GB/T 27540-2011
基本信息
标准号： GB/T 27540-2011
中文名称：猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
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标准简介
GB/T 27540-2011 猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法
GB/T27540-2011
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标准内容
ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T27540—2011
猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法Method of the real-time RT-PCR for the detection ofclassical swine fever virus
2011-11-21 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2012-03-01实施
本标准按照GB/T1.12005给出的规则起草，本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC 181)归口。本标雅起节单位：中国尊医药品监察所。GB/T27540—2011
本标准主要起草人：琴、王泰健、徐璐、范学政、刘俊、蒋春燕、赵启祖、宁宜宝、邹兴启。TTKANYKACA
1范围
猪猛病舞实时荧光 RT-PCR检测方GB/T27540—2011
本标规定了猪病毒(Classical swinefevcrvirus,CSFV)实时荧光RT-PCR检测方法。本标谁适用于猪瘟的诊断利监测，适用于猪活体及其脏器、血液、排泄物和细跑培养物中CSFV核酸的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件+仅注且期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版（包括所有的修改单）适用于本文件。中华人民共和国农业部公告第302号：兽医实验室生物安全技术管理规范3缩略语
下列缩略语适于本文件。
CSFV:猪瘟病毒(Classical swine fever virus)Ct值：达到阅值的循环数（cyclethreshold)DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)HS Taq 酶:热启动 Taq INA 聚合酶(HS Taq IDNA Polymerase)RNA：核糖核酸(ribonucleicacid)荧光 RT-PCR: 荧光逆转录案合酶链式反应 ( real time ffuurescent quantitative reversetransuription pulymerase chain Icactiun)4试剂和材料
除另有说明，所用试剂均为分析纯：所有试剂用无RVA酶的分装，4.1Trizol:RNA抽提试剂,外观为粉红色-分装至棕色瓶中，于4℃~～8℃保存。4.2 氯伤4 ℃预冷。
4. 3 异丙醇:4 ℃预冷。
4. 4 75%Z醇:用新开启的无水乙醇和 DEPC水配制，一20 ℃冷。4.5DEPC水：去离子水中加人0.1%DEPC.37℃作用1h，（121士2)℃，高压灭菌15min。4. 6RVA酶抑制剂(30 C/μL).
4.710XPCRbuffer(10mmol/LpH8,3Tris-HCl,50mmol/LKCi,1.5mmol/LMgCla)。4. 8 dNTP(2, 5 mmol/L)。
4.9用于RT-PCR反应的引物浓度为10μmol/L，探针浓度为5μmol/L，其序列如下：上游物F：5-TACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGA-31
TTTKANYKACA
GB/T 27540—2011
下游引物R:5-CCGCTAGGGTTAAGGTGTGTCT-3探针 P:5-FAM-CCEACCTCGAGATGCTATGTGGAC GA-TAMRA-34.10反转录酶：SuperscriptⅡ反转录酶（200U/μL），4.11 DNA 合酶：HS Taq DNA亲合酶(5 T:/μL)。4.12阴性对照:DEPC水。
4.13强阳性对照：非感染体外转录RNA（4200Pg/μI.）。4.14弱阳性对照：非感染体外转录RNA（42pg/μL），5器材和设备
5.1高速台式冷陈离心机：最大离心力12000g以上，5.2冰箱。
5.3荧光PCR检测仪。
5.4组织匀浆器。
5.5微量液器和吸头。
5.6离心管。
6样品的采集
6.1采样注意事项
采样及样品前处理过程中应戴一次性子套，样本不得交受污染。6.2采样工具
扁桃体采样器：异总子、开口器和采样枪。使用前均应用3%氢氧化钠溶液没泡消毒5min～10min，经清水冲洗。
灭菌牙签和 0. 5 ml或 1. 5 mL离心管经(121主2)℃+高压灭菌 15 min;剪、镊经 160 ℃T烤 2 h.6.3采样方法
6.3.1活体样品
固定活猪的上唇·用开可器打开口腔，用来样枪采取篇称体样品，用灭闲牙签挑至0.5mL惑1.5L离心管并作标记,编号,送实验室。取待检样品，按1：5体积加人DEFC水，于研钵或组织勾浆器中充分研磨，3000g离心15min，取上清液转人离心管中编号备用。6.3.2内脏样品
