GB/T 27634-2011
基本信息
标准号： GB/T 27634-2011
中文名称：传染性囊病病毒核酸检测方法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准简介
GB/T 27634-2011 传染性囊病病毒核酸检测方法
GB/T27634-2011
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标准内容
ICS 11. 220
中华人民共和国国家标准
GB/T 27634—2011
传染性囊病病毒核酸检测方法
Protocol of nucleic acid detection for infectious bursal disease(gumboro disease）virus
20 11-12-30 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2012-04-01实施
本标准按照GB/1.1—2009给出的规则起草。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会《SAC/TC181)归口。GB/T 27634—2011
本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局，深圳市检验检疫科学研究院、华南农业大学、中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、北京盈九思科技有限公司。本标推主要起草人：秦智锋、孙洁、卢体康、花群义、陈书琨、吕建强、杨素、方兴旺、曾少灵，詹爱军、毕英佐、陈兵、阮周曦、朱玉兰TTTKANYKACA
1范围
传染性囊病病毒核酸检测方法
GB/T 27634—2011
本标推规定了传染性囊病病毒RT-PCR检测方法和实时荧光RT-PCR检测方法的技术要求和操作规范。
本标准适用于传染性囊病病毒感染的快速诊断。2规范性引用女件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文性，凡是不注甘期的引用文件+其最新版本（包括所有的修改单）适用上本文件，GB/I6682分析实验案用永规格和试验方法GB/T18088：出人境动物检疫果样GB19489实验室生物安全通用要求3缔略语
下列缩略语适用于本文件。
Ct值：荧光信号量达到设定的阐值时所经历的循环数。IRD:incctiousbursaldisease，传染性囊病IBDV;infectiouxbursaldiseasevirus，传染性囊病病毒。SPF：specificpathogcnfree，无特定病原体。4材料与试剂
4.1收器与耗材
核酸电泳仪。
疑胶成像仪。
4. 1.3冷冻离心机(最高离心力达 15 000g 以上)。4. 1.4
混勾器。
冰籍<2 ℃~8 ℃, -20 ℃, -80 ℃).4. 1. 6微量可调移液器(10 μI-,100 μL,1 000 μL)。4. 1. 7
微量带滤芯瑕嘴(1μL,100 μL,1000μL)。灭菌研钵。
离心管。
PCR光学反应管。
PCR仪。
实时荧光PCR仪。
TTTKONYKAA
GB/T 27634—2011
4.2试剂
4. 2. 1试剂级别:除另有规定,本方法试验用水应符合 GB/T 6682 规定的二级水,所用化学试剂均为分析纯。
4.2.2引物与探针：采用无DNA酶、无RNA酶水将每引物与探针配制成100μmol/L储存液，罩一20个或更低温度冻存；使用时收适量配制成10μmol/L工作液，避免多次冻融。4. 2.3灭菌双蒸水。
4. 2, 4 三氯甲烷。
4.2.5异丙醇。
4.2.6无水乙醇.
4.2.775%乙醇用新开启的炙菌双蒸水配制，20℃预冷。4.2.8DL200oDNAMarker。
一步法RT-PCR检测试剂盒。
4.2.10（一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒。5生物安全要求
5.1采样、样品处理及检诞过所涉及的实验操作，应遵守GB19489的有关规定。5.2IBDV核酸检方法的实验室规范（参见附录A)。6样品的采第
6.1按照GB/T18088的要求进行样品的采集。6.2样品包括各种病料、用于IBDV监测和检测的离组织、IBDV的细胞培养液、IBDV接种鸡胚的尿囊液等。
7核酸抽提
7. 1酐三氯甲烷抽提法
7.1.1取灭菌的1.5mL离心管，做好标识。7.1.2每管加人600μL裂解液，分别加人被检样本、阴性对照SPF鸡的法囊组PBS研磨上清液)、阳性对照(标准的 IBDV毒株)各 200 μL,再加人 200 μL 三氧甲烷,混器上振荡混勾 5 s,于 4 ℃12000g离心15min.
