GB/T 27642-2011
基本信息
标准号： GB/T 27642-2011
中文名称：牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准简介
GB/T 27642-2011 牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法
GB/T27642-2011
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标准内容
ICS 65, 020. 30
中华人民共和国家标雅
GB/T 27642—2011
牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法
Bovine individual and parental identification using microsatellite DNA2011-12-30 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2012-04-01实施
规范性引用文件
术语、定义和缩略语
防污染措施
6个体鉴定和亲了鉴定试验步骤
附录A（资料性阳录）试剂配制及仪器附录B（资料性录）DNA样品的制备自
附录C（资料性附录）光谱校正和PCR反应,测定及分析附录 D（资料性附录）FAO-ISAG 推荐的牛微卫星 DNA 标记附录E（资料性附录）个体及亲子鉴定计算方法TTKONKAA
GB/T 27642-—2011
本标准按照GB/T1.1—2009的规则进行起草。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口，本标准起草单位：全国畜牧总站。本标准主要起草人刘丑生、王志刚、孙飞舟、邱小田,韩旭,于福清、张桂香TTTKANYKACA
GB/T 27642—2011
1范围
牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法
本标准规定了利用微卫星DNA标记进行牛个体及亲子鉴定的技术规程，本标准适用于普通牛《Bastrus)个体和亲子鉴定。2规范性引用文件
GB/T27642—2011
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用义件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不往口期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GA/T383法庭科学DNA实验室检验规范SN/T1193基因检验实验室技术要求3术语、定义和缩略语
下列术语定义和缩略语适用于本文件。3.1
聚合酶链式反应polymerase chaln reaction, PCR以一对寡核苷酸引物、μ种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA案合酶催化下，在体外人工合成特异的DNA片段的过程。3.2
微卫星DNAmicrosatelliteDNA
亦称短串联重复序列或简单重复序列（shorttandemrepeats，STRs；simplesequencerepeats，SSRs）,以1hp～6bp的短核苷酸序列为基本单位,呈串联重复状散在分布于生物体基因组中。3.3
非父排除概率prubability of paternity exclnsion,PE通过检测某一个遗传标记，能将不是生父的争议父亲排除的概率。3.4
累积非父排除率cumulalive probability of patermity exclusion, CPE通过检测某一遗传标记系统的多个迪传标记，将不是生父的个体否定择的累计概率。3.5
亲权指数paternity index,PI
争议交亲提供生父等位基因成为了代生交的概率与随机公畜提供生父基固成为子代生交概率的比值。
军积亲权指数cumulative patermity Index,CPl根据某一避传标记系统中的率个标记，计算率个亲权指数的累积。3.7
父于关系相对概率relative chance of paternlty,RCP争议父亲是亲生父亲的相对概率。1
TTKANYKACA
GB/T 276422011
4原理
4.1个体鉴定原理
某一被检样品与真样品微卫标记的基因型不同，则判定被检样品与真样品来自不同个体，如果相同不那除它们米自同一个体，通过对某一遗传标记系统的多个标记所检测，可在：-定概率水平工判定被测样品与真样品是香来自局·个体。4.2亲子鉴定原理
根据盂德尔遗传分离定律,在配子细胞形成时,成对的等位基因彼此分离，随机进人配子细胞。双亲的配子细胞结合形成合子，其发育出来的子代的成对等位基因分别米自父亲和母亲。根据多个标记计算的鉴定结果在一定概率水平上可以判定年议父亲（母亲）是否为亲生父亲（母亲）（变异情况除外）。5防污染措施
按 SN/T1193和GA/T383规定的方法执行。6个体鉴定和亲子鉴定试验步票
6.1样品制备
收葉血滋织(耳、肌肉、尾、皮肤等），毛囊或精等树料。6. 2样品DNA的制备Www.bzxZ.net
各样品试剂配方、所需的仪器设备参见附录A，具体步骤参见附录B。6.3光谱校正
在实验前进行一次四色荧光素的光谱校正，目的为了校难信号重叠。具体步骤参见 C.1,6. 4微卫垂 DNA标记
参见附录 D。
6. 5PCR 反成
6.5.1PCR反应体系
参见表 C. 1。
6. 5. 2 PCR 反应程序
参见表C.2。
6.5.3PCR产物电泳检测
敢适量PCR产物，上样于1%~3%的琼脂糖凝胶中进行电泳,检测本次扩增反应是否成功。2
TTTKAONYKACA
6.6测定及分析
通过分析得到微卫星标记的基因型率，荐见.3，6. 7利用微卫星 DNA 法进行个体鉴定的概率计算和缩果表述GB/T27642--2011
被检样品的基困型与真样品不向，可排除两份样品来源同一-个体（变异情况除外）。如果两份样品的基因型相同时，则按式（1)计算偶合概率，当其值小于该个体所在群体数量的倒数时（5×10\），认定两份样品来源于同一个体。偶合恍率尼一组微卫星标记基因型频率的乘积。P=P,×P,XP,×.×P.