采敢病死猪各种脏器（淋巴结、跋脏、脏、回肠月于脏和肾脏》装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，送实验室。取50M官～100 mg待检样品，按15倍体积加入DEPC水，于研钵或组织句浆器中充分研磨,3 000g离心15 min,取上清转人离心管中编号备用。6.3.34%EDTA抗凝血
用无菌注射器接全血，注人含1/104%EDTA游液的无菌容器中：充分混匀所编号备用2
TTTKAONYKACA
6.3.4排泄赖
GB/T 27540--2011
挑取少许翼便样本于离心管中，加人适量生理盐水，振荡匀，室温3000g离心15min.取上清液转人离心管中编号备用。其余液体排泄物直接转人离心管编号备用。6.3.5细胞培养物
细胞培养物冻融3次，转入离心誉中编号备用。6.4存放与运送
采集或处理的样品在2℃～多℃条件下保存成不超过24h若需长期保存，成放置一70℃冰箱，但应避免反复冻融冻融不超过3次）。来集的样品密封后，来用保温壶或保温桶加冰绝封，在6h～8h之内运送到实验室。按照兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。7实时费光RT-PCR检测
7.1核酸提取
在样本制备区进行
7. 1. 1 取 n 个灭菌的 1. 5 ml. 离心管,其中 n 为待检样品数×重复数 3一阳性管数十弱阳性管数十阴性管数,对每个离心管递行编号。7.1.2每管加人500μLTrizo!分别加人被检样品、阳性对照，弱阳性对照和阴性对照各200L（由于阳性和南性样品中模板浓度相对较高.检测过程中不得交叉污染赖衡次混句·静置5mi再加人200μL氧仿、混勾器上撒落混匀5s（也可以用手反复颠倒混匀），于4℃、12000g离心1Smin。7. 1, 3 取与 7. 1. 1 中和向数灭菌的 1. 5 mL离心管,加人 500 μL 异丙醇(4 ℃预冷),对每个管进行编号。取7.1.2中离心后的上清液约500μL（注意不要吸出中间层）转移至相应的管中，颠倒混句，一20 ℃静置 30 min。
7.1.4十4℃、12000g离心L5min（离心管开口保持朝离心机转轴万向效置）齐上清，倒置于吸水纸上:-沾干液体，加人600μL75%乙醇，颠倒洗涤。7.1.5：于4C12000g离心10min（离心营开保持朝离心机转轴方向放置）弃上清，倒置于吸水纸上，沾-1液体（不同样品应在吸水纸不同地方粘干）。7.1.64000g离心10s（离心管并口保持期离心机转轴方向放置），用微量加样器小心将残余液体吸干,室温干燥 3 min～10 mina
7.1.7加入38μL经DEPC处理的水和2μLRNA酶抑制剂，轻柔混勾，溶解管壁上的RNA，冰上保存备用。提取的 RNA 应在 2 h内进行荧光 RT-PCR扩增:若需长期保存应改置-70 C冰箱。7.2荧光RI-PCR扩增体系的配制
在反应混合物配制区进行。
设 PCR 反应数为 n,其中 n 为待检样品数×重复数 3一阳性管数十弱阳性管数十阴性管数,每个样本测试反应体系配制见表1：配制完毕的反应液分装时应尽量避免产生气范·上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器，3
TTTKANTKACA
GB/T 27540—2011
体系组分
表1每个样品反应体系配制囊
10XPCRBuffet
猪痘病毒 RT-PCR反应液
探针酱液
反应酶
7.3加样
在本处理区进行。
上游引物F
下游引物 R
Superscript山反转录酶
HS Tag DNA 桑合酶
1. 5 μl.
1. 5 μ1.
终液度
0. 075 μmal/1
0. 6 μml/L
0. 5 μmol/1.
0, 15 μmol/L
2U/μL
0. 05 L/pL
在各设定的荧光RT-PCR管中分别加人本标准7.I.7中制备的35.2μLRNA溶液，益紧管盖后，500t/min离心305。效人光PCR检测仪内。7. 4荧光 RT-PCR 扩增
在检测区进行。
将本标准 7. 3 中离心所的 PCR 管放入荧光 RT-FCR 检测仪内,记录样品摆放顺序。循环条件设置：
反转录50C/20 min;
预变性94℃/4min;
88°C、8 s,60 ℃,35s,40个循环。荧光收集设置在此阶段每次循环的退火延仲时进行。c
7.5结果判定
阅值设定此内容来自标准下载网
试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和 Ct值直接读取检测结果，Ct值为每个反成管内的荧光信号达到设定的阅值吋所经历的循环数，阔值设定原则根据仪器噪声情说进行调整，以阅值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为摊。7.5.2质控标准
7.5. 2. 1阴性对照无 Ct 值,且无典型扩增曲线7.5.2.2强阳性对照的Ct值应≤27.0并出现典型的扩增曲线；弱阳性对照的Ct值应在34.0左右并出现典型的扩增曲线。否则，此次试验视为无效。7.5.3结果描述及判定
7. 5.3. 1阴性
无Ct值并且无典型的增曲线，表示样品中无CSFV核酸。4
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7.5.3.2阳性
