GB/T 27981-2011
基本信息
标准号： GB/T 27981-2011
中文名称：牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.rar .pdf
下载大小：221KB
相关标签： 传染性 气管炎 病毒 实时 荧光 PCR 检测 方法
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
GB/T 27981-2011 牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法
GB/T27981-2011
标准压缩包解压密码：www.bzxz.net
标准图片预览
标准内容
ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T 27981--2011
牛传染性鼻气管炎病毒实时
荧光PCR检测方法
Real-tine PCR method for the detection ofinfectious bovine rhinotracheitis virus2011-12-30发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2012-06-01实施
本标准按照GB/T1.I--2009给出的规则起草。GB/T27981—2011
本标推参考了01E发布的陆生动物诊断试验和疫苗手册\（2008版）关下牛传染性鼻气管我/牛传染性化脓性外阴阴道炎（Chapter 2.4,13)的内容。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准草单位；中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。
本标准主要起草人陈茹、刘中勇、林志雄、罗琼、曾碧健、许如苏，姜焱、吴晓。TTKONKAcA
1范围
牛传染性鼻气管炎病毒实时
荧光PCR检测方法
GH/T 27981—2011
本标准规定了牛传染性身气管炎病毒（牛疱疹病毒I型，BoHV-1.>实时荧光PCR检测方法的技术要求。
本标准适用于快速检测牛血样、拭子、精液、动物组织（粘膜、肝、脾、肾、淋巴结、胎盘组织等)和细胞培养物等样品中 BoHV-i 病毒感染。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注月期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单）适用于本文件，GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法世界动物卫生组织（OIE)陆生动物诊断试验和疫苗标推手册（2008版）关于检测牛冷陈精液中BoHV-1摘毒的实时荧光PCR方法3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BoHV-1:hovincherpesvirustype1,牛疱疹病毒I型。Ct 值:荧光信号鼠达到设定的阈值时所经历的循环数。DNA，deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸。DIT:DL-dithiothreitol,二硫苏糖醇。ETAethylenedianinetetraaceticacid,二腔胺gzBRbovine infeetious rhinotracheitis,牛传染性鼻气管炎。PBS:phosphatebuffer solution，磷酸盐缓冲生理盐水。PcR：polymerasechainIeaction，亲合链式反应。SDS:sodium dodecyl sulfate,十二烷基磺酸销。UDG 酶;utacil DNA glycosylase,尿嘧啶 DNA糖基化酶。4设备和器材
4. 1荧光 PCR仪。
4. 2 台式冷冻离心机。
4.3可调微量移液器：规格10L.100ml.200、1mL。4.4带滤芯微量吸头：规格10uL,100μ,200μL.1mL。4, 5PCR光学反虚管。
微量离心管。
涡旋混匀器。
恒温培养箱。
冰箱:规格 2 ~8 ℃,-20 ℃,-80 ℃。TTTKONYKAA
GB/T 27981-2011
4.10恒温水浴箱。
5试剂bzxZ.net
除另有规定，本方法试验水应按照GB/T6682中规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯5.1引物与探针
引物与探针配制采用无 DNA酶、无 RNA酶水将每条引物与操针配制成 100 μtmol/L 储存液,置一20℃或更低温度冻存；使用时取适量配制成10μmol/L工作液，避免多次冻融。号物与操针序列：
gB 基因上游引物 g-F,'TGT GGA CCT AAA CCT CAC GGT 3*gB基因 F游物 gB-R:5*GTA GTC GAG CAG ACC CGT GTC 3*gB 基固探针:5*[FAM]-AGG ACC GCG AGT TCT TGC CGC [BHQ-1 3探针5'端标记的报告荧光基团及3'端标记的淳灭基团可根据荧光PCR仪设备等具体情况另行选定。
5.2蛋白酶K溶液：配制方法见附录A。5.3柠樣酸钠缓冲液：配制方法见附录A。5.40.5mo1/LEDTA:配制方法见附录A。5.50.01mo1/LpH7.2PBS：配制方法见附录A。5.610%chelex100：配制方法见附录A。5. 7 1 mol/L DTT:配制方法见附录 A。5.8 2 ×定量 PCR-UDG 酶预混液:含 60 U/rnI 热启动 Taq 酶,40 mmol/L Tris-HCl (pH8. 4),100 mmol/L KCl,6 mmol/L MgCl2,400 μmol/L dGTP,400 μmol/L dAIP,400 rmol/L dCTF.80Omol/LdUTP.40U/mLUDG。可采用经验证间靠的商品化预混戒。5.9核酸抽提试剂盒。
5.10无DNA酶、无RNA酶水.