7.1.3取无RNA酵的1.5mL离心管，加人一20℃预冷100μL异丙醇，吸取本标准7.1.2各管中的上清液转移至相应的管中，避免吸出中间层，颠倒混匀：7.1.4于4℃12000g离心15min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾千液体，加人600μL75%预冷乙醇，洗漆。
7.1.5于4℃12000g离心10min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，7.1.610000g离心10s用微量加样器将其吸于，室温干5min~10min，7.1.7加人15μL无核酸降解酶的水，溶解管底的RNA，5000g离心5s，冰上保存备用。若需长期保存应放置一70 亡冰箱。
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7.2其他核酸抽提法
GB/T 27634—2011
核酸提取可以采用等效RNA提取试剂及方法，如采用自动化核酸抽提工作站来抽挺核酸。8RT-PCR 检测
8. 1 引物
8.1.1针对A片段VP2基因的引物
上游 U3:5'-TCT-AAA-ACG-ACC-CCC-ACT-GCA-TGC-GGT-ATG-TGA-GGC-TTG-GTG-AC-3'F 游 L3 : 5'-CAG-GAA-ACA-CCT-ATG-ACC-GAA-TTC-GAT-CCT-GTT-GCC-ACT-CTT-TC-38. 1. 2 针对 B片段 VP1 基因的引物上游+29G:5'-TGT-AAA-ACG-ACG-GCC-AGT-GAA-TTC-/AGA-TTC-TGC-AGGHCAC-GGT-CTC-T-3下游-861: 5'-CAG-GAA-ACA-GCT-AIG-ACC-CTGCAG-TTG-ATG-ACT-TGA-GGT-TGA-TTT-TG-38. 1. 3引物组成的说明
8. 1. 3. 1 近用引物 M13 或 R13(黑体部分)序列。M13 或 R13 序列为多数测序反应中的测序引物,便于对 PCR扩增产物测序。
8, 1. 3.2限制性内切酶位点(下划线部分)。限制性内切酶位点的引人,使得 IBDV 经 RT-PCR扩增后的产物可限制性内切酶SphI引物U3）,EcoRI（引物L3和十290）、PstI(引物一861)进行酶切后划人质粒牛。引物U3和L3分别对应AccNoX84034毒株序列片段A的657-676和1193—1212位置，引+226和793分别对应A心NoAF240687毒株序列片段B中的290一311和861一883位置。8.1.3.3IBDV特异性序列<斜体部分）。^片段扩增产物为604bp,B片段扩增产物为642bp，引物扩增片段适合进行IBDV分子分析和分子流行病学研究。8.2反应液的配制
按照商业化的·-步法RT-PCR试剂盒推荐说明书，进行IBDVRT-PCR友应液的配制（参见附录B)。将配制的每个PCR反应试剂充分混匀,瞬时离心后转移至样本处理区。8、3加样
在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加入已提取好的核酸5μL，混勾后瞬时离心，将PCR管放人PCR检测仪内，记录样本放置顺序，8.4PCR扩增检测
8.4.1在扩增检测区进行。
8. 4. 2 PCR 反应条件为:
第一步+反转录50℃ 45 min
第二步:94 C 5 min(如果为热启动一步法 RT-PCR 试剂盒,则需要 95 ℃ 15 min);第三步：94℃30s54℃45s，72℃1min30s,5个循环；第四步：94℃30564℃45s72℃1min30530个循环；第五步t72 延伸 10 min。
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8.5上样和电泳
配制凝胶(见附录C)，将样品的扩增产物按编号加人对应的1%琼脂糖凝胶的各孔中，其中一个上样孔中人标谁阳性对照扩增产物，一个上样孔中加人标准阴性对照打增产物。在凝胶的边孔中加入标准分子质量的DNAMarker。将凝胶在80V短定电压F电冰60min。将凝胶置紫外灯或疑胶成像议中进行检查。
8.6结果判定
8. 6. 1°阳性
