GB/T 27527-2011
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GB/T 27527-2011 禽脑脊髓炎诊断技术
GB/T27527-2011
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标准内容
ICS 11. 220
中华人民共和国国家标准
GB/T 275272011
禽脑脊髓炎诊断技术
Diagnostic techniques for avian encephalomyelitis2011-11-21 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2012-03-01实施
本标推按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标滩由中华人民共和国农业部提出。本标摊由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口GB/T27527—2011
本标准起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古动物疫病预防控制中心,中国动物疫病颅防挖制中心.北京世纪元享动物防疫技术有限公司、扬州大学、青岛易邦生物工程有限公司。本标推主要起草人：赵振华、赵心力、陈西创、孙明、正金玲、秦爱建、范根成、李瑞刚、乌月军，H
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1范圈
禽脑脊髓炎诊断技术
GB/T 27527--2011
本标推规定厂离脑脊髓炎诊断技术.包括流行学、临床症状、组织病理学变化、病毒分离、琼脂免疫扩散试验、中和试验和间接免疫荧光试验。本标难适用十禽脑肾髓炎的诊断、检疫和流行病学调查。2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AE(V)：禽脑脊炎（病毒)[avianencephalomyelitis(virus)AEV-VR：禽脑脊髓炎病毒VanRoekel株（AEV标准株）（aviancnccphalamyelitisvirus-VanRoekel
EID：鸡胚卡数感染量（egginfectiousdosc）FITC：异硕酸荧光素（fluoresreinisothiocyanate）H.E.染色：苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosinstaining）PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffcrsalinc）3流行病学
除鸡易感AEV外，雉鸡、、火鸡和山鸡也可自然感梁。无本病史和未经免疫的鸡群一旦感染，推鸡发病率通带为40%60为死亡率为10%～80%或更高。不间日龄的鸡一年四季均可感染。随日龄的增长，鸡对AEV的抵抗力不断增强。感染鸡的种蛋可以引起后代鸡胚和维鸡发病（垂直传播）同时，病鸡的分泌物和排泄物可污染环境、饲料和饮水，引起与其接触的易感鸡发病（水平传播）。自然情况下4周龄以内的雍鸡（幼禽）对AEV最易感，实验室情况下，1日龄维鸡脑内接种AEV强毒5d-7d后可发病；经胚胎感染的雏鸡出壳后潜伏期1d～7d，口服感染或自然接触一般9d～l1d后发病。4临床症状
自然感染和人工感染维鸡的临床猴状基本致，初期精神沉郁、嗜睡、易惊、斜视.呈半游姿势、头颈偏向一侧、饮水困难，双腿紧缩、叉开或爪蜡缩，以后可出现站立不稳、进行性运动失调，头颈快速震题等症状，甚者常因摊痰、衰竭而死亡。成年鸡感染后一般不出现明显症状，有时仅见轻微腹泻，产蛋率下降10为40%和种蛋孵化率降低。