Pμ- 偶合概率;
-一第个微卫星标记的基因型颇率。6. 8利用微卫显DNA 法进行亲子鉴定认定和排除据1
累积非父排除率≥99.73%、父子关系相对概率≥99.95%或累积亲权指数≥2000，判定争议父亲为生父；累积非父排除率低于99.73%并且有3个以上标记不符合孟德尔遗传分离规律时，排除亲缘关系；如果累积非父非除率低于99.73为并且有3个以下的作为不符合孟德尔遗传分离规律时，应适当增加检测的标记数量。具体计算公式参见附录E。TTTKAONYKACA
GB/T 27642—2011
A.1试剂配制
血液裂解液见表A,1。
贮存液浓度
1 mol/L Tris-HCl(pH8. 0)
D, 5 mol/L EDTA(pHE. 0)
10%5DS
灭菌双蒸水加至
（资料性附录）
试剂配制及器
表 A. E 血液表解在
组织 DNA 及毛囊提取液见表 A, 2 。表A2
组织 DNA提取液
贮存液浓度
1 mol/L Tris HCl(pH8. 0)
0, 5 mol/I. EDTA(pH8. 0)
0, 5 mol/L NaCl
10% SDS
灭菌双蒸水加至
A. 1. 3 精子裂解液见表 A, 3。存浓度
1 mol/L This-HClpH8, 0)
0. 5 mol/L EDTA(pH8. 0)
0. 5 mol/L NaC1
10%SDS
1mol/LDTT（现用现加）
灭菌双蒸水加至
表 A, 3 精于裂解液
使用浓度
10 mmal/t.
100 tnmol/L
使用浓度
50 mmal/1.
100 mmol/L
100 mmol/L
使用度
10 mmol/L
10mmol/L
100 mmal/L
39 μmol/L
A. 1. 4精子洗涤液
CB/T 27642-—2011
取1mol/L的NaCl37.5mL,0.5ma1/L的EDTA5mL,加双蒸水至250mI。高压灭菌备用。A 1. 5蛋白酶 K存羧(20 mg/mL)200mg蛋白酵K溶于10mL灭菌双蒸水中，分装，每管1mL，一20℃炼存。A, 1,6TE缓许液(pH8.0)
10mmpl/LTris-HCI(p8.0),Immol/LEDTA(pH8.0)A.1.7电泳缓冲液
1XTris-Z酸(TAE)：0.04mol/LTris-乙酸.0.01mol/LEDTA0, 5XTris-0.05%漠酚蓝，0.12为二甲苯青FF-10%（质量液度）嵌糖水溶液；或 0.05%浪酚蓝,0.12%二甲苯青FF,30%(体积分数)甘油水溶液。A. 1, 10 1 mal/L —硫苏糖醇(DTT)那 20 mL D. 01 mol/L 乙酸钠溶被(pH5. 2>溶解 3, 09 & DTT,过滤除菌后分装成 1 mL 些存十一20C。注意：DTT或含有DTT的辫不能进行高压处理，A. 1. 11 1 mol/L Tris(H8.0)
将 121. I gTris 溶于 800 mL 水中,加浓盐酸调 pH 值至 8. 0,定容至 1 000 mL 后高压灭菌。A. 1, 120. 5 mol/L EDTA(pH8, 0)将186.1gNaEDTA.2H.0.加入800L水中，再加入NaOH（约20g）调pH值至8.0定容后高压灭菌，
A.1.1310%SDS (500 mL)
将50gSDS加入400mL水中60℃加热溶解，定容后过滤灭菌。A,1.14Tris饱和翻。
5：三氟甲烷：异戊醇(2524 :1)混合液。A. 1. 15
三氯甲烷：异戊醇(21 ：1)混合液。A,2仪器
遗传分析仪。
PCR仪。
低温高速离心机。
生物分光光度让。
稳压稳流电泳仪。
八道电子可调移液器（量程5μ～100μL)，八道电子可调移液器（量程0.2μL～10μL)。单道可调移液器（2μ，10200μ1000μ)。电子天平（甚程0.01mg300mg）。A.2. 10
水浴恒温药器。
费通离心机。
紫外光检测仪。
超声波清洗器。
超纯水器。
高压灭南器。
GB/T 27642—2011
B.1样品预处理
B. 1. 1从血液中提取基因组DNA附录B
(资料性附录)
DNA样品的制备