出现一条分子两量为604bp条带，与阳性对照PCR产物同步迁移的大小相同条带，判为IBDV片段A核酸阳性。出现一条分子质为642bp条带，与阳性对照PCR产物同步迁移的大小相同条带，判为IBDV片段B核酸阳性。片段A和片段B同时出现核酸阳性，可以判定IBDV阳性。8. 6. 2 明性
片段A和片段B同时出现核酸阴性，IBDV判为阴性。8.6.3可疑
在片段 A 和片段 B 的核酸检测中,只山现其中一个片段为阳性,另一个片段为阴性,则判定为IBDV可疑。结果可应进行实时荧光RT-PCR检测；或重复进行RT-PCR检测，出现AB两个片段中任何一个片段判定为阳性，否则判定为阴性。9实时光RT-PCR检乱
9. 1引物和探针
9, 1. 1 针对 A 片段 VP2 基因的引1物上游引物，5＇TTEATACGGAGCCTTCTGAT3；下游引物：5＇ACAATTAGCCCTGACCCT 3*9.1.2T=qMan 探针:5\FAM CAACCGGACCGGCGTCCATTC-RHQ 3*,其 5'端和 3'端分别标记FAM和BHQ:
9.2扩增检测
9,2. 1扩增试剂准备
在反应滤合物配制区进行。按照商业化的步法实时荧光RT-PCR（rcaltimeRT-PCR)试剂盒推荐说明，进行IBDVrealtimeRT-PCR反应液的配制（参见附录D)。将配制的每个PCR反应试剂充分混匀，瞬时离心后转移至样本处理区。9.2.2加样
在已分装有 PCR反应混合较的 PCR 管中分别如人已提取好的核酸 5 μL，混勾后开时离心,将PCR管放人荧光PCR检测仪内，记录样本放置顺序。9.2.3PCK扩增检测(扩增检测区）9.2.3.1反应条件设定
第一步：反转录4530min；
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第一步：热启动95℃15min(不向的生产商家推荐的时间不同，应根据说明书进行)；第三步：95℃15s，6045s40个循环，60℃时设置采巢荧光。9. 2. 3. 2荧光素设定
报告荧光（reportdye）设定为FAM或按探针实际标记的荧光基团设定），淬灭荧光（quenchdye）设定为None，校准荧光referencedye）设定为None。可根据不同品牌仪器说明等效设置参数。9,3分析条件设定和结果判定
9.3.1解值设定
综合分析仪器给出的各项结果，基线（baseline）以仪器给出的默认值作为参考，阅值（threshola)设定原则以网值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准，具体还需根据仪器噪声情况进行调整，选择FAM通道进行分析。
9.3.2质控
阴性对照应无Ct值，阳性对照的Ct值应≤30，且呈现S型典型扩增典线。二考均成立才可判定试验成立·否则试验无效。
9.3.3荧光PCR结果分析及判定
9.3.3.1阳性反应结果判定
在试验成立的条件下，检测结果是现Ct值35.且扩增曲线有明显的对数增长期，判为荧光PCR阳性反应，表明IBDV核酸阳性。9. 3. 3. 2明性反应结果判定
检测结果呈现无Ct值、无扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期，判为荧光PCR阴性反应，表明IBDV核酸阴性。
9. 3. 3. 3可疑反应结巢判定
检测结果35对于可疑阳性样品，应重新抽提核酸、再次进行IRDVIealtimeRT-PCR检测。如果重复检测的Ct值40，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性反应.表明IBDV核酸阳性。否则判为荧光PCR阴性反应。
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A，1实验室设置要求
（资料性附录）
LBDV核酸检测方法的实验室规范A.1.1实验室分为三个相对独立的工作区域：样本制备区、PCR反应混合物配制区和检测区，并且明确标认。
A, 1. 2 每:-区域应有专用的仪器设备,并且明确标识。A.1.3进人各个工作区域严格遵循单一方向顺序，即只能从样本制备区,PCR反应混合物配制区至检测区。www.bzxz.net