5组织病理学变化
5.1材料准备
5.1.1器材
石蜡切片机染色缸、载玻片、盖玻片、水裕锅、温箱、显微镜等。I
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GB/T 27527—2011
5.1.2试券
1C为中性福尔马林溶液、酒精、二甲苯.切片石蜡、H.E.染色液,中性树胶等。5.1.3样品
临床可疑AE病例的大脑，中脑.小脑，延脑和腰荐部脊髓样品。5.2操作方法
分别切取小快(0.5 cm2～~1 cm)大脑、中脑,小脑,延脑和腰荐部脊髓样品置 10%中性福尔巧林溶液中周定 24 h~18 h。带规制片,H.E.染色,中性树胶封片，光镜观察。5.3病理变化
5.3.1中枢神经系统典型的组织病理学变化为非化脓性脑存髓炭主要包括大脑,中脑、小脑、延脑和脊髓的变质性变化、血管反应和胶质细躯增尘。5.3.2变砸性变化表现为神经细胞变性和神经组织出现小软化灶。变性的神经细跑扇大.谈染或浓缩，有的呈现中央染色质溶解现象。变性严重的神经细咆和局部神经组织可发生坏死，液化，形成小软化灶。
5.3.3血管反应表现为血管出现以淋巴细胞为主的围管性细胞衰润，浸润的细脑在血管周围散在或呈多层围绕，形成管套。
5.3.4胶质细胞增生表现为增生的胶质细胞可出现在变性神经细胞周围形成卫现象、或进人坏死的神经细胞中吞噬坏死物形成噬神经原现象。在软化灶处有数量不等的胶质细胞增生和案集形成胶质小结。
5.4结巢判定
若 5. 3, 2 ~5. 3. 4 尚时出现时则为非化脓性脑脊髓炎的典型病变,若主要出现 5. 3. 3,而 5. 3. 2 不明时，可能与免装反扇有关，常赋于免鸡摔，还过流行病学、临床症状和组织病理学变化可对AE做出初步诊断，在初步诊断的基础上·进行病薛分离（见第 6章)。
6病毒分离
6.1材料准备
6. 1. 1器材
无菌剪刀、镊子、平血、烧杯、玻璃瓶、组织研磨器、注射器，孵化器，离心机.高压灭菌器、冰柜、生物安全柜等。
6.1.2试剂
生理盐水、青霉素、链霉素。
6.1.3材料
SPF种蛋、SPF鸡。wwW.bzxz.Net
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6.1.4病料
（可疑）AE病继脑组织（以发病早期为好）。6.2操作方法
6.2.1病料的采集与保存
CB/T 27527--2011
无菌取病维鸡脑组织后应立即处理（见6.2.2)，若暂时不能处理，可十一70冰柜中保存。6,2.2病料处理
将病料无菌称量、研磨，反复冻融3次，用无菌生理盐水溶液作15稀释制成忌液，炸加双抗（双抗终浓度为1000I/mL青每烹，100g/ml链酶素）。样品经4000r/min离心10min，取上清液即自然病维脑组织病毒液，冻存，备用。6.2.3雏鸡接种
取6.2.2处理好的病毒，以0,05mL/羽脑内接种1且龄SIPF雏鸡，待出现AE症状后采血致死，同上述方法取脑研磨、制备+凝得接种病维脑组织病毒液，冻存、备用。6.2.4鸡胚接种
取6.2.3病毒样本，以0.2mL/胚，经卵黄森无菌接种6日龄SPF鸡胚，每份样本至少接种5枚胚，下37C孵化箱内孵育至16日龄收毒、观察鸡胚病变（同时设未接种病料的健康对照距）。收毒时，首先无菌吸取胚液（尿囊液和羊水）、然后观察胚体发育情况；检变胚体、胚脑病变+取胚脑、胃、肠、膜腺称量、研磨.以胚液作1*5稀释.同6.2.2加入双抗、离心，制成鸡胚组织病毒液，即为AE白然发病维鸡第1代胚病毒液（AEVE:）。取AFVE，按照本条上述方法再接种6日龄SPF鸡胚卵黄囊孵化、收毒，检查鸡胚病变、制备第2代还病毒液（AEVEs）。这样连续传代直至传代鸡胚出现病变时，该代鸡还病毒液即可作为病毒鉴定用的AE分离毒病毒液，同时可进行病声某些特性的检测。与健康对照组鸡胚相比，发病鸡胚病变为：胚体活力减弱、发育不良和肌肉萎缩（胚体重减轻）、胞细瓜曲或强直，脑缩，皮下，脑、胃肠水肿出血等，病毒分离后，可通过琼脂免疫扩散试验、中和斌验和间接免疫荧光试验中的任一种方泌进行病毒鉴定(见第7章）。了AE的确诊和病毒监定