B.1.1,1取适量血液加入等体积血样裂解被，加人RNA酶至终浓度为 20μg/m1.,充分混勾，于 37℃水浴消化 1 h2 h。
B.1.1.2加人蛋白酶K烂存液至终浓度为100μg/mL，充分混匀，55C水消化12h以上至不见粘稠的团块。
B.1,2从组织中提取基因组 DNA
B. 1. 2. 1 破 0. 3 的组级置于 1. 5 mI. 离心管中,将其破碎15.1.2.2晾千后加人500μL组织DNA提取滋，熟后加人RNA酶至终浓度为20g/mL,充分匀，37水裕消化1h。
B.1.2.3加蛋白酶K忙存液至终浓度为150μg/mL~200g/mL，充分混匀,55℃水浴消化12h以上至不见有维织块。
B. 1, 3从毛囊中提取基因组 DNAB.1.3.1用灭菌双蒸水涤毛囊，剪碎,置于小离心管甲。B. 1.3. 2晾干后加人 30 μL~50 μL组织 DNA提取液,然后加人蛋白酶 K 至整浓度为 200 μg/mL.充分混匀，55它水裕消化12h以上至毛囊完全落解。B. 1. 4从精液中提取基因组 DNAB.1.4.1每一个体取冻精三粒或鲜精0.4mL置于1.5mL离心管中。B. 1. 4. 2 加等量精子洗涤液,4 500 r/ min 离心 6 min,弃上清液。B.1.4.3重复洗涤精子沉淀两欲，去掉其中的卵黄甘油等物质。B.1.4.4用0.4mL精子裂解液重悬沉淀。B.1.4.5加人蛋白酶K贮存液至终浓度为100Fg/mL，充分混勺,55℃水浴消化过夜至少12h。B.2样品抽提
B. 2. 1 加人等体积 Tris 饱和酚,反复颠倒离心管,使两相溶液充分混合形成乳浊液,4 ℃ 4 500 r/ mil离心15m1五小心吸取上滑我转移至另一洁净的离心管中重复该操作一次。B. 2. 2加入等体积的醛 三氯甲烷 异戊醇(25 : 24 : 1)混合液+缓慢题倒离心管,使两相溶液充分混合，4℃4500r/min离心15min
B.2.3加入等体积三氧甲烷：异戊醇（24：1)混合液，缓慢颠倒离心管，使两相溶液充分混合，4℃450or/min离心15min;收案上清至另一离心管中。B. 2. 4将上清液吸至较大容量的试管中,加人 1/10 体积 3 m1/L NaAc溶液(pH5.2)和 2.5 倍体积的6
预无水乙醇，轻轻摇动试暨至出现自色累状DVA沉淀。B.2.5将 DNA沉淀转移到1. 5 mL 离心管中,用 75%乙醇洗漆两次。B, 2. 6将 DNA T燥后加人适量 TE缓冲滋或灭菌双蒸水室温溶解 24 h。3样品基因组DNA浓度检测
GB/T27642—2011
吸出适虽提取的DNA，稀释50倍，用生物分光光度仪检测DNA的浓度，根据测定结果再将DNA辫获稀释至预定值，较纯 DNA样品的A25c/Az6o比值为1.8左右I若该比值大大低于 1.8,说明样品中含有较多的蛋白质，庞进一步纯化。H=A20×N×50
式中：
H—-DNA浓度，单位为微克每旁升(ug/mL）;N--稀释倍数,
对于双链DNA来说，10D=50g/mL。4样品基因组DNA纯度和质量检测4
.-(R.1)
吸山适量提取的DNA，在琼脂糖疑胶中进行电泳，然后在紫外透视仪下检测DNA质量，如果DNA条带比较整齐亮度较高，DNA样品的A2/A5比值为1.8左右，则说明提政的DNA样品可以用于牛个体及亲子监定。
GB/T 27642——2011
C. 1光谱校正的具体步骤
附录C
(资料性附录)
光错校正和PCR反应，剩定及分析C.1.1将标准品中的4支离心管充分混合离心。C.1.2从4臂中各取混合好的标准标记品（内含5FAM,JOE,NED,ROX)1.25μL，再加195μL的商纯度甲酰胺转移至另：-1.5mL的离心管中。C.1.3充分混勾离心。
C.1.495变性5min,4C保存10 min。C.1.5敢10μL变性产物圳到96孔上样板上，把96孔上样板放到遗传分析仪中。C.1.6毛细管电泳参考条件：
毛细管：长度36cm，内壁无涂层；推荐炉温:60 ℃。
C. 1.7如果校正结果能够达到仪器所要求的参数范围,则预实验通过，标准品测试结果要求 Q值>0. 95,C 值在 4 ~~8. 5 之间。C.2PCR反应体系及反应程序
表 C, 1 PCR 反应体系