A1.4在不同的工作区域应使用不同颤色或有明显区别标志的工作，工作服不能穿离各特定区域。A：1.5实验室清洁时应按PCR反应混合物配制区，样本制备区至检测区的顺序进行。A，1.6不同的实验区域应有其各自的清洁用具，以防止交叉污染。A.2工作区域仪器设备配置
A.2.1样本制备区仪器设备配置
2℃～8冰箱，—20℃冰箱，冰冻台式离心（=12000g），混勾器：微量加样器0.5叫L~1015μL~20 μ,20 μL200 μl,200 μL~1 000μ);可移动紫外灯。A. 2. 2 PCR 反应混合物配制区2℃~8冰箱，一20冰箱：台式离心机（3000g）：混勾器；微量加样器（0.5uL~～10μL，5 μ～20 μL,20 μL～200 μL,200 xL~～1 000 μI);可动紫外灯。A 2. 3检测区仪器设备配置
荧光PCR仪，可移动紫外灯；打印机。A,3各工作区域功能及注意事项
A.3.1样本制备区
A.3.1.1标本的保存，核酸提取、贮存及其加人至扩增反应管在样本制备区进行。A.3.1.2可在本区内设立正压条件以避免邻近区的气溶胶进入本区选成污染。A3.1.3用过的加样器吸头应放人专门的消毒（例如含次氯酸钠溶液)容器内。实验室桌梳表面每次工作后都要清洁，实验材料（原始样本、提取过程中样本与试剂的混合液等）如出现外溅，应作清洁处理并作出记录。
A3.1.4对实验台适当的紫外照射（254nm波长，与工作台面近距离）可以韬助灭活病毒和消踪核酸的污染。工作后通过移动紫外线灯管来确保对实验台面的充分照射：A. 3. 2PCR反应混合物配制区
A.3.2.1试剂的分装和反应混合液的制备在本区进行。b
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A.3.2.2在警个本区的实验操作过程中，操作者应裁于套。工作结束后应立即对工作区进行清洁：本工作区的实验台表面成可耐受诸如次氟龄钠等的化学物质的消毒清洁作用。A.3.3检测区
在本区进行荧光PCR检溯。
A. 3. 3. 1
A, 3. 3. 2
FCR扩增产物不能在本实验室开盖，PCR管应弃在远离本实验室的垃圾箱中，A.3.3. 3
实验完成后采用紫外灯对实验室进行充分照射。了
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附录B
（资料性附录）
IBD>V RT-PCR 反应液的配制
每份检测样品的 IBDV RT-PCR体系(50 uL)如表 B.1表 B. 1
无核酸降解酶的水
10XOne step RNA PCR Buffer
MgCle(25 rumol/L)
dNTP Mixture(各 10 mmol/L)
上游引物(20 μmol/mL)
下游引物(20 μml/ml.)
RNase Inhibitor(40 U/μL)
AMV RTase XL(5 C/μL)
AMY-Optimized Taq(5 U/μL)
总体积
注：不同公司生产的one siep RT-PCR试剂盒反应成分不同，体系不同，可根据相应的说明书进行替收。8
C.1琼脂糖凝胶的TAE缦冲液（50×）三羟甲基氨基甲烷碱(Tris-base)附录C
（规范性附录）
电泳缓冲液的配制
0.5 mal/L(pH8. 0)乙 --胺州Z酸(NayEDTA +2H:0) 100 mL冰乙酸
燕馏水
待上述混合物完全溶解后,加蒸馏水至1000 mI至4℃泳箱中备用。GB/T27634—2D11
如配制1%的琼脂糖凝胶和用作电泳缓冲液，则用蒸水稀释50倍成TAE缓冲液。C.21%琼脂糖凝胶板制备
取0.5g琼脂糖加入50mL1×TAE缓冲藏中，在微波炉中充分溶解后，冷却至60℃后，加入3μL10mg/mL溴化乙锭，倒人凝胶板中，插入梳子，待凝胶完全疑周后拔去梳子，备用。9
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附录D
(资料性附录）
IBDV real tirne RT-PCR 反应液的配制每份检测样品的 IBDV real time RT-PCR 体系(25 μL)如表 D, 1。表 D. 1
2X RT PCR Buffer
Enzyme Mix
王游引物(1a μmal/mL)
下游引物(l0 μmol/mL)
TanMan操针(s μmol/mL)
无核酸降解醇的水
总体积
