
PCR扩增仪.高速冷冻离心机（离心力在12000g以上），核酸电泳仪和水平电泳槽，慎温水浴锅，2℃~8℃冰箱，—20℃冰箱，单道微量秘液器(.5μL--10μL;2μL~20μL,20μL~200μL;100μL~1000μL），组织句浆器或研钵，凝胶成像系统（或繁外透射仪），真空干燥器（非必备）。3样品的采集、处理，存放及运输3.1样品采集及处理过程的注意事项采样过程中样本不得交污榮，来样及样品处理过程中成裁·-次性手套、口罩，辑子。3.2样品的来集及处理
3.2.1拭子样品
3.2.1.1拭了采样时要将棉拭子深人鼻腔来刮3-5次，取鼻腔分泌物。1免费标准下载网bzxz
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GB/T 27517—2011
3.2. 1.2肛门拭于:将栉拭子深人肛门转一圈沾取龚便。3.2.1.3将鼻腔拭子和肛门拭子一起微人盛有1.0mI拭子悬液的Eppendorf管中，然后将拭子悬液转人无菌Eppcndorl管中4℃条件下5000r/min离心10min,取上转人新的无菌Eppendo管中，编号备用：
3.2.2组织样品
组织样品来集时成来取有明显病变的淋巴结，扁桃体、肺脏、脾脏肾脏、胸腺等组织品，用无菌的剪刀和子剪取待检样品0.5g左右于组织句浆器或研钵中充分匀浆或研磨，再加0.3mL~0.5mLPBS滤匀，然后将组织暴箍转人无菌Eppendorf管中，4七条件下5Door/min离心10min，取上消转人新的无菌Eppendarf中，编导备用：3.2.3血清或抗凝血
用无菌注射器白耳静脉或前腔静脉采集而液3mL～5mL，待血清析出后直接圾取至无南Eppen-dorf管中，编号备用；用无菌注射器先吸人抗凝剂（氏液）2ml.3mL，再自耳静脉或前腔脉采集等量血液，快速混匀后转人无嘴Eppendorf管中，编号备用，3.3存放与运送
采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应政置一70℃冰箱.但应避免反复冻融。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实险索。4操作方法
4.1样品RNA的制备
4.1.1取1.5mL次菌Eppendorf管，每管加人300μI.裂解液，然后分别加入测样品、阴性对照样品、阳对照样品各100μL，吸头反复吸打混匀（一份样品换用一个吸头），再加人100L氯：充分题倒混匀（不宜过于强烈）于4C条件下，12000/min离心15min。4.1.2吸取离心店各替中的.比清液150μl.转移至新的1.5m.灭菌Eppendorf管中（注意不要吸出中间层），加人150μL一20预冷的异丙醇，颠倒混勾·室温放置15min。4.1.34℃条件下12000r/tnin离心15nin（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清，置于吸水纸上.吸干液体，不同样品应登于吸水纸不同地方沾于。加人1ml.75%乙么醇，轻轻颠倒洗涤。
4.1.44℃条件下12000r/min离心5min(Eppendorf管开口保持朗离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上滑液，倒置于吸水纸上，吸十液体，不尚样品应在吸水纸不同地方吸于。4. 1. 54 C条件下 12 000 r/min 离心 30 日,特臂壁上的残余液作用到管底部,用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，真空抽干3min5min或室温下燥10min。不宜过下千燥.以免RNA不易溶解：4.1.6加入11μLDEPC处理水.轻轻混匀，落解管壁上的RNA，2000r/min离心5，冰上保存备用。提取的RNA应在 2 h 内进行RI-PCR扩增或政置于一70 C冰箱备用。4.2反转录（cDNA的合成）
配制反转录反成体系(参见附录 C),间每管中加人 4. 1. 6中相应RNA 10 μL,37℃水浴 1 h或署于 PCR 议中 37 ℃ 1 h,反应结束后,70 ℃ 15 min 灭活反转录酶,直接脏于下面的 PCR 扩增或-~20 ℃冻存备用。
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4.3复合PCR扩增
GB/F27517—2011
配制复合PCR反应体系（参见附录C）：在室温下融化后，瞬时离心使液休全部聚集在管底部.向每管中加人4,2中相应cDVA4μL，经充分混勾后避时离心使液体全部桑集于管底，加人25μL的石蜡油覆盖液面（若PCR仪具有热盖加热功能时PCR反应管中也可不加石蜡油，但排荐采用加石蜡油的方法）。
PCR扩增条件：95℃预变性5min后,94℃455,59℃45s.72℃45s共35个循环，最后72℃延伸10 rnin。扩增反应结束后取出放置于4。4. 4PCR扩增产物的电泳检测
称取1.2琼脂糖加人100mL核酸电泳缓冲液中加热，充分溶化后稍效凉，加入适量的溴化乙链(终浓度 0. 5 μg/ mL),例入胶糖制备避胶板。 在电泳精中加人 1 × TAE核酸电泳缓冲液,使液自刚刚没过凝胶。 取 5 μL--10 μI. PCR扩增产物分别和 1 μL~2 μL 6×电泳上样缓冲液混合后,分别加样到各凝胶孔-取 5 μL DNA 分子量标准加到一避胶孔中。 5 V/ur 恒压下屯冰 30 min 左右。 将电好的凝胶放到紫外透射仪或凝胶成像系统上观察结果，进行判定并做好试验记录。5结果判定
5.1试验结果成立条件
猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株F[性对照的PCR扩增产物，经电泳后分别在400bP和 264 bp 位置出现特异性条带,同时阴性对照的 PCR 扩增产物电泳后没有任何条带(参见附录 D),则试验结果成立否则结果不成立。5.2阳性判定
在试验结果成立的前提下，如果样品的PCR产物电泳后在400bp和264bp的位置上同时出现特异性条带,判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典案株核酸检测双阳性;若 400 bp位置出现特异条带而264bp位置尤特异条带,判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性毒株核酸检测阳性;若264bp位置出现特异条带而400bp位置无特异条带，判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株核酸检测阳性，
