GB/T 27536-2011
基本信息
标准号： GB/T 27536-2011
中文名称：猪流感病毒分离与鉴定方法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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标准简介
GB/T 27536-2011 猪流感病毒分离与鉴定方法
GB/T27536-2011
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标准内容
ICS11.220
中华人民共和国国家标
GB/T 27536—2011
猪流感病毒分离与鉴定方法
Isolation and identification of swine influenza virus2011-11-21 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2012-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，本标准主要起草人，乔传玲、杨焕良、陈艳、辛晓光、陈化兰。TTKANYKACA
GB/T27536—2011
1范围
猪流感病毒分离与鉴定方法
本标准规定了猪流感病毒分离与鉴定方法。本标准适用于各种亚型猪流感的病原分离和鉴定。2试验材料、试剂
2. 1 剪刀,镊子。
2. 2 1 tml. 注射器。
2.3单道及多道微量移液器吸头。2. 4 9~-11 日龄 SPF 鸡胚。
2.5犬肾细胞(MDCK）
2.66孔培养板。
2.7DMEM培养基。
HEPES缓冲液(lmoI/L储存液）。2.8
眙牛血清。
TPCK-胰蛋白酵（胰蛋白酶经TPCK处理）。0.01mol/LpH7.0~7.4磷酸盐缓冲减(PBS)(参见附录A中A.1),磷酸盐缓冲液(pH5.9)(琴见附录A中A,5)。0.85%生理盐水（参见附录A中A.2)。2. 13bZxz.net
阿氏（Alsevers)液（参见附录A中A，3）。2.150.5%红细胞悬液（参见附录A中A.4)。2. 16
胎球蛋白(参见附录 A 中 A. 6)。过碘酸盐（参见附录A中A.7)。
亚碎酸盐(参见附录 A中 A,8)。硫代巴比要酸(参见附录 A 中 A. 9)。无菌蒸馏水或去离子水。
3仪器
GB/T 27536—2011
3.1生物安全柜（内负压，有HEPA过滤器可避免细胞培养物污染及保护操作人员安全），3.2孵化器。
3.3CO.培养箱，
3.4台式高建冷冻离心机。
3.537C水浴加热器。
3.6煮沸锅。
3.7棉拭子(医用棉签）。
3.8研磨幕。
TTTKANTKACA
GB/T 27536—2011
4样品采集与处理
4.1样品的来巢
病死猪，取肺脏或气管分泌物：待检括猪，用棉拭子（医用梯签)采集鼻腔深部分秘物。4.2样品的保存
样品应置于特定的样品保存液中进行保存。一般采用磷酸盐缓冲液（pH7.0~7.4,0.01o1/L）0.85%生理盐水或者不含血湾的细胞培养液作为保存（含青霉素2000IU/mL,链霉素20D0IU/mL、制毒菌素1000IU/mL，牛血清白蛋白5mg/mL）。样品采巢后应置于加冰的保温箱中、密封，24 h内送至实验室进行处理或叠一70 保存。4.3样品的处理
用剪刀采组织病料置于研磨器中，按质量体积比（1：1）加人样品保存液进行研磨将棉拭子置于装有1mL样品保存获的离心管中，用子充分统压后弃去拭子。以上样品室温静置作用min，4℃30001/min离心5min，取上清作为接种材料。5样品接种
5.1鸡胚培养
1 mL 注射器吸取处理好的样品,以 0. 2 mL/胚的量经尿囊腔和羊膜腔途径接种 9 ~11 甘龄 SPF鸡胚,每个样品接种 3 个胚,于 35 C～~37 C孵化箱内孵育 72 h~96 h+弃去 24 h 内死亡鸡胚。孵化至96h将鸡胚制冷后，无菌收取24h以后死亡鸡胚及96h仍存活鸡胚的尿囊液和羊水。5.2细胞培养
在生物安全柜中操作，将60%～80%长满单层的MDCK细胞的6孔细胞培养板用细胞培养液（不含胎牛血清+含有TFCK处理的胰酶2μg/mL的DMEM培养基>洗三次，加人适量的处理样品.置于5%CO，,37C培养箱中培养1h～2h，期间每隔30min轻轻播动一次。感作完毕，弃去感作物，用含有胰酶的培养液洗三次，加人适量的细胞维持液，5%COz，37℃培养箱内继续培养5d～7d,期间观察细胞病变（CPE）的形成博况。如出现CPE（特征病变为：细胞肿胀圆化，细胞间膜增大，细胞核固缩或破製，严重时细胞部分或全部脱落），收集细胞培养上清。5.3结果判定