Ct值34.0.且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在CSFV核酸7.5.3.3可疑
GB/T27540—2011
C1值34.0，且出现典型扩增曲线的样本建议更复试验，重复试验结采出现CI值≤34.0和典型护增曲线者为阳性，否则为阴性。
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中华人民共和国国家标准
GB/T27540—2011
猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法Method of the real-time RT-PCR for the detection ofclassical swine fever virus
2011-11-21 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2012-03-01实施
本标准按照GB/T1.12005给出的规则起草，本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC 181)归口。本标雅起节单位：中国尊医药品监察所。GB/T27540—2011
本标准主要起草人：琴、王泰健、徐璐、范学政、刘俊、蒋春燕、赵启祖、宁宜宝、邹兴启。TTKANYKACA
1范围
猪猛病舞实时荧光 RT-PCR检测方GB/T27540—2011
本标规定了猪病毒(Classical swinefevcrvirus,CSFV)实时荧光RT-PCR检测方法。本标谁适用于猪瘟的诊断利监测，适用于猪活体及其脏器、血液、排泄物和细跑培养物中CSFV核酸的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件+仅注且期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版（包括所有的修改单）适用于本文件。中华人民共和国农业部公告第302号：兽医实验室生物安全技术管理规范3缩略语
下列缩略语适于本文件。
CSFV:猪瘟病毒(Classical swine fever virus)Ct值：达到阅值的循环数（cyclethreshold)DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)HS Taq 酶:热启动 Taq INA 聚合酶(HS Taq IDNA Polymerase)RNA：核糖核酸(ribonucleicacid)荧光 RT-PCR: 荧光逆转录案合酶链式反应 ( real time ffuurescent quantitative reversetransuription pulymerase chain Icactiun)4试剂和材料
除另有说明，所用试剂均为分析纯：所有试剂用无RVA酶的分装，4.1Trizol:RNA抽提试剂,外观为粉红色-分装至棕色瓶中，于4℃~～8℃保存。4.2 氯伤4 ℃预冷。
4. 3 异丙醇:4 ℃预冷。
4. 4 75%Z醇:用新开启的无水乙醇和 DEPC水配制，一20 ℃冷。4.5DEPC水：去离子水中加人0.1%DEPC.37℃作用1h，（121士2)℃，高压灭菌15min。4. 6RVA酶抑制剂(30 C/μL).
4.710XPCRbuffer(10mmol/LpH8,3Tris-HCl,50mmol/LKCi,1.5mmol/LMgCla)。4. 8 dNTP(2, 5 mmol/L)。
4.9用于RT-PCR反应的引物浓度为10μmol/L，探针浓度为5μmol/L，其序列如下：上游物F：5-TACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGA-31
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GB/T 27540—2011
下游引物R:5-CCGCTAGGGTTAAGGTGTGTCT-3探针 P:5-FAM-CCEACCTCGAGATGCTATGTGGAC GA-TAMRA-34.10反转录酶：SuperscriptⅡ反转录酶（200U/μL），4.11 DNA 合酶：HS Taq DNA亲合酶(5 T:/μL)。4.12阴性对照:DEPC水。
4.13强阳性对照：非感染体外转录RNA（4200Pg/μI.）。4.14弱阳性对照：非感染体外转录RNA（42pg/μL），5器材和设备
5.1高速台式冷陈离心机：最大离心力12000g以上，5.2冰箱。
5.3荧光PCR检测仪。
5.4组织匀浆器。
5.5微量液器和吸头。
5.6离心管。
6样品的采集
6.1采样注意事项
采样及样品前处理过程中应戴一次性子套，样本不得交受污染。6.2采样工具
扁桃体采样器：异总子、开口器和采样枪。使用前均应用3%氢氧化钠溶液没泡消毒5min～10min，经清水冲洗。
灭菌牙签和 0. 5 ml或 1. 5 mL离心管经(121主2)℃+高压灭菌 15 min;剪、镊经 160 ℃T烤 2 h.6.3采样方法
6.3.1活体样品
固定活猪的上唇·用开可器打开口腔，用来样枪采取篇称体样品，用灭闲牙签挑至0.5mL惑1.5L离心管并作标记,编号,送实验室。取待检样品，按1：5体积加人DEFC水，于研钵或组织勾浆器中充分研磨，3000g离心15min，取上清液转人离心管中编号备用。6.3.2内脏样品