PCRBuifer
dNrPs(10 mmol/1.)
AmpliTaq Gold DNA 案台酶(2. 5 U/μL)11 对引物的很合物
去离子水
样品基因组 DNA
总体积
PCR反应程序
预变性
94 ℃
35个~40个循环
55 ~63
72 ℃
单供反应体系
最后延神
测定及分析
GB/T 27642—2011
将PCR产物稀释15倍，从中取1μL与11.5μL甲酰胺和0.25μL分子量内标混合，95℃变性2min~5min，立即放410min。
C. 3. 2分析
以样品峰长度值和分子量内标的峰长度值比较定量。得到各标记的等位基因片段大小，计算基因型频率。
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牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法
Bovine individual and parental identification using microsatellite DNA2011-12-30 发布
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2012-04-01实施
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防污染措施
6个体鉴定和亲了鉴定试验步骤
附录A（资料性阳录）试剂配制及仪器附录B（资料性录）DNA样品的制备自
附录C（资料性附录）光谱校正和PCR反应,测定及分析附录 D（资料性附录）FAO-ISAG 推荐的牛微卫星 DNA 标记附录E（资料性附录）个体及亲子鉴定计算方法TTKONKAA
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本标准按照GB/T1.1—2009的规则进行起草。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口，本标准起草单位：全国畜牧总站。本标准主要起草人刘丑生、王志刚、孙飞舟、邱小田,韩旭,于福清、张桂香TTTKANYKACA
GB/T 27642—2011
1范围
牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法
本标准规定了利用微卫星DNA标记进行牛个体及亲子鉴定的技术规程，本标准适用于普通牛《Bastrus)个体和亲子鉴定。2规范性引用文件
GB/T27642—2011
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用义件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不往口期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GA/T383法庭科学DNA实验室检验规范SN/T1193基因检验实验室技术要求3术语、定义和缩略语
下列术语定义和缩略语适用于本文件。3.1
聚合酶链式反应polymerase chaln reaction, PCR以一对寡核苷酸引物、μ种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA案合酶催化下，在体外人工合成特异的DNA片段的过程。3.2
微卫星DNAmicrosatelliteDNA
亦称短串联重复序列或简单重复序列（shorttandemrepeats，STRs；simplesequencerepeats，SSRs）,以1hp～6bp的短核苷酸序列为基本单位,呈串联重复状散在分布于生物体基因组中。3.3
非父排除概率prubability of paternity exclnsion,PE通过检测某一个遗传标记，能将不是生父的争议父亲排除的概率。3.4
累积非父排除率cumulalive probability of patermity exclusion, CPE通过检测某一遗传标记系统的多个迪传标记，将不是生父的个体否定择的累计概率。3.5