7.1琼脂免疫扩散试验
7.1.1器材准备
7. 1. 1. 1 器树
冰箱、天平，90mm直径的平Ⅲ、微量加样器、塑料吸头和打孔器（内径4.0mm，孔间距3.0mm的7孔梅花样金属打孔器）。
7.1.1.2试剂
食脑脊躺炎琼脂免疫扩散试验冻干抗原（1mL/女瓶）、标准阴性血清和阴性血清、氯化、优质琼脂粉、pH7.2.01mol/LPBS(或生理盘水）、蒸馏水利1%硫柳汞溶液(见附录A)。7.1.1.3待检血清
无翅下静脉采血1mL左右：分离血清，一20℃冰箱保存备用。3
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GB/T 27527--2011
7.1.1.4待检抗原
6.2.4AE分离薛抗原和其他待检抗原。7. 1. 2操作步骤
7.1.2.1琼脂板制备
琼脂板的制备按如下步骤进行：a琼膜液配制:称取优质琼胎粉1.0g，加蒸馏水至100mI.。加热济化后,加人氯化钠18g，充分溶解后,加入1%硫柳汞溶液（终滩度为0.01）,摇约。制板：将琼胎液冷却至17℃～70℃，取洁净、干燥，直径为9G11的灭谢平，放置下无菌工b)
作台内.每个平ⅢL加琼脂被18mL，厚度约为3,0 tmm固后盖严，把平血倒置放入4亡冰箱中保存备用（保存朗2周）。
7. 1. 2. 2打孔
从冰箱内取出琼脂板，用7孔组的梅花形打孔器打孔（中问1孔，外周6孔，见圈1），孔欲4.0mm，孔距3.0mm。将孔中的琼脂轻轻挑出或吸出，勿伤及孔边缘或使琼脂层脱离平血底。图 平孤中梅花形 7 孔一组排列示意图7. 1. 2, 3封底
在酒精灯火焰上通过4次～6次划热平-而底面，使底部琼脂稍微融化即可。7.1.2.4抗原稀释
向1安板抗原内加人PBS(或生理盐水)1 mL,待溶解呈均句混悬亵时即为可使用的AE琼扩抗原液。
7. 1.2.5加样
根据需要和其体条件，可分别应用血清样品或抗原样品按以下处理方式进行加样：a）检验血猎加样：结合图2，用微量加样器吸取抗原液加人中央孔，标“十”的三孔加标阳性血清，1、2、3孔加被检血清，每孔均应加满，但不能溢出。每加个被检样品应换一个吸头图2加样示意图
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GB/T 27527-2011
b）检验抗原加样：结合图2.用微氧加样器吸取标准抗体溶液（AE标准阳性血清)加人中央孔，标“十“的兰孔如标准抗原液，1、2、3孔加待检抗原液，特孔均应加满，但不能溢出，每加一个被检样品应换一个吸头。
7. 1. 2. 6反应
加样完毕,室温静置10 min,放人 22 ~-26 ℃保趣盒内反应,分别在 24 h.48 h和 72 h观察并记录结果。
7.1.3结果判定
7.1.3.1检验血清结果判定
7. 1.3. 1. 1判定前提
将琼脂板昏日光灯或侧强光下观察，在抗原与标准阳性血清孔之间出现一条清晰,致密的沉淀线，抗原与阴性血清孔之间不出现沉淀线，说明对照成立，可进行结果判定：7. 1, 3. 1. 2阳性
标抗原孔与被检血清孔之间形成的沉淀线与阳性对照血清形成的沉淀线弯曲环联，判为阳性（见图3）。
注：标“+\孔为标准阳性血清，1、2、3孔被检血清呈阳性。图 3被检血清呈阳性示意图
7.1.3.1.3可疑
若标准抗原与被检血清孔间不出现沉淀线,而抗原与标准阳性血清孔间的沉淀线在被捡血清孔位管微问内侧弯曲者(见图4中的1号孔),则被检血清判为可疑反应。对该份血清复检,仍为可疑则判为阳性反应。