注:不同公司生产的 real time De atep RT-FCR 试剂盒反应成,分不同,体系不同,可根据相应的说明书进行替改,10
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20 11-12-30 发布
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2012-04-01实施
本标准按照GB/1.1—2009给出的规则起草。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会《SAC/TC181)归口。GB/T 27634—2011
本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局，深圳市检验检疫科学研究院、华南农业大学、中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、北京盈九思科技有限公司。本标推主要起草人：秦智锋、孙洁、卢体康、花群义、陈书琨、吕建强、杨素、方兴旺、曾少灵，詹爱军、毕英佐、陈兵、阮周曦、朱玉兰TTTKANYKACA
1范围
传染性囊病病毒核酸检测方法
GB/T 27634—2011
本标推规定了传染性囊病病毒RT-PCR检测方法和实时荧光RT-PCR检测方法的技术要求和操作规范。
本标准适用于传染性囊病病毒感染的快速诊断。2规范性引用女件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文性，凡是不注甘期的引用文件+其最新版本（包括所有的修改单）适用上本文件，GB/I6682分析实验案用永规格和试验方法GB/T18088：出人境动物检疫果样GB19489实验室生物安全通用要求3缔略语
下列缩略语适用于本文件。
Ct值：荧光信号量达到设定的阐值时所经历的循环数。IRD:incctiousbursaldisease，传染性囊病IBDV;infectiouxbursaldiseasevirus，传染性囊病病毒。SPF：specificpathogcnfree，无特定病原体。4材料与试剂
4.1收器与耗材
核酸电泳仪。
疑胶成像仪。
4. 1.3冷冻离心机(最高离心力达 15 000g 以上)。4. 1.4
混勾器。
冰籍<2 ℃~8 ℃, -20 ℃, -80 ℃).4. 1. 6微量可调移液器(10 μI-,100 μL,1 000 μL)。4. 1. 7
微量带滤芯瑕嘴(1μL,100 μL,1000μL)。灭菌研钵。
离心管。
PCR光学反应管。
PCR仪。
实时荧光PCR仪。
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GB/T 27634—2011
4.2试剂
4. 2. 1试剂级别:除另有规定,本方法试验用水应符合 GB/T 6682 规定的二级水,所用化学试剂均为分析纯。
4.2.2引物与探针：采用无DNA酶、无RNA酶水将每引物与探针配制成100μmol/L储存液，罩一20个或更低温度冻存；使用时收适量配制成10μmol/L工作液，避免多次冻融。4. 2.3灭菌双蒸水。
4. 2, 4 三氯甲烷。
4.2.5异丙醇。
4.2.6无水乙醇.
4.2.775%乙醇用新开启的炙菌双蒸水配制，20℃预冷。4.2.8DL200oDNAMarker。
一步法RT-PCR检测试剂盒。
4.2.10（一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒。5生物安全要求
5.1采样、样品处理及检诞过所涉及的实验操作，应遵守GB19489的有关规定。5.2IBDV核酸检方法的实验室规范（参见附录A)。6样品的采第
6.1按照GB/T18088的要求进行样品的采集。6.2样品包括各种病料、用于IBDV监测和检测的离组织、IBDV的细胞培养液、IBDV接种鸡胚的尿囊液等。
7核酸抽提
7. 1酐三氯甲烷抽提法
7.1.1取灭菌的1.5mL离心管，做好标识。7.1.2每管加人600μL裂解液，分别加人被检样本、阴性对照SPF鸡的法囊组PBS研磨上清液)、阳性对照(标准的 IBDV毒株)各 200 μL,再加人 200 μL 三氧甲烷,混器上振荡混勾 5 s,于 4 ℃12000g离心15min.