5.11无水乙醇。
5.1270%乙醇：用新开启的无水乙醇和无DNA酶、无RNA酶水配制，一20C预冷，5.13三氯甲烷.
异丙畴。
6样品采集与处理
6.1样晶采集及前处理
6、1. 1 采样工具
采样工具需经(121士2)℃/0.1MPa高压15ain并烘于，或经160℃千烤2h灭菌。6。1.2血清、全血
用无菌注射器或采血专用真空管针无菌自牛静脉采血，无菌分离血清，直接用于核酸提取。用无菌注射器或采血专用真空管针无菌自牛静脉来血，将血液直接滴人抗凝剂中，并立即连续摇动,充分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲,或 0.5 mo1/L EDTA。每 6 mL血液加 1 mL抗凝剂。直接用于核酸提取。
6,1.3拭子
用无菌棉拭子采集睾道、生殖器官和眼分泌物，采集时，将狱子反复刮擦呼吸道或生殖器官粘膜，2
TTTKAONTKACA
GB/T27981—2011
取分密物后,立即将棉拭子浸人 I mL~2 mL 灭菌 0. 01 mol/L pH7. 2 的 PBS 中,1 ℃储存,尽快送达实验室。取样进行检验时，充分振动挤+试于，接池预采用4000m1离心1m，取上猜备用。6. 1. 4精液
将冷冻精液样品或新鲜精液样品分装到.5mL微量离心管中，充分解冻后，振药混均采用12000T/min离心305.取上接6.2.1或6.2.3进行核酸提联：或取原获按6.2.2或6.2.3提取核酸。毒一批次冷冻情液取3支冻精管，分别进行核醛提取和后续检测。6.1.5组织样品
韵检时无菌采集动物呼吸道粘膜、扁桃腺、肺部和支气管淋巴结，对流产胎儿，采集刚死亡胎儿肝、肺、肾、脾和胎盘组织。检测时，用无菌剪、摄取适量样品，按1：5的比例加,人灭菌0.01Ⅱol/LPH7.2的PS(例:1g组织样品加5mL溶液）.在研钵中剪碎，充分研磨，取研磨物分装到离心书中，冻融2次~3 次,4 000 r/min离心 5 min,取上清备用。6. 1. 6细胞培养物
细脑培养物冻融2次~3次：分装到1. 5 mL微量离心管中,4000 r/min离心1 min,取上清备用。6.2样品核酸抽提
6.2.1有机溶剂抽提法
适用于上述各种样品。取200μL经前处理的样品或对照，加200mL0.01mol/LpH7.2PBS缓冲液,加 SDS,蛋白酶K 至终浓度分别为 1%和 0. 5 mg/rmL,混勾器 L.振药混勾,56 ℃C温育 30 min，置沸水浴孵育8min；加等体积三氧甲烷，振落混匀，12000r/rmin，离心10min，取上清可重复三氯甲烷处理步骤一次：加等体积异丙醇（一20℃预冷），振满混勾+4C，13000/min离心10min，弃上清；加等体积70%乙醇，摄荡混句，4℃，13000/min离心10min小心吸弃上清，吸头不要碰到有沉淀一面，倒置于吸水纸上，尽量沾干藏体（不同样品需在吸水纸不同地方沾干），在洁净工作台室温于燥5ri+加入 50 μL 无 DNA 酶,尤 RNA酶水,轻轻混勺,溶解管壁上的核酸,宽温放置 10 min,直接用于检测,或贮一20 ℃备用。长期贮存,应暨一80 ℃或更低温度。6. 2. 2Chelex 100提取法
采纳世界动物卫生组织（OIE）陆生动物诊断试验和疫苗标准手册208版）操作程序，适用于精液样品。
在微量离心管中，加人10%chclex100溶液100μL，蛋白酶K(10mg/mL)11.5μL，1mol/LDTT7.5L.90μL无DNA酶、无RNA酶水，10pL精液样品，充分混勺：置56温育30min，充分摄荐混勺19置沸水浴孵育8min，充分振荡混约10s：用12000r/min离心3min，取上清直接川于检测：或贮一20℃备用。长期贮存，应置一80℃或更低温度：6.2.3试剂盒抽提法