注；标“十“孔为标难阳性血清,[孔被检血消可疑+2、3孔被检血清明性围4被检血清呈可疑示意图
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7.1.3,1.4非特异性反应
若标准抗原孔和被检血清孔间的沉淀线粗且浑浊或与抗原孔和标准阳性血清孔之间的沉淀线交叉并直伸待检血消边缘者,则判为非特异性反应,应重做。若仍出现非特异性反成则判为阴性(如图 5 所示第 3孔)。
注：标\十“孔为标准阴性血清，1，2、3孔被检血潜分别为阳性，阴性和非特异性反应，图5被检血清呈非特异性反应示意图7. 1. 3. 1. 5阴性
标准抗原孔与被检血清孔之间无沉淀线，抗原扎标准阳性血清扎问沉淀线直伸延到被检血清孔边缘无弯曲者，则判为阴性（见图6)。注：标\+\孔为标准阳性盘湾，1、2、3托被检血循为阴性血清图6被检血清呈阴性示意图
7. 1.3. 2检验抗原结果判定
7. 1. 3. 2. 1判定前提
将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，在标准抗原与标准阳性血清孔之问出现一条清晰、致密的淀线，标准阳性血清孔与阴性抗原孔之间不出现沉淀线，说明对照成立，可进行结果判定。7.1. 3.2.2阳性、可凝、非特异性反应和阴性结果的判定原理和方法同7.1.3.1。7.2中和试验
7.2.1材料准备
7. 2. 1. 仪器
孵化器等。
7.2.1.2材料
SPF鸡胚、AE标准阳性血清、AE阴性血清、PBS（见附录A）。7.2.1.3病毒样品
6.2.4收获的待赖AE分离毒病毒液。7.2.2．操作方法
7. 2.2. 1病毒滴度(EIDs)测定
GB/T 27527—2011
将待检病荐被作10倍系列稀释至10-110\，分装到两列无菌试管中，第-列8管各加人等量AE阴性血清（对照组），第二列8管各加入等量AE标准阳非血清（试验组），握勾斥置37℃1h，然后每管分别卵黄衰接种6日龄SPF鸡胚各5枚（0.2mL/胚），继续孵化至16日龄，剖检、记录各组病变鸡胚数(感染发病胚病变判定标准见6.2.4)，分别计算两组的EID)：7. 2. 2. 2中和指数计算
待检病毒液的中和指数按式(1)计算：X-W/Y
式中：
X-中和指数;
W试验组EIDa
对照组 EIDs 。
7. 2. 3结果判定
中和指数小于10判为阴性.1050为而疑，大于50判为阳性，7.3间接免疫荧光试验
材料准备
7.3. 1.1墨材
荧光显微镜和冰冻切片机。
7.3.1,2试剂
FITC标记兔抗鸡IgG抗体、标准阻性血清、阴性血清（SPF鸡血清）、无水乙醇和丙酮。7.3. 1. 3组织样品
AE箍鸡脑组织样品、健康对照雏鸡（阴性)脑组织样品和待检脑组织品。7.3.2操作方法
7.3.2.1冰冻组织切片制备
取AE脑组织样品、阴性脑组织样品和待检禽脑组织样品或十二指肠样品，分别覆以冷冻固定剂，一70固定过夜。次月，取出，经冰冻切片机切片，将组织切片置载玻片上，用一20℃预冷的丙酮乙醇（3：2）固定液室温周定5min～10min。7
GB/T 27527—2011
7. 3. 2.2
间接免疫荧光检测
将固定好的组织切片，PBS洗3次，加上标准阳性血清，SPF鸡血清答100μ/块维织，于37温育30min后用PBS洗漆3饮，如人FITC标记免抗鸡IgG抗体，置37℃温育30min，经PBS洗涤3次后在荧光显微镜下观察。
7. 3. 3结果判定
7.3.3.1判定前捉
AE脑组织切片与阳性血清作用,出现明亮绿色荧光,而 AE脑组织切片与阴性血清作用以及阴性脑组织切片与阳性血清作用均无竟绿色荧光，则对照成立,结果可以判定。7. 3. 3. 2
判定标准
被检组织的细胞浆中出现亮绿色荧光者，判为阳性，否则判为阴性。0
附录A
（规范性附录）