7.1.3取无RNA酵的1.5mL离心管，加人一20℃预冷100μL异丙醇，吸取本标准7.1.2各管中的上清液转移至相应的管中，避免吸出中间层，颠倒混匀：7.1.4于4℃12000g离心15min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾千液体，加人600μL75%预冷乙醇，洗漆。
7.1.5于4℃12000g离心10min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，7.1.610000g离心10s用微量加样器将其吸于，室温干5min~10min，7.1.7加人15μL无核酸降解酶的水，溶解管底的RNA，5000g离心5s，冰上保存备用。若需长期保存应放置一70 亡冰箱。
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7.2其他核酸抽提法
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核酸提取可以采用等效RNA提取试剂及方法，如采用自动化核酸抽提工作站来抽挺核酸。8RT-PCR 检测
8. 1 引物
8.1.1针对A片段VP2基因的引物
上游 U3:5'-TCT-AAA-ACG-ACC-CCC-ACT-GCA-TGC-GGT-ATG-TGA-GGC-TTG-GTG-AC-3'F 游 L3 : 5'-CAG-GAA-ACA-CCT-ATG-ACC-GAA-TTC-GAT-CCT-GTT-GCC-ACT-CTT-TC-38. 1. 2 针对 B片段 VP1 基因的引物上游+29G:5'-TGT-AAA-ACG-ACG-GCC-AGT-GAA-TTC-/AGA-TTC-TGC-AGGHCAC-GGT-CTC-T-3下游-861: 5'-CAG-GAA-ACA-GCT-AIG-ACC-CTGCAG-TTG-ATG-ACT-TGA-GGT-TGA-TTT-TG-38. 1. 3引物组成的说明
8. 1. 3. 1 近用引物 M13 或 R13(黑体部分)序列。M13 或 R13 序列为多数测序反应中的测序引物,便于对 PCR扩增产物测序。
8, 1. 3.2限制性内切酶位点(下划线部分)。限制性内切酶位点的引人,使得 IBDV 经 RT-PCR扩增后的产物可限制性内切酶SphI引物U3）,EcoRI（引物L3和十290）、PstI(引物一861)进行酶切后划人质粒牛。引物U3和L3分别对应AccNoX84034毒株序列片段A的657-676和1193—1212位置，引+226和793分别对应A心NoAF240687毒株序列片段B中的290一311和861一883位置。8.1.3.3IBDV特异性序列<斜体部分）。^片段扩增产物为604bp,B片段扩增产物为642bp，引物扩增片段适合进行IBDV分子分析和分子流行病学研究。8.2反应液的配制
按照商业化的·-步法RT-PCR试剂盒推荐说明书，进行IBDVRT-PCR友应液的配制（参见附录B)。将配制的每个PCR反应试剂充分混匀,瞬时离心后转移至样本处理区。8、3加样
在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加入已提取好的核酸5μL，混勾后瞬时离心，将PCR管放人PCR检测仪内，记录样本放置顺序，8.4PCR扩增检测
8.4.1在扩增检测区进行。
8. 4. 2 PCR 反应条件为:
第一步+反转录50℃ 45 min
第二步:94 C 5 min(如果为热启动一步法 RT-PCR 试剂盒,则需要 95 ℃ 15 min);第三步：94℃30s54℃45s，72℃1min30s,5个循环；第四步：94℃30564℃45s72℃1min30530个循环；第五步t72 延伸 10 min。
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GB/T27634--2011
8.5上样和电泳
配制凝胶(见附录C)，将样品的扩增产物按编号加人对应的1%琼脂糖凝胶的各孔中，其中一个上样孔中人标谁阳性对照扩增产物，一个上样孔中加人标准阴性对照打增产物。在凝胶的边孔中加入标准分子质量的DNAMarker。将凝胶在80V短定电压F电冰60min。将凝胶置紫外灯或疑胶成像议中进行检查。
