GB/T 27533-2011
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GB/T 27533-2011 犬细小病毒病诊断技术
GB/T27533-2011
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ICs 11. 220
中华人民共和国国家标准
GB/T27533—2011
犬细小病毒病诊断技术
Diagnostic techniques for canine parvovirus disease2011-11-21发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2012-03-01实施
本标准的录A和附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。GB/T27533—2011
本标准起草单位：青农业大学动物科技学院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局，本标准主要起草人：单虎、温建新、熊炜、黄、案晓冰、于程。I
TTKONKACA
1范围
犬细小病毒病诊断技术
GB/T 27533—20t1
本标准规定了犬细小病毒病的临床检查、血凝与血凝抑制试验、[CR检测的操作方法。本标准适用于犬细小病毒病的鉴定及其流行病学调查、诊断和监测。其中病毒分离、血凝与血凝抑制试验、PCR检测适用于犬细小病毒病的病原诊断。2试拥和材料
2.1FK81细胞（猫肾细胞）。
2.20.9%生理盐水：配制参见附录A中A.1。2.31为猪红细胞液：配制参见附录A中A.2。2.4犬细小病酶阳性血清。
2.596孔*\形微量反应板。
2.6Tag酶及10倍Taq酵反应缓冲液：Taq酶浓度为5U/μL，—20℃保存。2.71. 5 mL Eppendorf 管.
2. B D. 2 mL PCR 薄壁管.
2.9dNTP.含dCTP,dGTP,dATP、dTTP各10mmal/L，一2o保存2.10引物：浓度为20μmo1/L，其序列如下：上游引物(CPVF) :5'GAA TCT GCT ACT CAG CCA CCA AC 3';下游物(CPVR):5'GTG CAC TAT AAC CAA CCT CAG C 3'。2. 11 10%十二烷基硫酸钠:配制参见附录 A。2.12蛋白酶K贮备液：配制参见附录A中A.4。2.135×TBE电泳缓冲液：配制参见附录A中A.6。3器材和设备
3.1PCR仪。
3.2高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000g以上。3.3水平电泳仪。
3.4胶成像系统。
4临床检查
4.1临床特征
4.1.1潜伏期1周到2周，病初无任何症状，食欲减退或废绝，体温40以上，粉红色黏稠血样物，4.1.2病犬先出现呕吐，呕吐出白色泡沫或黄色液体，继而腹泻，粪便稀薄而恶臭，剧烈的腹泻呈喷射状，粪便是红色，混有大量黏液或假膜。后期排番茄汁样瓣便，并有特殊的腥臭味。4、1.3患犬迅速消瘦，倦卧不起，目光呆滞，服窝下陷，腹国紧缩，机体脱水，皮肤干燥、弹性降低。4. 2病理变化
4.2.1心脏肿大呈灰黄色，切面外翻，质地松软，心肌有出血性斑纹。4.2.2肝胜肿大，包膜张，多呈黄裙色，质地松软有局灶性坏死，断面有豆蔻状花纹。4.2.3胃空虚，黏膜轻度潮红，附有大量黏液；小肠壁增厚，肠管变粗，肠腔狭窄，形成厚层黏膜皱褶，易1
TTTKANTKACA
GB/T 27533-—2011
于剥落，肠腔内充满紫红色粥样内容物并混有血凝块。4.3判定
若临床症状符合4.1. 1或4.1.2且出现4.2.1或4.2.3的病理变化,则可判定疑似犬细小病毒病，其他临床症状和病理变化可作为参考指标；疑似病例可采用血凝与血凝抑制试验或PCR检测进行确诊。
5血凝与血凝抑制试验
5. 1血凝试验(HA)的操作方法