琼脂免疫扩散试验用溶液的配制pH7.2 0.01mol/L. 磷酸盐缓冲溶液(PBS)的配制磷酸氢二钠(Na2HPO12H:0)
磷酸一氨钠(NaH.P()）
氯化钠（NaCl)
加蒸馏水至
用玺氧化钠(NaOH)或盐酸（HC1)调pH至7.2.灭菌或过滤。注：PBS-经使用，F4C保存不题过3周21%硫柳汞溶液的配制
硫柳汞
加蒸馏水至
溶解过滤后，置100mL瓶中盖，4℃存放备用：GB/T27527-2011
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2012-03-01实施
本标推按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标滩由中华人民共和国农业部提出。本标摊由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口GB/T27527—2011
本标准起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古动物疫病预防控制中心,中国动物疫病颅防挖制中心.北京世纪元享动物防疫技术有限公司、扬州大学、青岛易邦生物工程有限公司。本标推主要起草人：赵振华、赵心力、陈西创、孙明、正金玲、秦爱建、范根成、李瑞刚、乌月军，H
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1范圈
禽脑脊髓炎诊断技术
GB/T 27527--2011
本标推规定厂离脑脊髓炎诊断技术.包括流行学、临床症状、组织病理学变化、病毒分离、琼脂免疫扩散试验、中和试验和间接免疫荧光试验。本标难适用十禽脑肾髓炎的诊断、检疫和流行病学调查。2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AE(V)：禽脑脊炎（病毒)[avianencephalomyelitis(virus)AEV-VR：禽脑脊髓炎病毒VanRoekel株（AEV标准株）（aviancnccphalamyelitisvirus-VanRoekel
EID：鸡胚卡数感染量（egginfectiousdosc）FITC：异硕酸荧光素（fluoresreinisothiocyanate）H.E.染色：苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosinstaining）PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffcrsalinc）3流行病学
除鸡易感AEV外，雉鸡、、火鸡和山鸡也可自然感梁。无本病史和未经免疫的鸡群一旦感染，推鸡发病率通带为40%60为死亡率为10%～80%或更高。不间日龄的鸡一年四季均可感染。随日龄的增长，鸡对AEV的抵抗力不断增强。感染鸡的种蛋可以引起后代鸡胚和维鸡发病（垂直传播）同时，病鸡的分泌物和排泄物可污染环境、饲料和饮水，引起与其接触的易感鸡发病（水平传播）。自然情况下4周龄以内的雍鸡（幼禽）对AEV最易感，实验室情况下，1日龄维鸡脑内接种AEV强毒5d-7d后可发病；经胚胎感染的雏鸡出壳后潜伏期1d～7d，口服感染或自然接触一般9d～l1d后发病。4临床症状
自然感染和人工感染维鸡的临床猴状基本致，初期精神沉郁、嗜睡、易惊、斜视.呈半游姿势、头颈偏向一侧、饮水困难，双腿紧缩、叉开或爪蜡缩，以后可出现站立不稳、进行性运动失调，头颈快速震题等症状，甚者常因摊痰、衰竭而死亡。成年鸡感染后一般不出现明显症状，有时仅见轻微腹泻，产蛋率下降10为40%和种蛋孵化率降低。
5组织病理学变化
5.1材料准备
5.1.1器材
石蜡切片机染色缸、载玻片、盖玻片、水裕锅、温箱、显微镜等。I
TTTKAONYKACA
GB/T 27527—2011