可采用经验证等效的商品化核酸抽提试剂盒方法。7实时荧光 PCR 检测
7.1对照设立
7.1.1样品设叠要求：从样品处理开始，应设置阳性对照、阴性对照。7.1.2阳性对照：取已知阳性的同类样品作为阳性对照。也可将适量BoHV-1病毒或含阳性模板的TTTKAONTKACA
GB/T 27981—2011
质粒DNA添加到已知阴性样品中作为性对照样品。7.1.3阴性对照：取已知阴性的同类样品作为阴性对照。7.1.4空白对照，在扩增反应阶段设置。以无DVA酶、无RNA酶水作为模板设置空白对照，7. 2实时荧光 PCR 检测
7.2. 1 加样
反应体系采用 25 μL 反应体积,其中,含 2 ×定量 PCR-UIG 预混液 12. 5 μL,上、下游引物各200 nmol/L,探针100 nmol/L,模板 5 μL(100 pg~1 μg),补加适量无DNA酶、无 RNA酶水使反应总体积达25产L。加完样后，盖紧管盖，混勾，低速瞬时离心，使反应液集中管底。7.2.2扩增反应
反参数设置：
50C2min;
95 c 2 mil
—95℃15s，60℃45s，45个循环，荧光收集设置在每次循环的退火延伸时进行。荧光素或检测通道设置：果旧FAM通道或将报告荧光(rcportdyc)设定为FAM,采用其他报告荧光应按仪器说明对应设定通道：率灭荧光（quenchdye)设定为Nane，校推荧光（referencedye）设定为None。可根据不间品牌仪器说明等效设置参数。7.2.3结果判定
7.2.3.1结果分析亲件设定
综合分析仪器给出的各项结果，基线（baseline）以仪器给出的默认值作为参考·阔值（thrcshold）设定原则以阅值线刚好超过正带阴性对照样品扩增曲线的最高点为准，具体还需报据仪器噪声情况进行调，选择反成所设定的荧光基团对的通道进行分析。7. 2, 3. 2质控
阴性对照和空白对照应无 Ct值,阳性对照的 Ct 值应≤30 且出现典型的扩增曲线。如对照不满足以上案件，此次实验视为无效。7. 2. 3. 3荧光 PCR 反应结果判定在魔控有效的条件下进行结果判定。阴性反应结果判定，检测钻果呈现无Ct值的反应判为明性反应。阳性反应结果判定,检测结果呈现Ct 值≤35且扩增曲线有明显的对数增长期，判为阳性反应。对于35Ct值45的样品，应进行重复试验。如果重复试验的Ct值4，且曲线有明显的对数增长期,判为阳性反应。否则判为阴性反应。悠要时，对韧次检刻是阳性成应的样品进行惠复检测。8注意事项
检测过程防止交叉污染应注意的事项见附录B。TTTKAONTKACA
A, 10. 01 mol/L pH7.2 PBS
附录A
(规范性附录）
溶滤的配制
GB/T 27981—20.11
A液(0.2mol/L磷酸一氢钠溶液):称取磷酸二氢钠(NaHPO,H.0)27.6g,落于蒸馅永中,定容至1I
B被(0.2mol/L磷酸氛一钠溶液）称取磷酸氢二钠（NaHPO，·7H,O)53.6g（或NazHPO.12Hz0,71.6名t或NazHPO4-2Hz0,35.6g)加蒸馏水溶解，定容至1L。0. 2 mol/L A液
0. 2 mol/L B 液
無化钠
将上述体积 A 液与 B 液混合,溶解氟化钠,并用然馏水定容至 1 L,即为 0. 01 mol/L pH7. 2 PBS缓冲液。
A.2柠檬酸钠缓冲液
柠檬酸(C.H.O,·H,O)
柠檬酸钠(NaC.HO,-H.O)
葡萄糖(CH.OHO)
称取上述试剂,溶解于蒸馏水,定容至1 L,混勺勾：采用<121土2)/0.1MPa高压灭菌15 min后贮存于 4℃。