5.1.1样品采集活犬的相液、鼻液、唾液、粪便，病死犬的肝、肿脾、肺等组织器官。将待检组织粪便样品加等体积生理盐水研磨勾浆，3000g离心15min，收集上清液待检；口腔拭子、粪拭子用少量生理盐水浸润后，取上清液待检。
5.1.2在96孔*\形微量反应板上进行，白左至右各孔加100 μL生理盐水。5.1.3于左衡第1孔加50μl待检样品于1.5mLEppendorf管，混合均勾后，吸50μL至第2孔，混合均匀后，吸50μL至第3孔，依次倍比稀释，至第11孔，吸弃50μL，稀释后病毒稀释度为第1孔1：2,第2孔14,第3孔1·8..·最后12孔为对照。5.1.4由左至右依次向各孔加1%猪红细胞悬液50μL置微型混合器上摄荡，使血球与病毒充分混合，在37C温箱中作用15min～30min后，待对照红细胞已沉淀可观察结果。5.1.5判定结果：以100%凝集（血球呈题粒性伞状凝集沉于孔底)的病牵最大稀释孔为该病毒血凝价，即一个凝渠单位，不凝集者红细胞沉于孔底呈点状。5.2血抑制试验(HI)的操作方法
5.2.1根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配成4个血凝单位病毒溶液。5.2.2在96孔\v形微量板上进行，用固定病毒稀释血清法，自第1孔至第10孔各加50μL生理盐水,11和12孔分别为4单位CPV细胞病毒培养液和抗犬细小病毒阳性血对照。5.2.3第1孔加犬细小病毒阳性血清50，混合均匀，吸50μL至第1孔，依此借比稀释至第10孔，吸弃 50μL,如此稀释后血清浓度为第1孔1:2,第 2孔 1：4,第 3孔1:8*5.2.4由第1孔至11孔各加50μL，4单位待测病毒液，第12孔50μL血清，混合均勺、置37C温箱再作用15min~30min，待4单位病毒已凝集红缩胞可观察结果。5.2.5判定结果，被已知犬细小病毒阳性血清抑制血凝者，该病毒为犬细小病毒。6PCR检
6.1病料的采集及处理
采集的样品包括犬的润液、鼻液、唾液、粪便及病死犬的肝、脾、肺等组织器官。将待检组织或粪便样品加等体积生理盐水研磨匀浆，3000g离心15min，收集上消液待检。口腔拭子、粪拭子用少盘生理盐水没润后，取上清液待检。经细胞病原分离培养的样品，收集细胞沉淀待检。CPV阳性对照样品和期性对照样品的同样处理。
6.2LNA 抽提
敢上猜液465μL，加入25uL10%十二烷基硫酸钠和10μL的20mg/mL蛋白酶K，50C水裕播床上放置2h，加人等量的饱和酸溶液500μL，摄菇混匀20s，12000g离心5mia，取上清液，加人等量的酚*三氯甲烷：异戊醇(25 24：1),振药混勾 20 5,12 000g离心5 min,取上清液,再加入等量的三氮甲烷1异戊醇（24：1），振荡混射20，12000g离心5min，取上液；最后加人两借体积的无水乙醇，上下颠倒涯勾，12000g离心10min弃上清，室温干燥后，加人50μL双蒸水溶解沉旋，即得DNA模板，一20℃贮存备用，CPV阳性对照样品和阴性对照样品与待检样品同步进行样品处理，并进行DNA抽提。另外，DNA抽提也可采用市售的商品化DNA抽提试剂盒进行。2bZxz.net
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6.3PCR检测
GB/T27533—2011
在0.2mLPCR薄壁管中，按每个样品10倍Taq酶浓缩缓冲液2.5uL、dNTP0.5μL、Tag酶0. 5 μL,DNA模板 2 μL,上游引物和下游引物(CPVF,CPVR)各 0. 5 μL,兰蒸水 18. 5 μL,配制PCR 检测体系。将PCR管置PCR仪上按如下程序扩增：首先94C变性2min再94C、30s，55C、30s，72 C,40 s 进行 35 个循环;最后 72 ℃,3 min. 用 TBE 电泳缓冲液配制 1. 5%的琼脂糖平板(含0. 5μg/mL EB),参见附录 A中 A.7,特平板避人水平电泳仪,使电泳缓冲液刚好没过胶面,10 μLPCR产物和2μL加样缓冲液（6X），参见附录A中A.8，混勾后加人样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照。5 V/crn 电泳约 30 min,当漠酚蓝到达底部时停止,用凝胶成像系统观察结果。6.4结果判定