收获鸡胚液或细胞培养上清、测定其血凝活性（具体操作见6.1）。若HA反应阳性说明可能有粘病毒科的病率，应采用HA-HI试验进行凝素亚型的鉴定：若无血凝活性或血凝价很循，应育传3～5代，。若仍阴性，则认为病毒分离阴性。6亚型鉴定
6. 1 HA 试验
6. 1. 1 在微量反应板的 1 ~12 孔均加人 0. 05 mL PBS,换吸头 。6. 1.2吸取0.05mL待鉴定病毒液，加人第1孔，反复抽打3～5次混匀。2
TTTKANTKACA
GB/T27536—2011
6.1.3从第1孔吸取0.05mL病毒液加人第2孔.混句后吸联0.05tmL加人第3孔.如此进行对倍稀释至第 11孔,从第 11扎吸取 U.05 mL弃之,换吸头。第 12作为红细胞对照。6.1.4每孔均加人0.05mL0.5%（体积分数)鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分播匀后加人)。6.1.5轻轻混勾，室温（20℃~25℃）下静置10min30min后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。对照孔红细胞显著呈钮拆状时判定结果。6.1.6结果判定：将反应板倾斜45°，观察红细若没有呈沮滴状流满，则判为HA阳性完全血避（不流）的病毒最高稀释倍数为病毒的HA效价（血凝单位用HAU表示）。反之，判为HA阴性。6.2HI盘验
6.2.1标定参考毒株抗原及特签定病毒分别为4HAU(25μL)。6.2.2在微量反应板的第1~1I孔加入0.025mlPBS，第12孔加入0.05mLPBS。6.2.3加0.025mL标准阳性血清至第1孔，充分混匀后吸出0.025mL于第2孔，侬次对倍稀释至第1I 孔,从第 11 孔吸取 0.025 mL 弃去。6.2.41~11孔均分别加人0.025mL4HAU参考率株抗原及待鉴定病毒，第12孔作为红细胞对照。室温(20 ℃～25℃)下静置10 min~30 min。6.2.5每孔均加人0.05mL0.5%（体积分数)鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分播勾后人）)，轻轻混匀,室温（20℃~25℃)下静置10min~30min后，观结果《对照孔红细胸显著皇钮扣状时判定结果）。6.2.结果判定，按照HA试验进行结果判定。如果待鉴定病毒样品的血凝活性被这一亚型阳性血清所抑制，则该样品判为这一血凝素亚型阳性。（检测结果成立的条件：已知抗原与相应的阳性血清反应后出现预期的H1效价，同时抗原的反馈标定结果均为4HAU，反之试验重新进行。）6. 3NI 试验(全量法以 N1 和 N2 分型血清为例）6.3.1将N1,N2标准阳性血清和阴性血清分别按原液、10倍、100借稀释，并分别加人标记好的相应试中，
6.3.2将已经确定HA亚型的待检病毒液稀至HA价为16HAU,每管均加人0.05tL,混勾37C永浴1h，
6.3.3每管加人的胎球蛋白溶液（50mg/ml)0.1mL，混勺，拧上盖后37C水浴16h~~18h。6.3.4室温冷却后，每管加人0.1tmL过碘酸盐混匀，室温静置20min。6.3.5每管加入1ml.砷试剂（参见附录A中A8)，振荡至棕色消失，乳白色出现。6.3.6每管加入2.5mL硫代凸比要酸试剂（参见附录A中A,9）,将试管量煮沸的水浴中15min,不出现粉红色的为神经氨酸酶抑制阳性，即待检病毒的神经氢酸酶亚型与加人管中的标准神经氨酸酶分型血清亚型一致。
7注意事项
7. 1标准抗原稀释液浓度为4个HAU,并且在每次试验前进行标定。7.2孵育时间要严格控制。红细胞对照完全沉淀时要迅速判读。在-些病毒株中可见红细胞从病毒中解脱，如果有这种情况的发生，要提前判定或置4℃下孵育。7.3红细胞悬液始终符合标准，
7.4反应试剂要按规定保存和使用。为避免反复冻融和细菌污染，应以无菌操作将试剂分装成小包装。
7.5冻于的试剂应按照说明书中规定的体积重新溶解并保存。7.6操作过程生物安全注意事项见附录B3
TTTKAONATKACA
GB/T27536—2011
A. 1 0. 0T mol/L pH7.0~7. 4PBSNacl
灭葡双蒸水
800 mL
谢录鑫