采敢病死猪各种脏器（淋巴结、跋脏、脏、回肠月于脏和肾脏》装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，送实验室。取50M官～100 mg待检样品，按15倍体积加入DEPC水，于研钵或组织句浆器中充分研磨,3 000g离心15 min,取上清转人离心管中编号备用。6.3.34%EDTA抗凝血
用无菌注射器接全血，注人含1/104%EDTA游液的无菌容器中：充分混匀所编号备用2
TTTKAONYKACA
6.3.4排泄赖
GB/T 27540--2011
挑取少许翼便样本于离心管中，加人适量生理盐水，振荡匀，室温3000g离心15min.取上清液转人离心管中编号备用。其余液体排泄物直接转人离心管编号备用。6.3.5细胞培养物
细胞培养物冻融3次，转入离心誉中编号备用。6.4存放与运送
采集或处理的样品在2℃～多℃条件下保存成不超过24h若需长期保存，成放置一70℃冰箱，但应避免反复冻融冻融不超过3次）。来集的样品密封后，来用保温壶或保温桶加冰绝封，在6h～8h之内运送到实验室。按照兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。7实时费光RT-PCR检测
7.1核酸提取
在样本制备区进行
7. 1. 1 取 n 个灭菌的 1. 5 ml. 离心管,其中 n 为待检样品数×重复数 3一阳性管数十弱阳性管数十阴性管数,对每个离心管递行编号。7.1.2每管加人500μLTrizo!分别加人被检样品、阳性对照，弱阳性对照和阴性对照各200L（由于阳性和南性样品中模板浓度相对较高.检测过程中不得交叉污染赖衡次混句·静置5mi再加人200μL氧仿、混勾器上撒落混匀5s（也可以用手反复颠倒混匀），于4℃、12000g离心1Smin。7. 1, 3 取与 7. 1. 1 中和向数灭菌的 1. 5 mL离心管,加人 500 μL 异丙醇(4 ℃预冷),对每个管进行编号。取7.1.2中离心后的上清液约500μL（注意不要吸出中间层）转移至相应的管中，颠倒混句，一20 ℃静置 30 min。
7.1.4十4℃、12000g离心L5min（离心管开口保持朝离心机转轴万向效置）齐上清，倒置于吸水纸上:-沾干液体，加人600μL75%乙醇，颠倒洗涤。7.1.5：于4C12000g离心10min（离心营开保持朝离心机转轴方向放置）弃上清，倒置于吸水纸上，沾-1液体（不同样品应在吸水纸不同地方粘干）。7.1.64000g离心10s（离心管并口保持期离心机转轴方向放置），用微量加样器小心将残余液体吸干,室温干燥 3 min～10 mina
7.1.7加入38μL经DEPC处理的水和2μLRNA酶抑制剂，轻柔混勾，溶解管壁上的RNA，冰上保存备用。提取的 RNA 应在 2 h内进行荧光 RT-PCR扩增:若需长期保存应改置-70 C冰箱。7.2荧光RI-PCR扩增体系的配制
在反应混合物配制区进行。
设 PCR 反应数为 n,其中 n 为待检样品数×重复数 3一阳性管数十弱阳性管数十阴性管数,每个样本测试反应体系配制见表1：配制完毕的反应液分装时应尽量避免产生气范·上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器，3
TTTKANTKACA
GB/T 27540—2011
体系组分
表1每个样品反应体系配制囊
10XPCRBuffet
猪痘病毒 RT-PCR反应液
探针酱液
反应酶
7.3加样
在本处理区进行。
上游引物F
下游引物 R
Superscript山反转录酶
HS Tag DNA 桑合酶
1. 5 μl.
1. 5 μ1.
终液度
0. 075 μmal/1
0. 6 μml/L
0. 5 μmol/1.
0, 15 μmol/L
2U/μL
0. 05 L/pL
在各设定的荧光RT-PCR管中分别加人本标准7.I.7中制备的35.2μLRNA溶液，益紧管盖后，500t/min离心305。效人光PCR检测仪内。7. 4荧光 RT-PCR 扩增
在检测区进行。
将本标准 7. 3 中离心所的 PCR 管放入荧光 RT-FCR 检测仪内,记录样品摆放顺序。循环条件设置：
反转录50C/20 min;
预变性94℃/4min;
88°C、8 s,60 ℃,35s,40个循环。荧光收集设置在此阶段每次循环的退火延仲时进行。c
7.5结果判定
阅值设定此内容来自标准下载网
试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和 Ct值直接读取检测结果，Ct值为每个反成管内的荧光信号达到设定的阅值吋所经历的循环数，阔值设定原则根据仪器噪声情说进行调整，以阅值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为摊。7.5.2质控标准
7.5. 2. 1阴性对照无 Ct 值,且无典型扩增曲线7.5.2.2强阳性对照的Ct值应≤27.0并出现典型的扩增曲线；弱阳性对照的Ct值应在34.0左右并出现典型的扩增曲线。否则，此次试验视为无效。7.5.3结果描述及判定
7. 5.3. 1阴性
无Ct值并且无典型的增曲线，表示样品中无CSFV核酸。4
TTKANTKACA
7.5.3.2阳性
Ct值34.0.且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在CSFV核酸7.5.3.3可疑
GB/T27540—2011
C1值34.0，且出现典型扩增曲线的样本建议更复试验，重复试验结采出现CI值≤34.0和典型护增曲线者为阳性，否则为阴性。
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。