6.4.1经PCR检测，CPV阳性对样品可扩增出大小为609bp的核醛片毁，参见附录B，耳阴性对照样品无扩增条带，否则试验绪果视为无效。6,4.2在符合6,4.1的条件下，若待检样品扩增出了大小为609 bp的核酸片段，则初步判定犬细小病毒核酸阳性1若待检样品无扩增条带或扩增条带大小不为609bp，则判定犬细小病毒核酸阴性。6.4.3待检样品扩增出的阳性基因片段应进行核酸序列测定，若其序列与提供的比对序列的同源性大于等于90%,则可确诊为犬细小病毒核酸阳性，否则判定犬细小病毒核酸阴性。6.4.4若犬细小病毒核酸阳性且病原分离也呈阳性,则可判犬细小病毒感染阳性。3
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GB/T 27533—2011
A10.9%生理盐水
附录A
(资料性附录)
试剂及其配制
取9g无水氯化钠洛于1000tL去离子水中配成0.9%生理盐水，121.3℃灭菌15min。A.21%猪红细胞液
1mL新鲜肝紊抗疑猪血加人9mL灭菌生理盐水制备而成。制备好后最好立即使用。暂时不用可放置4℃冰箱保存。
A,3CPV细胞培养液
CPV接种FKB1细胞，培养3d~5d，当病变达60%~80%时收获。冻融三饮或超声被处理后，低速离心去除细胞碎片，上清液分装后低温保存，A.410%十二烷基硫酸钠(SDS)
在90mL三蒸水中溶解10g十二烷基硫酸钠（电泳级），加热至60C助溶，用盐酸调pH值至7.8加三蒸水定容至100mL。
A,5蛋白酶区备液(20 mg/mL)
每升三蒸水中入三羟甲基氨基甲烷（Tris)1.21mg,乙二胺四乙酸(F0TA)1.86mg，十二烷基巯酸钠(SDS)5g,用盐酸调 pH值至 7.8。取该猝获按每毫升加入 20mg蛋白酶K充分溶解后分装。A.65×TBE电泳缓冲液
每升三蒸水中加人三羟甲基氮基甲烷(Tris)54.0g，乙二胺四乙龄（EDTA)2.9mg，翻酸27.5g；用 5 加ol/L的盐酸调 pH 值至8. 0。A,7 EB 核酸染色剂
在10mL三蒸水中加人100mg漠化乙锭(EB)配制成10mg/mL.的缩液。A 8加样缓冲液(6×)
每100mL三蒸水中加人溴酚蓝0.25g和蔗糖40g。4
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附录B
(资料性随录）
犬细小病毒 PCR 扩增核酸片段参考序列Baatctgeta ctcagccacc aactazagtt tataataatg atttaactgcatcattgatg gttgcattag atagtaataa tactatgcca tttactccagcagctatgag atctgagaca ttgggttttt atccatggaa accaaccataccaactccat ggagattta ttttcaatgg gatagaacat taataccatctcatactgga actagtggca caccaacaaa tatataccat ggtacagatecagatgatgt tcaattetat actattgaaa attctgtgcc agtacacttactgagaacag gtgatgaatt tgctacagga acattttttt ttgatiglaaaccatgtaga ctaacacata catggcaaac aaatagagca ttgggcttaccaccatttct iaattctttg cctcaagctg aaggaggtac taactttggtccatttct aaattctttg cctcaagctg aggaggtac taactttggttatataggag ttcaacaaga taaaagacgt ggtgtaactc aaatgggaatacaaactat atcactgaag ctactattat gagaccagct gaggttggttatagtgcac