A. 30. 5 mol/L EDTA(pH 8. 0)称取 I86.1 名 EDTA,加人 800 mL蒸馏水中,磁力搅拌器上刷烈搅拌,用氢氧化钠(Na0H)调 pH至 8. 0,定容至 1 L,分装后采用(121士2)℃/0. 1 MPa高压灭菌 15 min,贮室温。A, 4 10% cheler 100
称取敢10gchelex100树脂-加人适量灭菌双蒸水中，定容至100mL。吸取时边搅拌边用灭菌吸头移取。
A, 51 moI/L DTT
称取3.09gDTT加20mL0.01mol/L乙酸钠溶解，过滤除菌，分装成小份后，-20℃保存。
A6蛋白酶K溶液（10mg/mL）
称取100mg蛋白酶K加9.5mL水中，轻轻摇动：直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到 10 tmL。
TTTKONYKAA
GB/T 27981—2011
附录B
（规范性附录）
检测过程防止交叉污架的措施
B.1来样及样品处理过程，应防止不同样品之间通过器其，手套等的交叉污染。来样及样品处理工其应经过高压灭菌或高温烘烤处理，…套工具仅限，-个拌品使用。存放样品的容应清洗，高压灭菌或高温烘烤处理或使用一次性灭菌容器。B.2实验过程，应穿工作服和载一次性手套，勤换手套，工作服应经常清洗。B.3使用带滤芯吸嘴。吸嘴，离心管，PCR管等应经过高压灭菌处理，一次性使用，不得回收清洗后重复使用。
B.4样品处理与PCR加样应在不同的区域进行，不同区域配备独立的加样工具和用具。该区域可以是独文的空间间隔、有紫外消毒设施的独立的设备如核酸提取工作站、PCR加样工作站、可瘤闭进行紫外消毒的超净工作台，生物安全柜等。若在散开的空间进行核殿提取或PCR圳样，该空间应安装紫外灯或配备具有等同降解核酸功能的设备如移动紫外灯，带外消毒功能的空气消毒净化器等。上述区域在每次使用后应及时清洁处理，并在使用前后照射紫外30 min以上。每个区域应有专门的废弃物容器，该容器应能耐受煮沸，10必饮氯酸钠猝液消毒处理。每次实验结束，应在紫外消毒前，及时清理度弃物及消毒容器，并将该废弃物容器放回工作区进行紫外消毒。B.5PCR反应液等试剂应按检测需求分装贮存，避免同：-管试剂多次开启使用。B.6装有核酸模板，样品或试剂的离心管在打开之前，应短暂离心，避免离心管用力前开，所有操作尽避免产生气溶胶。
B.7上机运行前，应检查并盖紫各PCR管，以防荧光物质或模板泄渐而污架机器。B.8应遵循基因检测实验室其他技术要求。TTTKAONYKACA
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。
中华人民共和国国家标准
GB/T 27981--2011
牛传染性鼻气管炎病毒实时
荧光PCR检测方法
Real-tine PCR method for the detection ofinfectious bovine rhinotracheitis virus2011-12-30发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2012-06-01实施
本标准按照GB/T1.I--2009给出的规则起草。GB/T27981—2011
本标推参考了01E发布的陆生动物诊断试验和疫苗手册\（2008版）关下牛传染性鼻气管我/牛传染性化脓性外阴阴道炎（Chapter 2.4,13)的内容。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准草单位；中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。
本标准主要起草人陈茹、刘中勇、林志雄、罗琼、曾碧健、许如苏，姜焱、吴晓。TTKONKAcA
1范围
牛传染性鼻气管炎病毒实时
荧光PCR检测方法
GH/T 27981—2011