（资料性附录）
相关试剂的配制
NaOH 或者 HC1 调 pH7. 0~-7. 4,灭菌双蒸水加至 1 000 mL 定容,121 C高压灭菌 15 min 或过滤除菌。
A.20.85%生理盐水
NaCl 名. 5 g,加灭菌双蒸水 1 000 mL 定容,121 ℃高压灭菌 15 min 或过滤除菌。A. 3阿氏(Alsevers)液
葡萄糖
柠橡酸钠
柠檬酸
氯化钠
灭菌双蒸水
NaOH或者 HCI
至100mL
121℃高压火菌15min，2～8℃保存备用。A40.5%红细胞最液
采集SPF公鸡或无流和新城接等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合,用PBS液洗涤3 次,以 3 000 1/min 离心 5 min,洗涤后用 PBS 配成 0. 5%体积分数)红细胞悬液,2 C ~8 C保存备用。
A 5 PBS.PH5.9
A溶滋[0.4mol/L.磷酸二氢钠(NaH2PO,)]:称取27.6gNaH,PO，溶于500mL去离子水中。B液[0.4mo1/L磷酸氢二钠(NazHPO,）]：称取28.4名NaHPO,于500mL去离子水中，取81mL液A,19mL溶液B混勾配成0.4mol/LPBS，pH5.9。如果需要，用适当的溶液A或B调pH值。室温保存，
TTKNTKACA
胎球蛋自（底物）
胎球蛋白
PBS,pH5.9
去离子水
分装成5 mL，—20 保存。
过碘酸盐溶液
过酸钠
去离子水
GB/T 27536—2011
加热溶解，室温冷却后加62mL85%正磷酸混匀，暨棕色瓶中，室温，避光保存。砷试剂
亚碑酸钠
无水硫酸钠
去离子永
100 mL
加热溶解,室温冷却后加 0. 3 mL浓硫酸,室温保存。A.9硫代巴比妥酸
无水硫酸钠
硫代巴比妥酸
去离子水
200 mL
水中加热溶解，室温保存。据硫代巴比妥酸的质量，一般配好10h后溶液中出现沉淀，因此该溶液要使用前配盘。
CB/T 27536-2011
附录B
（规范性附录）
生物安全注意事项
B.1所有的操作过程应在生物安全二级（biologysecuritylevel2：能够安全操作，对实验室工作人员和动物致病性低的，对环境有轻微危害的病原微生物的生物安全水平)实验室中进行，2亚型鉴定要求有全套的流感病毒血凝素(HA)分型血清和神经氨酸酶(NA.)分型血清。B.2
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中华人民共和国国家标
GB/T 27536—2011
猪流感病毒分离与鉴定方法
Isolation and identification of swine influenza virus2011-11-21 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2012-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，本标准主要起草人，乔传玲、杨焕良、陈艳、辛晓光、陈化兰。TTKANYKACA
GB/T27536—2011
1范围
猪流感病毒分离与鉴定方法
本标准规定了猪流感病毒分离与鉴定方法。本标准适用于各种亚型猪流感的病原分离和鉴定。2试验材料、试剂
2. 1 剪刀,镊子。
2. 2 1 tml. 注射器。
2.3单道及多道微量移液器吸头。2. 4 9~-11 日龄 SPF 鸡胚。
2.5犬肾细胞(MDCK）
2.66孔培养板。
2.7DMEM培养基。
HEPES缓冲液(lmoI/L储存液）。2.8
眙牛血清。
TPCK-胰蛋白酵（胰蛋白酶经TPCK处理）。0.01mol/LpH7.0~7.4磷酸盐缓冲减(PBS)(参见附录A中A.1),磷酸盐缓冲液(pH5.9)(琴见附录A中A,5)。0.85%生理盐水（参见附录A中A.2)。2. 13bZxz.net
阿氏（Alsevers)液（参见附录A中A，3）。2.150.5%红细胞悬液（参见附录A中A.4)。2. 16
胎球蛋白(参见附录 A 中 A. 6)。过碘酸盐（参见附录A中A.7)。
亚碎酸盐(参见附录 A中 A,8)。硫代巴比要酸(参见附录 A 中 A. 9)。无菌蒸馏水或去离子水。
3仪器
GB/T 27536—2011
3.1生物安全柜（内负压，有HEPA过滤器可避免细胞培养物污染及保护操作人员安全），3.2孵化器。
3.3CO.培养箱，
3.4台式高建冷冻离心机。