5.1.2试券
1C为中性福尔马林溶液、酒精、二甲苯.切片石蜡、H.E.染色液,中性树胶等。5.1.3样品
临床可疑AE病例的大脑，中脑.小脑，延脑和腰荐部脊髓样品。5.2操作方法
分别切取小快(0.5 cm2～~1 cm)大脑、中脑,小脑,延脑和腰荐部脊髓样品置 10%中性福尔巧林溶液中周定 24 h~18 h。带规制片,H.E.染色,中性树胶封片，光镜观察。5.3病理变化
5.3.1中枢神经系统典型的组织病理学变化为非化脓性脑存髓炭主要包括大脑,中脑、小脑、延脑和脊髓的变质性变化、血管反应和胶质细躯增尘。5.3.2变砸性变化表现为神经细胞变性和神经组织出现小软化灶。变性的神经细跑扇大.谈染或浓缩，有的呈现中央染色质溶解现象。变性严重的神经细咆和局部神经组织可发生坏死，液化，形成小软化灶。
5.3.3血管反应表现为血管出现以淋巴细胞为主的围管性细胞衰润，浸润的细脑在血管周围散在或呈多层围绕，形成管套。
5.3.4胶质细胞增生表现为增生的胶质细胞可出现在变性神经细胞周围形成卫现象、或进人坏死的神经细胞中吞噬坏死物形成噬神经原现象。在软化灶处有数量不等的胶质细胞增生和案集形成胶质小结。
5.4结巢判定
若 5. 3, 2 ~5. 3. 4 尚时出现时则为非化脓性脑脊髓炎的典型病变,若主要出现 5. 3. 3,而 5. 3. 2 不明时，可能与免装反扇有关，常赋于免鸡摔，还过流行病学、临床症状和组织病理学变化可对AE做出初步诊断，在初步诊断的基础上·进行病薛分离（见第 6章)。
6病毒分离
6.1材料准备
6. 1. 1器材
无菌剪刀、镊子、平血、烧杯、玻璃瓶、组织研磨器、注射器，孵化器，离心机.高压灭菌器、冰柜、生物安全柜等。
6.1.2试剂
生理盐水、青霉素、链霉素。
6.1.3材料
SPF种蛋、SPF鸡。wwW.bzxz.Net
TTTKAONYKACA
6.1.4病料
（可疑）AE病继脑组织（以发病早期为好）。6.2操作方法
6.2.1病料的采集与保存
CB/T 27527--2011
无菌取病维鸡脑组织后应立即处理（见6.2.2)，若暂时不能处理，可十一70冰柜中保存。6,2.2病料处理
将病料无菌称量、研磨，反复冻融3次，用无菌生理盐水溶液作15稀释制成忌液，炸加双抗（双抗终浓度为1000I/mL青每烹，100g/ml链酶素）。样品经4000r/min离心10min，取上清液即自然病维脑组织病毒液，冻存，备用。6.2.3雏鸡接种
取6.2.2处理好的病毒，以0,05mL/羽脑内接种1且龄SIPF雏鸡，待出现AE症状后采血致死，同上述方法取脑研磨、制备+凝得接种病维脑组织病毒液，冻存、备用。6.2.4鸡胚接种
取6.2.3病毒样本，以0.2mL/胚，经卵黄森无菌接种6日龄SPF鸡胚，每份样本至少接种5枚胚，下37C孵化箱内孵育至16日龄收毒、观察鸡胚病变（同时设未接种病料的健康对照距）。收毒时，首先无菌吸取胚液（尿囊液和羊水）、然后观察胚体发育情况；检变胚体、胚脑病变+取胚脑、胃、肠、膜腺称量、研磨.以胚液作1*5稀释.同6.2.2加入双抗、离心，制成鸡胚组织病毒液，即为AE白然发病维鸡第1代胚病毒液（AEVE:）。取AFVE，按照本条上述方法再接种6日龄SPF鸡胚卵黄囊孵化、收毒，检查鸡胚病变、制备第2代还病毒液（AEVEs）。这样连续传代直至传代鸡胚出现病变时，该代鸡还病毒液即可作为病毒鉴定用的AE分离毒病毒液，同时可进行病声某些特性的检测。与健康对照组鸡胚相比，发病鸡胚病变为：胚体活力减弱、发育不良和肌肉萎缩（胚体重减轻）、胞细瓜曲或强直，脑缩，皮下，脑、胃肠水肿出血等，病毒分离后，可通过琼脂免疫扩散试验、中和斌验和间接免疫荧光试验中的任一种方泌进行病毒鉴定(见第7章）。了AE的确诊和病毒监定
7.1琼脂免疫扩散试验
7.1.1器材准备
7. 1. 1. 1 器树