8.6结果判定
8. 6. 1°阳性
出现一条分子两量为604bp条带，与阳性对照PCR产物同步迁移的大小相同条带，判为IBDV片段A核酸阳性。出现一条分子质为642bp条带，与阳性对照PCR产物同步迁移的大小相同条带，判为IBDV片段B核酸阳性。片段A和片段B同时出现核酸阳性，可以判定IBDV阳性。8. 6. 2 明性
片段A和片段B同时出现核酸阴性，IBDV判为阴性。8.6.3可疑
在片段 A 和片段 B 的核酸检测中,只山现其中一个片段为阳性,另一个片段为阴性,则判定为IBDV可疑。结果可应进行实时荧光RT-PCR检测；或重复进行RT-PCR检测，出现AB两个片段中任何一个片段判定为阳性，否则判定为阴性。9实时光RT-PCR检乱
9. 1引物和探针
9, 1. 1 针对 A 片段 VP2 基因的引1物上游引物，5＇TTEATACGGAGCCTTCTGAT3；下游引物：5＇ACAATTAGCCCTGACCCT 3*9.1.2T=qMan 探针:5\FAM CAACCGGACCGGCGTCCATTC-RHQ 3*,其 5'端和 3'端分别标记FAM和BHQ:
9.2扩增检测
9,2. 1扩增试剂准备
在反应滤合物配制区进行。按照商业化的步法实时荧光RT-PCR（rcaltimeRT-PCR)试剂盒推荐说明，进行IBDVrealtimeRT-PCR反应液的配制（参见附录D)。将配制的每个PCR反应试剂充分混匀，瞬时离心后转移至样本处理区。9.2.2加样
在已分装有 PCR反应混合较的 PCR 管中分别如人已提取好的核酸 5 μL，混勾后开时离心,将PCR管放人荧光PCR检测仪内，记录样本放置顺序。9.2.3PCK扩增检测(扩增检测区）9.2.3.1反应条件设定
第一步：反转录4530min；
TTTKAONYKACA
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第一步：热启动95℃15min(不向的生产商家推荐的时间不同，应根据说明书进行)；第三步：95℃15s，6045s40个循环，60℃时设置采巢荧光。9. 2. 3. 2荧光素设定
报告荧光（reportdye）设定为FAM或按探针实际标记的荧光基团设定），淬灭荧光（quenchdye）设定为None，校准荧光referencedye）设定为None。可根据不同品牌仪器说明等效设置参数。9,3分析条件设定和结果判定
9.3.1解值设定
综合分析仪器给出的各项结果，基线（baseline）以仪器给出的默认值作为参考，阅值（threshola)设定原则以网值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准，具体还需根据仪器噪声情况进行调整，选择FAM通道进行分析。
9.3.2质控
阴性对照应无Ct值，阳性对照的Ct值应≤30，且呈现S型典型扩增典线。二考均成立才可判定试验成立·否则试验无效。
9.3.3荧光PCR结果分析及判定
9.3.3.1阳性反应结果判定
在试验成立的条件下，检测结果是现Ct值35.且扩增曲线有明显的对数增长期，判为荧光PCR阳性反应，表明IBDV核酸阳性。9. 3. 3. 2明性反应结果判定
检测结果呈现无Ct值、无扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期，判为荧光PCR阴性反应，表明IBDV核酸阴性。
9. 3. 3. 3可疑反应结巢判定
检测结果35
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A，1实验室设置要求
（资料性附录）
LBDV核酸检测方法的实验室规范A.1.1实验室分为三个相对独立的工作区域：样本制备区、PCR反应混合物配制区和检测区，并且明确标认。
A, 1. 2 每:-区域应有专用的仪器设备,并且明确标识。A.1.3进人各个工作区域严格遵循单一方向顺序，即只能从样本制备区,PCR反应混合物配制区至检测区。www.bzxz.net
A1.4在不同的工作区域应使用不同颤色或有明显区别标志的工作，工作服不能穿离各特定区域。A：1.5实验室清洁时应按PCR反应混合物配制区，样本制备区至检测区的顺序进行。A，1.6不同的实验区域应有其各自的清洁用具，以防止交叉污染。A.2工作区域仪器设备配置