3.537C水浴加热器。
3.6煮沸锅。
3.7棉拭子(医用棉签）。
3.8研磨幕。
TTTKANTKACA
GB/T 27536—2011
4样品采集与处理
4.1样品的来巢
病死猪，取肺脏或气管分泌物：待检括猪，用棉拭子（医用梯签)采集鼻腔深部分秘物。4.2样品的保存
样品应置于特定的样品保存液中进行保存。一般采用磷酸盐缓冲液（pH7.0~7.4,0.01o1/L）0.85%生理盐水或者不含血湾的细胞培养液作为保存（含青霉素2000IU/mL,链霉素20D0IU/mL、制毒菌素1000IU/mL，牛血清白蛋白5mg/mL）。样品采巢后应置于加冰的保温箱中、密封，24 h内送至实验室进行处理或叠一70 保存。4.3样品的处理
用剪刀采组织病料置于研磨器中，按质量体积比（1：1）加人样品保存液进行研磨将棉拭子置于装有1mL样品保存获的离心管中，用子充分统压后弃去拭子。以上样品室温静置作用min，4℃30001/min离心5min，取上清作为接种材料。5样品接种
5.1鸡胚培养
1 mL 注射器吸取处理好的样品,以 0. 2 mL/胚的量经尿囊腔和羊膜腔途径接种 9 ~11 甘龄 SPF鸡胚,每个样品接种 3 个胚,于 35 C～~37 C孵化箱内孵育 72 h~96 h+弃去 24 h 内死亡鸡胚。孵化至96h将鸡胚制冷后，无菌收取24h以后死亡鸡胚及96h仍存活鸡胚的尿囊液和羊水。5.2细胞培养
在生物安全柜中操作，将60%～80%长满单层的MDCK细胞的6孔细胞培养板用细胞培养液（不含胎牛血清+含有TFCK处理的胰酶2μg/mL的DMEM培养基>洗三次，加人适量的处理样品.置于5%CO，,37C培养箱中培养1h～2h，期间每隔30min轻轻播动一次。感作完毕，弃去感作物，用含有胰酶的培养液洗三次，加人适量的细胞维持液，5%COz，37℃培养箱内继续培养5d～7d,期间观察细胞病变（CPE）的形成博况。如出现CPE（特征病变为：细胞肿胀圆化，细胞间膜增大，细胞核固缩或破製，严重时细胞部分或全部脱落），收集细胞培养上清。5.3结果判定
收获鸡胚液或细胞培养上清、测定其血凝活性（具体操作见6.1）。若HA反应阳性说明可能有粘病毒科的病率，应采用HA-HI试验进行凝素亚型的鉴定：若无血凝活性或血凝价很循，应育传3～5代，。若仍阴性，则认为病毒分离阴性。6亚型鉴定
6. 1 HA 试验
6. 1. 1 在微量反应板的 1 ~12 孔均加人 0. 05 mL PBS,换吸头 。6. 1.2吸取0.05mL待鉴定病毒液，加人第1孔，反复抽打3～5次混匀。2
TTTKANTKACA
GB/T27536—2011
6.1.3从第1孔吸取0.05mL病毒液加人第2孔.混句后吸联0.05tmL加人第3孔.如此进行对倍稀释至第 11孔,从第 11扎吸取 U.05 mL弃之,换吸头。第 12作为红细胞对照。6.1.4每孔均加人0.05mL0.5%（体积分数)鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分播匀后加人)。6.1.5轻轻混勾，室温（20℃~25℃）下静置10min30min后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。对照孔红细胞显著呈钮拆状时判定结果。6.1.6结果判定：将反应板倾斜45°，观察红细若没有呈沮滴状流满，则判为HA阳性完全血避（不流）的病毒最高稀释倍数为病毒的HA效价（血凝单位用HAU表示）。反之，判为HA阴性。6.2HI盘验
6.2.1标定参考毒株抗原及特签定病毒分别为4HAU(25μL)。6.2.2在微量反应板的第1~1I孔加入0.025mlPBS，第12孔加入0.05mLPBS。6.2.3加0.025mL标准阳性血清至第1孔，充分混匀后吸出0.025mL于第2孔，侬次对倍稀释至第1I 孔,从第 11 孔吸取 0.025 mL 弃去。6.2.41~11孔均分别加人0.025mL4HAU参考率株抗原及待鉴定病毒，第12孔作为红细胞对照。室温(20 ℃～25℃)下静置10 min~30 min。6.2.5每孔均加人0.05mL0.5%（体积分数)鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分播勾后人）)，轻轻混匀,室温（20℃~25℃)下静置10min~30min后，观结果《对照孔红细胸显著皇钮扣状时判定结果）。6.2.结果判定，按照HA试验进行结果判定。如果待鉴定病毒样品的血凝活性被这一亚型阳性血清所抑制，则该样品判为这一血凝素亚型阳性。（检测结果成立的条件：已知抗原与相应的阳性血清反应后出现预期的H1效价，同时抗原的反馈标定结果均为4HAU，反之试验重新进行。）6. 3NI 试验(全量法以 N1 和 N2 分型血清为例）6.3.1将N1,N2标准阳性血清和阴性血清分别按原液、10倍、100借稀释，并分别加人标记好的相应试中，