亲权指数paternity index,PI
争议交亲提供生父等位基因成为了代生交的概率与随机公畜提供生父基固成为子代生交概率的比值。
军积亲权指数cumulative patermity Index,CPl根据某一避传标记系统中的率个标记，计算率个亲权指数的累积。3.7
父于关系相对概率relative chance of paternlty,RCP争议父亲是亲生父亲的相对概率。1
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4原理
4.1个体鉴定原理
某一被检样品与真样品微卫标记的基因型不同，则判定被检样品与真样品来自不同个体，如果相同不那除它们米自同一个体，通过对某一遗传标记系统的多个标记所检测，可在：-定概率水平工判定被测样品与真样品是香来自局·个体。4.2亲子鉴定原理
根据盂德尔遗传分离定律,在配子细胞形成时,成对的等位基因彼此分离，随机进人配子细胞。双亲的配子细胞结合形成合子，其发育出来的子代的成对等位基因分别米自父亲和母亲。根据多个标记计算的鉴定结果在一定概率水平上可以判定年议父亲（母亲）是否为亲生父亲（母亲）（变异情况除外）。5防污染措施
按 SN/T1193和GA/T383规定的方法执行。6个体鉴定和亲子鉴定试验步票
6.1样品制备
收葉血滋织(耳、肌肉、尾、皮肤等），毛囊或精等树料。6. 2样品DNA的制备Www.bzxZ.net
各样品试剂配方、所需的仪器设备参见附录A，具体步骤参见附录B。6.3光谱校正
在实验前进行一次四色荧光素的光谱校正，目的为了校难信号重叠。具体步骤参见 C.1,6. 4微卫垂 DNA标记
参见附录 D。
6. 5PCR 反成
6.5.1PCR反应体系
参见表 C. 1。
6. 5. 2 PCR 反应程序
参见表C.2。
6.5.3PCR产物电泳检测
敢适量PCR产物，上样于1%~3%的琼脂糖凝胶中进行电泳,检测本次扩增反应是否成功。2
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6.6测定及分析
通过分析得到微卫星标记的基因型率，荐见.3，6. 7利用微卫星 DNA 法进行个体鉴定的概率计算和缩果表述GB/T27642--2011
被检样品的基困型与真样品不向，可排除两份样品来源同一-个体（变异情况除外）。如果两份样品的基因型相同时，则按式（1)计算偶合概率，当其值小于该个体所在群体数量的倒数时（5×10\），认定两份样品来源于同一个体。偶合恍率尼一组微卫星标记基因型频率的乘积。P=P,×P,XP,×.×P.
Pμ- 偶合概率;
-一第个微卫星标记的基因型颇率。6. 8利用微卫显DNA 法进行亲子鉴定认定和排除据1
累积非父排除率≥99.73%、父子关系相对概率≥99.95%或累积亲权指数≥2000，判定争议父亲为生父；累积非父排除率低于99.73%并且有3个以上标记不符合孟德尔遗传分离规律时，排除亲缘关系；如果累积非父非除率低于99.73为并且有3个以下的作为不符合孟德尔遗传分离规律时，应适当增加检测的标记数量。具体计算公式参见附录E。TTTKAONYKACA
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A.1试剂配制
血液裂解液见表A,1。
贮存液浓度
1 mol/L Tris-HCl(pH8. 0)
D, 5 mol/L EDTA(pHE. 0)
10%5DS
灭菌双蒸水加至
（资料性附录）
试剂配制及器
表 A. E 血液表解在
组织 DNA 及毛囊提取液见表 A, 2 。表A2
组织 DNA提取液
贮存液浓度
1 mol/L Tris HCl(pH8. 0)
0, 5 mol/I. EDTA(pH8. 0)
0, 5 mol/L NaCl
10% SDS
灭菌双蒸水加至
A. 1. 3 精子裂解液见表 A, 3。存浓度
1 mol/L This-HClpH8, 0)
0. 5 mol/L EDTA(pH8. 0)
0. 5 mol/L NaC1
10%SDS
1mol/LDTT（现用现加）
灭菌双蒸水加至
表 A, 3 精于裂解液
使用浓度
10 mmal/t.