冰箱、天平，90mm直径的平Ⅲ、微量加样器、塑料吸头和打孔器（内径4.0mm，孔间距3.0mm的7孔梅花样金属打孔器）。
7.1.1.2试剂
食脑脊躺炎琼脂免疫扩散试验冻干抗原（1mL/女瓶）、标准阴性血清和阴性血清、氯化、优质琼脂粉、pH7.2.01mol/LPBS(或生理盘水）、蒸馏水利1%硫柳汞溶液(见附录A)。7.1.1.3待检血清
无翅下静脉采血1mL左右：分离血清，一20℃冰箱保存备用。3
TTTKAONTKACA
GB/T 27527--2011
7.1.1.4待检抗原
6.2.4AE分离薛抗原和其他待检抗原。7. 1. 2操作步骤
7.1.2.1琼脂板制备
琼脂板的制备按如下步骤进行：a琼膜液配制:称取优质琼胎粉1.0g，加蒸馏水至100mI.。加热济化后,加人氯化钠18g，充分溶解后,加入1%硫柳汞溶液（终滩度为0.01）,摇约。制板：将琼胎液冷却至17℃～70℃，取洁净、干燥，直径为9G11的灭谢平，放置下无菌工b)
作台内.每个平ⅢL加琼脂被18mL，厚度约为3,0 tmm固后盖严，把平血倒置放入4亡冰箱中保存备用（保存朗2周）。
7. 1. 2. 2打孔
从冰箱内取出琼脂板，用7孔组的梅花形打孔器打孔（中问1孔，外周6孔，见圈1），孔欲4.0mm，孔距3.0mm。将孔中的琼脂轻轻挑出或吸出，勿伤及孔边缘或使琼脂层脱离平血底。图 平孤中梅花形 7 孔一组排列示意图7. 1. 2, 3封底
在酒精灯火焰上通过4次～6次划热平-而底面，使底部琼脂稍微融化即可。7.1.2.4抗原稀释
向1安板抗原内加人PBS(或生理盐水)1 mL,待溶解呈均句混悬亵时即为可使用的AE琼扩抗原液。
7. 1.2.5加样
根据需要和其体条件，可分别应用血清样品或抗原样品按以下处理方式进行加样：a）检验血猎加样：结合图2，用微量加样器吸取抗原液加人中央孔，标“十”的三孔加标阳性血清，1、2、3孔加被检血清，每孔均应加满，但不能溢出。每加个被检样品应换一个吸头图2加样示意图
TTIKANYKACA
GB/T 27527-2011
b）检验抗原加样：结合图2.用微氧加样器吸取标准抗体溶液（AE标准阳性血清)加人中央孔，标“十“的兰孔如标准抗原液，1、2、3孔加待检抗原液，特孔均应加满，但不能溢出，每加一个被检样品应换一个吸头。
7. 1. 2. 6反应
加样完毕,室温静置10 min,放人 22 ~-26 ℃保趣盒内反应,分别在 24 h.48 h和 72 h观察并记录结果。
7.1.3结果判定
7.1.3.1检验血清结果判定
7. 1.3. 1. 1判定前提
将琼脂板昏日光灯或侧强光下观察，在抗原与标准阳性血清孔之间出现一条清晰,致密的沉淀线，抗原与阴性血清孔之间不出现沉淀线，说明对照成立，可进行结果判定：7. 1, 3. 1. 2阳性
标抗原孔与被检血清孔之间形成的沉淀线与阳性对照血清形成的沉淀线弯曲环联，判为阳性（见图3）。
注：标“+\孔为标准阳性血清，1、2、3孔被检血清呈阳性。图 3被检血清呈阳性示意图
7.1.3.1.3可疑
若标准抗原与被检血清孔间不出现沉淀线,而抗原与标准阳性血清孔间的沉淀线在被捡血清孔位管微问内侧弯曲者(见图4中的1号孔),则被检血清判为可疑反应。对该份血清复检,仍为可疑则判为阳性反应。
注；标“十“孔为标难阳性血清,[孔被检血消可疑+2、3孔被检血清明性围4被检血清呈可疑示意图
GB/T 27527—2011
7.1.3,1.4非特异性反应
若标准抗原孔和被检血清孔间的沉淀线粗且浑浊或与抗原孔和标准阳性血清孔之间的沉淀线交叉并直伸待检血消边缘者,则判为非特异性反应,应重做。若仍出现非特异性反成则判为阴性(如图 5 所示第 3孔)。
注：标\十“孔为标准阴性血清，1，2、3孔被检血潜分别为阳性，阴性和非特异性反应，图5被检血清呈非特异性反应示意图7. 1. 3. 1. 5阴性