GB/T27533—2011
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中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2012-03-01实施
本标准的录A和附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。GB/T27533—2011
本标准起草单位：青农业大学动物科技学院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局，本标准主要起草人：单虎、温建新、熊炜、黄、案晓冰、于程。I
TTKONKACA
1范围
犬细小病毒病诊断技术
GB/T 27533—20t1
本标准规定了犬细小病毒病的临床检查、血凝与血凝抑制试验、[CR检测的操作方法。本标准适用于犬细小病毒病的鉴定及其流行病学调查、诊断和监测。其中病毒分离、血凝与血凝抑制试验、PCR检测适用于犬细小病毒病的病原诊断。2试拥和材料
2.1FK81细胞（猫肾细胞）。
2.20.9%生理盐水：配制参见附录A中A.1。2.31为猪红细胞液：配制参见附录A中A.2。2.4犬细小病酶阳性血清。
2.596孔*\形微量反应板。
2.6Tag酶及10倍Taq酵反应缓冲液：Taq酶浓度为5U/μL，—20℃保存。2.71. 5 mL Eppendorf 管.
2. B D. 2 mL PCR 薄壁管.
2.9dNTP.含dCTP,dGTP,dATP、dTTP各10mmal/L，一2o保存2.10引物：浓度为20μmo1/L，其序列如下：上游引物(CPVF) :5'GAA TCT GCT ACT CAG CCA CCA AC 3';下游物(CPVR):5'GTG CAC TAT AAC CAA CCT CAG C 3'。2. 11 10%十二烷基硫酸钠:配制参见附录 A。2.12蛋白酶K贮备液：配制参见附录A中A.4。2.135×TBE电泳缓冲液：配制参见附录A中A.6。3器材和设备
3.1PCR仪。
3.2高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000g以上。3.3水平电泳仪。
3.4胶成像系统。
4临床检查
4.1临床特征
4.1.1潜伏期1周到2周，病初无任何症状，食欲减退或废绝，体温40以上，粉红色黏稠血样物，4.1.2病犬先出现呕吐，呕吐出白色泡沫或黄色液体，继而腹泻，粪便稀薄而恶臭，剧烈的腹泻呈喷射状，粪便是红色，混有大量黏液或假膜。后期排番茄汁样瓣便，并有特殊的腥臭味。4、1.3患犬迅速消瘦，倦卧不起，目光呆滞，服窝下陷，腹国紧缩，机体脱水，皮肤干燥、弹性降低。4. 2病理变化
4.2.1心脏肿大呈灰黄色，切面外翻，质地松软，心肌有出血性斑纹。4.2.2肝胜肿大，包膜张，多呈黄裙色，质地松软有局灶性坏死，断面有豆蔻状花纹。4.2.3胃空虚，黏膜轻度潮红，附有大量黏液；小肠壁增厚，肠管变粗，肠腔狭窄，形成厚层黏膜皱褶，易1
TTTKANTKACA
GB/T 27533-—2011
于剥落，肠腔内充满紫红色粥样内容物并混有血凝块。4.3判定
若临床症状符合4.1. 1或4.1.2且出现4.2.1或4.2.3的病理变化,则可判定疑似犬细小病毒病，其他临床症状和病理变化可作为参考指标；疑似病例可采用血凝与血凝抑制试验或PCR检测进行确诊。
5血凝与血凝抑制试验
5. 1血凝试验(HA)的操作方法
5.1.1样品采集活犬的相液、鼻液、唾液、粪便，病死犬的肝、肿脾、肺等组织器官。将待检组织粪便样品加等体积生理盐水研磨勾浆，3000g离心15min，收集上清液待检；口腔拭子、粪拭子用少量生理盐水浸润后，取上清液待检。