100 tnmol/L
使用浓度
50 mmal/1.
100 mmol/L
100 mmol/L
使用度
10 mmol/L
10mmol/L
100 mmal/L
39 μmol/L
A. 1. 4精子洗涤液
CB/T 27642-—2011
取1mol/L的NaCl37.5mL,0.5ma1/L的EDTA5mL,加双蒸水至250mI。高压灭菌备用。A 1. 5蛋白酶 K存羧(20 mg/mL)200mg蛋白酵K溶于10mL灭菌双蒸水中，分装，每管1mL，一20℃炼存。A, 1,6TE缓许液(pH8.0)
10mmpl/LTris-HCI(p8.0),Immol/LEDTA(pH8.0)A.1.7电泳缓冲液
1XTris-Z酸(TAE)：0.04mol/LTris-乙酸.0.01mol/LEDTA0, 5XTris-
将 121. I gTris 溶于 800 mL 水中,加浓盐酸调 pH 值至 8. 0,定容至 1 000 mL 后高压灭菌。A. 1, 120. 5 mol/L EDTA(pH8, 0)将186.1gNaEDTA.2H.0.加入800L水中，再加入NaOH（约20g）调pH值至8.0定容后高压灭菌，
A.1.1310%SDS (500 mL)
将50gSDS加入400mL水中60℃加热溶解，定容后过滤灭菌。A,1.14Tris饱和翻。
5：三氟甲烷：异戊醇(2524 :1)混合液。A. 1. 15
三氯甲烷：异戊醇(21 ：1)混合液。A,2仪器
遗传分析仪。
PCR仪。
低温高速离心机。
生物分光光度让。
稳压稳流电泳仪。
八道电子可调移液器（量程5μ～100μL)，八道电子可调移液器（量程0.2μL～10μL)。单道可调移液器（2μ，10200μ1000μ)。电子天平（甚程0.01mg300mg）。A.2. 10
水浴恒温药器。
费通离心机。
紫外光检测仪。
超声波清洗器。
超纯水器。
高压灭南器。
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B.1样品预处理
B. 1. 1从血液中提取基因组DNA附录B
(资料性附录)
DNA样品的制备
B.1.1,1取适量血液加入等体积血样裂解被，加人RNA酶至终浓度为 20μg/m1.,充分混勾，于 37℃水浴消化 1 h2 h。
B.1.1.2加人蛋白酶K烂存液至终浓度为100μg/mL，充分混匀，55C水消化12h以上至不见粘稠的团块。
B.1,2从组织中提取基因组 DNA
B. 1. 2. 1 破 0. 3 的组级置于 1. 5 mI. 离心管中,将其破碎15.1.2.2晾千后加人500μL组织DNA提取滋，熟后加人RNA酶至终浓度为20g/mL,充分匀，37水裕消化1h。
B.1.2.3加蛋白酶K忙存液至终浓度为150μg/mL~200g/mL，充分混匀,55℃水浴消化12h以上至不见有维织块。
B. 1, 3从毛囊中提取基因组 DNAB.1.3.1用灭菌双蒸水涤毛囊，剪碎,置于小离心管甲。B. 1.3. 2晾干后加人 30 μL~50 μL组织 DNA提取液,然后加人蛋白酶 K 至整浓度为 200 μg/mL.充分混匀，55它水裕消化12h以上至毛囊完全落解。B. 1. 4从精液中提取基因组 DNAB.1.4.1每一个体取冻精三粒或鲜精0.4mL置于1.5mL离心管中。B. 1. 4. 2 加等量精子洗涤液,4 500 r/ min 离心 6 min,弃上清液。B.1.4.3重复洗涤精子沉淀两欲，去掉其中的卵黄甘油等物质。B.1.4.4用0.4mL精子裂解液重悬沉淀。B.1.4.5加人蛋白酶K贮存液至终浓度为100Fg/mL，充分混勺,55℃水浴消化过夜至少12h。B.2样品抽提