A.2.1样本制备区仪器设备配置
2℃～8冰箱，—20℃冰箱，冰冻台式离心（=12000g），混勾器：微量加样器0.5叫L~1015μL~20 μ,20 μL200 μl,200 μL~1 000μ);可移动紫外灯。A. 2. 2 PCR 反应混合物配制区2℃~8冰箱，一20冰箱：台式离心机（3000g）：混勾器；微量加样器（0.5uL~～10μL，5 μ～20 μL,20 μL～200 μL,200 xL~～1 000 μI);可动紫外灯。A 2. 3检测区仪器设备配置
荧光PCR仪，可移动紫外灯；打印机。A,3各工作区域功能及注意事项
A.3.1样本制备区
A.3.1.1标本的保存，核酸提取、贮存及其加人至扩增反应管在样本制备区进行。A.3.1.2可在本区内设立正压条件以避免邻近区的气溶胶进入本区选成污染。A3.1.3用过的加样器吸头应放人专门的消毒（例如含次氯酸钠溶液)容器内。实验室桌梳表面每次工作后都要清洁，实验材料（原始样本、提取过程中样本与试剂的混合液等）如出现外溅，应作清洁处理并作出记录。
A3.1.4对实验台适当的紫外照射（254nm波长，与工作台面近距离）可以韬助灭活病毒和消踪核酸的污染。工作后通过移动紫外线灯管来确保对实验台面的充分照射：A. 3. 2PCR反应混合物配制区
A.3.2.1试剂的分装和反应混合液的制备在本区进行。b
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A.3.2.2在警个本区的实验操作过程中，操作者应裁于套。工作结束后应立即对工作区进行清洁：本工作区的实验台表面成可耐受诸如次氟龄钠等的化学物质的消毒清洁作用。A.3.3检测区
在本区进行荧光PCR检溯。
A. 3. 3. 1
A, 3. 3. 2
FCR扩增产物不能在本实验室开盖，PCR管应弃在远离本实验室的垃圾箱中，A.3.3. 3
实验完成后采用紫外灯对实验室进行充分照射。了
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附录B
（资料性附录）
IBD>V RT-PCR 反应液的配制
每份检测样品的 IBDV RT-PCR体系(50 uL)如表 B.1表 B. 1
无核酸降解酶的水
10XOne step RNA PCR Buffer
MgCle(25 rumol/L)
dNTP Mixture(各 10 mmol/L)
上游引物(20 μmol/mL)
下游引物(20 μml/ml.)
RNase Inhibitor(40 U/μL)
AMV RTase XL(5 C/μL)
AMY-Optimized Taq(5 U/μL)
总体积
注：不同公司生产的one siep RT-PCR试剂盒反应成分不同，体系不同，可根据相应的说明书进行替收。8
C.1琼脂糖凝胶的TAE缦冲液（50×）三羟甲基氨基甲烷碱(Tris-base)附录C
（规范性附录）
电泳缓冲液的配制
0.5 mal/L(pH8. 0)乙 --胺州Z酸(NayEDTA +2H:0) 100 mL冰乙酸
燕馏水
待上述混合物完全溶解后,加蒸馏水至1000 mI至4℃泳箱中备用。GB/T27634—2D11
如配制1%的琼脂糖凝胶和用作电泳缓冲液，则用蒸水稀释50倍成TAE缓冲液。C.21%琼脂糖凝胶板制备
取0.5g琼脂糖加入50mL1×TAE缓冲藏中，在微波炉中充分溶解后，冷却至60℃后，加入3μL10mg/mL溴化乙锭，倒人凝胶板中，插入梳子，待凝胶完全疑周后拔去梳子，备用。9
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附录D
(资料性附录）
IBDV real tirne RT-PCR 反应液的配制每份检测样品的 IBDV real time RT-PCR 体系(25 μL)如表 D, 1。表 D. 1
2X RT PCR Buffer
Enzyme Mix
王游引物(1a μmal/mL)
下游引物(l0 μmol/mL)
TanMan操针(s μmol/mL)
无核酸降解醇的水
总体积
注:不同公司生产的 real time De atep RT-FCR 试剂盒反应成,分不同,体系不同,可根据相应的说明书进行替改,10
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