6.3.2将已经确定HA亚型的待检病毒液稀至HA价为16HAU,每管均加人0.05tL,混勾37C永浴1h，
6.3.3每管加人的胎球蛋白溶液（50mg/ml)0.1mL，混勺，拧上盖后37C水浴16h~~18h。6.3.4室温冷却后，每管加人0.1tmL过碘酸盐混匀，室温静置20min。6.3.5每管加入1ml.砷试剂（参见附录A中A8)，振荡至棕色消失，乳白色出现。6.3.6每管加入2.5mL硫代凸比要酸试剂（参见附录A中A,9）,将试管量煮沸的水浴中15min,不出现粉红色的为神经氨酸酶抑制阳性，即待检病毒的神经氢酸酶亚型与加人管中的标准神经氨酸酶分型血清亚型一致。
7注意事项
7. 1标准抗原稀释液浓度为4个HAU,并且在每次试验前进行标定。7.2孵育时间要严格控制。红细胞对照完全沉淀时要迅速判读。在-些病毒株中可见红细胞从病毒中解脱，如果有这种情况的发生，要提前判定或置4℃下孵育。7.3红细胞悬液始终符合标准，
7.4反应试剂要按规定保存和使用。为避免反复冻融和细菌污染，应以无菌操作将试剂分装成小包装。
7.5冻于的试剂应按照说明书中规定的体积重新溶解并保存。7.6操作过程生物安全注意事项见附录B3
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GB/T27536—2011
A. 1 0. 0T mol/L pH7.0~7. 4PBSNacl
灭葡双蒸水
800 mL
谢录鑫
（资料性附录）
相关试剂的配制
NaOH 或者 HC1 调 pH7. 0~-7. 4,灭菌双蒸水加至 1 000 mL 定容,121 C高压灭菌 15 min 或过滤除菌。
A.20.85%生理盐水
NaCl 名. 5 g,加灭菌双蒸水 1 000 mL 定容,121 ℃高压灭菌 15 min 或过滤除菌。A. 3阿氏(Alsevers)液
葡萄糖
柠橡酸钠
柠檬酸
氯化钠
灭菌双蒸水
NaOH或者 HCI
至100mL
121℃高压火菌15min，2～8℃保存备用。A40.5%红细胞最液
采集SPF公鸡或无流和新城接等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合,用PBS液洗涤3 次,以 3 000 1/min 离心 5 min,洗涤后用 PBS 配成 0. 5%体积分数)红细胞悬液,2 C ~8 C保存备用。
A 5 PBS.PH5.9
A溶滋[0.4mol/L.磷酸二氢钠(NaH2PO,)]:称取27.6gNaH,PO，溶于500mL去离子水中。B液[0.4mo1/L磷酸氢二钠(NazHPO,）]：称取28.4名NaHPO,于500mL去离子水中，取81mL液A,19mL溶液B混勾配成0.4mol/LPBS，pH5.9。如果需要，用适当的溶液A或B调pH值。室温保存，
TTKNTKACA
胎球蛋自（底物）
胎球蛋白
PBS,pH5.9
去离子水
分装成5 mL，—20 保存。
过碘酸盐溶液
过酸钠
去离子水
GB/T 27536—2011
加热溶解，室温冷却后加62mL85%正磷酸混匀，暨棕色瓶中，室温，避光保存。砷试剂
亚碑酸钠
无水硫酸钠
去离子永
100 mL
加热溶解,室温冷却后加 0. 3 mL浓硫酸,室温保存。A.9硫代巴比妥酸
无水硫酸钠
硫代巴比妥酸
去离子水
200 mL
水中加热溶解，室温保存。据硫代巴比妥酸的质量，一般配好10h后溶液中出现沉淀，因此该溶液要使用前配盘。
CB/T 27536-2011
附录B
（规范性附录）
生物安全注意事项
B.1所有的操作过程应在生物安全二级（biologysecuritylevel2：能够安全操作，对实验室工作人员和动物致病性低的，对环境有轻微危害的病原微生物的生物安全水平)实验室中进行，2亚型鉴定要求有全套的流感病毒血凝素(HA)分型血清和神经氨酸酶(NA.)分型血清。B.2
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