B. 2. 1 加人等体积 Tris 饱和酚,反复颠倒离心管,使两相溶液充分混合形成乳浊液,4 ℃ 4 500 r/ mil离心15m1五小心吸取上滑我转移至另一洁净的离心管中重复该操作一次。B. 2. 2加入等体积的醛 三氯甲烷 异戊醇(25 : 24 : 1)混合液+缓慢题倒离心管,使两相溶液充分混合，4℃4500r/min离心15min
B.2.3加入等体积三氧甲烷：异戊醇（24：1)混合液，缓慢颠倒离心管，使两相溶液充分混合，4℃450or/min离心15min;收案上清至另一离心管中。B. 2. 4将上清液吸至较大容量的试管中,加人 1/10 体积 3 m1/L NaAc溶液(pH5.2)和 2.5 倍体积的6
预无水乙醇，轻轻摇动试暨至出现自色累状DVA沉淀。B.2.5将 DNA沉淀转移到1. 5 mL 离心管中,用 75%乙醇洗漆两次。B, 2. 6将 DNA T燥后加人适量 TE缓冲滋或灭菌双蒸水室温溶解 24 h。3样品基因组DNA浓度检测
GB/T27642—2011
吸出适虽提取的DNA，稀释50倍，用生物分光光度仪检测DNA的浓度，根据测定结果再将DNA辫获稀释至预定值，较纯 DNA样品的A25c/Az6o比值为1.8左右I若该比值大大低于 1.8,说明样品中含有较多的蛋白质，庞进一步纯化。H=A20×N×50
式中：
H—-DNA浓度，单位为微克每旁升(ug/mL）;N--稀释倍数,
对于双链DNA来说，10D=50g/mL。4样品基因组DNA纯度和质量检测4
.-(R.1)
吸山适量提取的DNA，在琼脂糖疑胶中进行电泳，然后在紫外透视仪下检测DNA质量，如果DNA条带比较整齐亮度较高，DNA样品的A2/A5比值为1.8左右，则说明提政的DNA样品可以用于牛个体及亲子监定。
GB/T 27642——2011
C. 1光谱校正的具体步骤
附录C
(资料性附录)
光错校正和PCR反应，剩定及分析C.1.1将标准品中的4支离心管充分混合离心。C.1.2从4臂中各取混合好的标准标记品（内含5FAM,JOE,NED,ROX)1.25μL，再加195μL的商纯度甲酰胺转移至另：-1.5mL的离心管中。C.1.3充分混勾离心。
C.1.495变性5min,4C保存10 min。C.1.5敢10μL变性产物圳到96孔上样板上，把96孔上样板放到遗传分析仪中。C.1.6毛细管电泳参考条件：
毛细管：长度36cm，内壁无涂层；推荐炉温:60 ℃。
C. 1.7如果校正结果能够达到仪器所要求的参数范围,则预实验通过，标准品测试结果要求 Q值>0. 95,C 值在 4 ~~8. 5 之间。C.2PCR反应体系及反应程序
表 C, 1 PCR 反应体系
PCRBuifer
dNrPs(10 mmol/1.)
AmpliTaq Gold DNA 案台酶(2. 5 U/μL)11 对引物的很合物
去离子水
样品基因组 DNA
总体积
PCR反应程序
预变性
94 ℃
35个~40个循环
55 ~63
72 ℃
单供反应体系
最后延神
测定及分析
GB/T 27642—2011
将PCR产物稀释15倍，从中取1μL与11.5μL甲酰胺和0.25μL分子量内标混合，95℃变性2min~5min，立即放410min。
C. 3. 2分析
以样品峰长度值和分子量内标的峰长度值比较定量。得到各标记的等位基因片段大小，计算基因型频率。
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