5.1.2在96孔*\形微量反应板上进行，白左至右各孔加100 μL生理盐水。5.1.3于左衡第1孔加50μl待检样品于1.5mLEppendorf管，混合均勾后，吸50μL至第2孔，混合均匀后，吸50μL至第3孔，依次倍比稀释，至第11孔，吸弃50μL，稀释后病毒稀释度为第1孔1：2,第2孔14,第3孔1·8..·最后12孔为对照。5.1.4由左至右依次向各孔加1%猪红细胞悬液50μL置微型混合器上摄荡，使血球与病毒充分混合，在37C温箱中作用15min～30min后，待对照红细胞已沉淀可观察结果。5.1.5判定结果：以100%凝集（血球呈题粒性伞状凝集沉于孔底)的病牵最大稀释孔为该病毒血凝价，即一个凝渠单位，不凝集者红细胞沉于孔底呈点状。5.2血抑制试验(HI)的操作方法
5.2.1根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配成4个血凝单位病毒溶液。5.2.2在96孔\v形微量板上进行，用固定病毒稀释血清法，自第1孔至第10孔各加50μL生理盐水,11和12孔分别为4单位CPV细胞病毒培养液和抗犬细小病毒阳性血对照。5.2.3第1孔加犬细小病毒阳性血清50，混合均匀，吸50μL至第1孔，依此借比稀释至第10孔，吸弃 50μL,如此稀释后血清浓度为第1孔1:2,第 2孔 1：4,第 3孔1:8*5.2.4由第1孔至11孔各加50μL，4单位待测病毒液，第12孔50μL血清，混合均勺、置37C温箱再作用15min~30min，待4单位病毒已凝集红缩胞可观察结果。5.2.5判定结果，被已知犬细小病毒阳性血清抑制血凝者，该病毒为犬细小病毒。6PCR检
6.1病料的采集及处理
采集的样品包括犬的润液、鼻液、唾液、粪便及病死犬的肝、脾、肺等组织器官。将待检组织或粪便样品加等体积生理盐水研磨匀浆，3000g离心15min，收集上消液待检。口腔拭子、粪拭子用少盘生理盐水没润后，取上清液待检。经细胞病原分离培养的样品，收集细胞沉淀待检。CPV阳性对照样品和期性对照样品的同样处理。
6.2LNA 抽提
敢上猜液465μL，加入25uL10%十二烷基硫酸钠和10μL的20mg/mL蛋白酶K，50C水裕播床上放置2h，加人等量的饱和酸溶液500μL，摄菇混匀20s，12000g离心5mia，取上清液，加人等量的酚*三氯甲烷：异戊醇(25 24：1),振药混勾 20 5,12 000g离心5 min,取上清液,再加入等量的三氮甲烷1异戊醇（24：1），振荡混射20，12000g离心5min，取上液；最后加人两借体积的无水乙醇，上下颠倒涯勾，12000g离心10min弃上清，室温干燥后，加人50μL双蒸水溶解沉旋，即得DNA模板，一20℃贮存备用，CPV阳性对照样品和阴性对照样品与待检样品同步进行样品处理，并进行DNA抽提。另外，DNA抽提也可采用市售的商品化DNA抽提试剂盒进行。2bZxz.net
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6.3PCR检测
GB/T27533—2011
在0.2mLPCR薄壁管中，按每个样品10倍Taq酶浓缩缓冲液2.5uL、dNTP0.5μL、Tag酶0. 5 μL,DNA模板 2 μL,上游引物和下游引物(CPVF,CPVR)各 0. 5 μL,兰蒸水 18. 5 μL,配制PCR 检测体系。将PCR管置PCR仪上按如下程序扩增：首先94C变性2min再94C、30s，55C、30s，72 C,40 s 进行 35 个循环;最后 72 ℃,3 min. 用 TBE 电泳缓冲液配制 1. 5%的琼脂糖平板(含0. 5μg/mL EB),参见附录 A中 A.7,特平板避人水平电泳仪,使电泳缓冲液刚好没过胶面,10 μLPCR产物和2μL加样缓冲液（6X），参见附录A中A.8，混勾后加人样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照。5 V/crn 电泳约 30 min,当漠酚蓝到达底部时停止,用凝胶成像系统观察结果。6.4结果判定