标准抗原孔与被检血清孔之间无沉淀线，抗原扎标准阳性血清扎问沉淀线直伸延到被检血清孔边缘无弯曲者，则判为阴性（见图6)。注：标\+\孔为标准阳性盘湾，1、2、3托被检血循为阴性血清图6被检血清呈阴性示意图
7. 1.3. 2检验抗原结果判定
7. 1. 3. 2. 1判定前提
将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，在标准抗原与标准阳性血清孔之问出现一条清晰、致密的淀线，标准阳性血清孔与阴性抗原孔之间不出现沉淀线，说明对照成立，可进行结果判定。7.1. 3.2.2阳性、可凝、非特异性反应和阴性结果的判定原理和方法同7.1.3.1。7.2中和试验
7.2.1材料准备
7. 2. 1. 仪器
孵化器等。
7.2.1.2材料
SPF鸡胚、AE标准阳性血清、AE阴性血清、PBS（见附录A）。7.2.1.3病毒样品
6.2.4收获的待赖AE分离毒病毒液。7.2.2．操作方法
7. 2.2. 1病毒滴度(EIDs)测定
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将待检病荐被作10倍系列稀释至10-110\，分装到两列无菌试管中，第-列8管各加人等量AE阴性血清（对照组），第二列8管各加入等量AE标准阳非血清（试验组），握勾斥置37℃1h，然后每管分别卵黄衰接种6日龄SPF鸡胚各5枚（0.2mL/胚），继续孵化至16日龄，剖检、记录各组病变鸡胚数(感染发病胚病变判定标准见6.2.4)，分别计算两组的EID)：7. 2. 2. 2中和指数计算
待检病毒液的中和指数按式(1)计算：X-W/Y
式中：
X-中和指数;
W试验组EIDa
对照组 EIDs 。
7. 2. 3结果判定
中和指数小于10判为阴性.1050为而疑，大于50判为阳性，7.3间接免疫荧光试验
材料准备
7.3. 1.1墨材
荧光显微镜和冰冻切片机。
7.3.1,2试剂
FITC标记兔抗鸡IgG抗体、标准阻性血清、阴性血清（SPF鸡血清）、无水乙醇和丙酮。7.3. 1. 3组织样品
AE箍鸡脑组织样品、健康对照雏鸡（阴性)脑组织样品和待检脑组织品。7.3.2操作方法
7.3.2.1冰冻组织切片制备
取AE脑组织样品、阴性脑组织样品和待检禽脑组织样品或十二指肠样品，分别覆以冷冻固定剂，一70固定过夜。次月，取出，经冰冻切片机切片，将组织切片置载玻片上，用一20℃预冷的丙酮乙醇（3：2）固定液室温周定5min～10min。7
GB/T 27527—2011
7. 3. 2.2
间接免疫荧光检测
将固定好的组织切片，PBS洗3次，加上标准阳性血清，SPF鸡血清答100μ/块维织，于37温育30min后用PBS洗漆3饮，如人FITC标记免抗鸡IgG抗体，置37℃温育30min，经PBS洗涤3次后在荧光显微镜下观察。
7. 3. 3结果判定
7.3.3.1判定前捉
AE脑组织切片与阳性血清作用,出现明亮绿色荧光,而 AE脑组织切片与阴性血清作用以及阴性脑组织切片与阳性血清作用均无竟绿色荧光，则对照成立,结果可以判定。7. 3. 3. 2
判定标准
被检组织的细胞浆中出现亮绿色荧光者，判为阳性，否则判为阴性。0
附录A
（规范性附录）
琼脂免疫扩散试验用溶液的配制pH7.2 0.01mol/L. 磷酸盐缓冲溶液(PBS)的配制磷酸氢二钠(Na2HPO12H:0)
磷酸一氨钠(NaH.P()）
氯化钠（NaCl)
加蒸馏水至
用玺氧化钠(NaOH)或盐酸（HC1)调pH至7.2.灭菌或过滤。注：PBS-经使用，F4C保存不题过3周21%硫柳汞溶液的配制
硫柳汞
加蒸馏水至
溶解过滤后，置100mL瓶中盖，4℃存放备用：GB/T27527-2011
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