5.3阴性判定
在试验结果成立的前提下,如果 400 bp 和 264 bpP位置均未出现特异性条带,判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株核酸检测阴性。TTTKAONATKACA
GB/127517--2011
A.1拭子悬液
附录A
(规范性附录）
试剂的配制
在0.01mol/L FBS液中添加以上所有的抗生索，浓度提高5倍;加人抗生素后调pH值至7,2~7.4。A.2组织忌液
在0.01mol/LPBS液中添加青霉素（2000IU/mL），链素（2mg/ml）、庆大霖素<50Pg/mL)和制菌素（1000IU/mL)。
A.3阿氏液
葡萄糖2.05名，柠檬酸钠0.8区，柠檬酸0.055，氯化钠0.42，加蒸馏水至100mL，溶解后调pH值至6.1,69kPa15min高压灭案，4℃保存备用，A.41XTAE核酸电球缓冲液
Tris碱,24.2冰乙酸，5.71mL0.5mol/LEDTA(p18.0),10mL加蒸馏水至100mL，使用时用蒸馏水作50倍稀释，即为1×TAE核酸电泳缓冲液。A. 50. 01 moI/L(pH7. 2)的磷酸盐缓冲液(PBS)A.5.1A液（0.2mol/I.磷酸二氢钠水溶液）:NaH.PO·H.O)27.6g先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馅水稀释至1000mL。
A,5.2B液(0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液):Na.HIO,-7H053.6g.(或Na,HPO,-12Ha071.6g或NazHPO·2H.035.6g>先用适量蒸馏水落解，最后用蒸馏水稀释至1000LA.5.30.01mo1/LPBS的配制A液14mL,B液36mL，加氯化钠CNaC1)8.5g，最后用蒸馏水稀释至1000mL:121℃，15min高压灭菌，4保存备用。A.6DEPC处理水
用 0. 1% DEPC处理后的蒸馏水,经 121 ℃ 15 min 高压处理,用于溶解 RNA。A.7阳性对照
经 Marc-145 细胞传代培养的第8 代 PRRSV 商致病性和经典毒株,灭活细胞率。A.8阴性对照
Mearc-115细胞液。
TTTKAONYKACA
附录B
（资料性附录）
GB/T27517-2011
鉴别猪殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR方法所用引物表B, 1
鉴别猪缝殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR方法所用引物引物名称
PCR扩增E引物P1
PCR扩增上萨引物P
PCR扩增其用下游引物P
强物浓度
20pol/μL
20 pmol/μL
20 pmol/μl.
5'-GGTECCGAAGAAACTGTCGG-3
S-ACCAGCTGGAAGAAGCGAATC-3
S-GAGCTGAGTATTTGEGUGTG 3
扩增片段大小
P1/P3引物对扩增片段
40c bp:
P2/P3引物对扩增片段
GB/T 27517—2011
附录C
（资料性附录）
鉴别繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR反应体系组成、说明及使用时注意事项
试剂盒组成
表C.1试剂盒组成
组成或分
反转录反应体系
FCR反应体系
阳性对照
阴性对脏
裂解液
舜丙醇
了5%乙
DEPC 处理水
5C倍TAE电泳缓冲液
澳化乙淀资液
上样缓冲桩
右蜡袖
C.2说明
20管（10/）
20昔(21μL/)
SCO pL
40 μL
120μL
C.2. 1 反转录反应体系分: M-MLV 5X Reaction buIfcr(含 Mg2-),4 μL,2. 5 mmol/L dNTPs,4 μL;M-MLV,0. 5 μL;RNA 酶抑制剂,0,5 μL,共用反转录引物(P3,也是复合 PCR共用下游引物)1；总体积10μ。
C.2.2 复合 PCR反应体系成分:10×PCR 缓冲液(含 Mg+),2.5 μL;2. 5 mmol/L NTPs,2 μI:Pl,D.5uL;P2,0.5μI;P3,1μExTaqDNA聚合，0.5μ(2.5U)，灭菌双蒸水，14.0μL总体积为21 μl..
C,2. 3裂解液的主要成分是 TriZnl,为 RNA 提取试剂,外观为粉红色,于 4 C保存。C.2.4反转录反应体系中含猪繁殖与呼吸综合征病毒高病性与经典毒株共用反转录引物、反转录酶及各种离子。
C. 2. 5 PCR 反应体系中含猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典率殊特异性引物对、ExTaq 酶及各种离子。
使用时的注意事项
C,3.1由于阳性样品中模板浓度相对铰高，注意检测过程中不得交叉污染。C.3.2注意防止试剂盒组分受污，试剂盒之间的成分勿混用。GB/T27517--2011
C. 3. 3请按照说明书要求分别在 4℃一20 ℃保存不间的试剂,试剂盒有效期为 6 个月。使用时在室温下融化,暂放暨于冰上使用店立即放回。C. 3. 4 反转录反应体系与 PCR 反应体系应避免反复冻融，在使用前应瞬时离心,以保证反应波集于在管底，
GB/T27517—2D11
附录D
（资料性附录）
猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR产物电泳图M
400 bp
DNA分于量标难（DL2000Me:kcr）：1——PRRSV高致病性和经典毒袜混合物阳性对照；PRRSV高致病性毒株阳性对照：
-PRRSV经典毒株阳性对恶；
4—明性对照。
图D.1紧殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR产物电泳图
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