6.4.1经PCR检测，CPV阳性对样品可扩增出大小为609bp的核醛片毁，参见附录B，耳阴性对照样品无扩增条带，否则试验绪果视为无效。6,4.2在符合6,4.1的条件下，若待检样品扩增出了大小为609 bp的核酸片段，则初步判定犬细小病毒核酸阳性1若待检样品无扩增条带或扩增条带大小不为609bp，则判定犬细小病毒核酸阴性。6.4.3待检样品扩增出的阳性基因片段应进行核酸序列测定，若其序列与提供的比对序列的同源性大于等于90%,则可确诊为犬细小病毒核酸阳性，否则判定犬细小病毒核酸阴性。6.4.4若犬细小病毒核酸阳性且病原分离也呈阳性,则可判犬细小病毒感染阳性。3
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A10.9%生理盐水
附录A
(资料性附录)
试剂及其配制
取9g无水氯化钠洛于1000tL去离子水中配成0.9%生理盐水，121.3℃灭菌15min。A.21%猪红细胞液
1mL新鲜肝紊抗疑猪血加人9mL灭菌生理盐水制备而成。制备好后最好立即使用。暂时不用可放置4℃冰箱保存。
A,3CPV细胞培养液
CPV接种FKB1细胞，培养3d~5d，当病变达60%~80%时收获。冻融三饮或超声被处理后，低速离心去除细胞碎片，上清液分装后低温保存，A.410%十二烷基硫酸钠(SDS)
在90mL三蒸水中溶解10g十二烷基硫酸钠（电泳级），加热至60C助溶，用盐酸调pH值至7.8加三蒸水定容至100mL。
A,5蛋白酶区备液(20 mg/mL)
每升三蒸水中入三羟甲基氨基甲烷（Tris)1.21mg,乙二胺四乙酸(F0TA)1.86mg，十二烷基巯酸钠(SDS)5g,用盐酸调 pH值至 7.8。取该猝获按每毫升加入 20mg蛋白酶K充分溶解后分装。A.65×TBE电泳缓冲液
每升三蒸水中加人三羟甲基氮基甲烷(Tris)54.0g，乙二胺四乙龄（EDTA)2.9mg，翻酸27.5g；用 5 加ol/L的盐酸调 pH 值至8. 0。A,7 EB 核酸染色剂
在10mL三蒸水中加人100mg漠化乙锭(EB)配制成10mg/mL.的缩液。A 8加样缓冲液(6×)
每100mL三蒸水中加人溴酚蓝0.25g和蔗糖40g。4
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附录B
(资料性随录）
犬细小病毒 PCR 扩增核酸片段参考序列Baatctgeta ctcagccacc aactazagtt tataataatg atttaactgcatcattgatg gttgcattag atagtaataa tactatgcca tttactccagcagctatgag atctgagaca ttgggttttt atccatggaa accaaccataccaactccat ggagattta ttttcaatgg gatagaacat taataccatctcatactgga actagtggca caccaacaaa tatataccat ggtacagatecagatgatgt tcaattetat actattgaaa attctgtgcc agtacacttactgagaacag gtgatgaatt tgctacagga acattttttt ttgatiglaaaccatgtaga ctaacacata catggcaaac aaatagagca ttgggcttaccaccatttct iaattctttg cctcaagctg aaggaggtac taactttggtccatttct aaattctttg cctcaagctg aggaggtac taactttggttatataggag ttcaacaaga taaaagacgt ggtgtaactc aaatgggaatacaaactat atcactgaag ctactattat gagaccagct gaggttggttatagtgcac
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