本标准规定了牛传染性身气管炎病毒（牛疱疹病毒I型，BoHV-1.>实时荧光PCR检测方法的技术要求。
本标准适用于快速检测牛血样、拭子、精液、动物组织（粘膜、肝、脾、肾、淋巴结、胎盘组织等)和细胞培养物等样品中 BoHV-i 病毒感染。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注月期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单）适用于本文件，GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法世界动物卫生组织（OIE)陆生动物诊断试验和疫苗标推手册（2008版）关于检测牛冷陈精液中BoHV-1摘毒的实时荧光PCR方法3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BoHV-1:hovincherpesvirustype1,牛疱疹病毒I型。Ct 值:荧光信号鼠达到设定的阈值时所经历的循环数。DNA，deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸。DIT:DL-dithiothreitol,二硫苏糖醇。ETAethylenedianinetetraaceticacid,二腔胺gzBRbovine infeetious rhinotracheitis,牛传染性鼻气管炎。PBS:phosphatebuffer solution，磷酸盐缓冲生理盐水。PcR：polymerasechainIeaction，亲合链式反应。SDS:sodium dodecyl sulfate,十二烷基磺酸销。UDG 酶;utacil DNA glycosylase,尿嘧啶 DNA糖基化酶。4设备和器材
4. 1荧光 PCR仪。
4. 2 台式冷冻离心机。
4.3可调微量移液器：规格10L.100ml.200、1mL。4.4带滤芯微量吸头：规格10uL,100μ,200μL.1mL。4, 5PCR光学反虚管。
微量离心管。
涡旋混匀器。
恒温培养箱。
冰箱:规格 2 ~8 ℃,-20 ℃,-80 ℃。TTTKONYKAA
GB/T 27981-2011
4.10恒温水浴箱。
5试剂bzxZ.net
除另有规定，本方法试验水应按照GB/T6682中规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯5.1引物与探针
引物与探针配制采用无 DNA酶、无 RNA酶水将每条引物与操针配制成 100 μtmol/L 储存液,置一20℃或更低温度冻存；使用时取适量配制成10μmol/L工作液，避免多次冻融。号物与操针序列：
gB 基因上游引物 g-F,'TGT GGA CCT AAA CCT CAC GGT 3*gB基因 F游物 gB-R:5*GTA GTC GAG CAG ACC CGT GTC 3*gB 基固探针:5*[FAM]-AGG ACC GCG AGT TCT TGC CGC [BHQ-1 3探针5'端标记的报告荧光基团及3'端标记的淳灭基团可根据荧光PCR仪设备等具体情况另行选定。
5.2蛋白酶K溶液：配制方法见附录A。5.3柠樣酸钠缓冲液：配制方法见附录A。5.40.5mo1/LEDTA:配制方法见附录A。5.50.01mo1/LpH7.2PBS：配制方法见附录A。5.610%chelex100：配制方法见附录A。5. 7 1 mol/L DTT:配制方法见附录 A。5.8 2 ×定量 PCR-UDG 酶预混液:含 60 U/rnI 热启动 Taq 酶,40 mmol/L Tris-HCl (pH8. 4),100 mmol/L KCl,6 mmol/L MgCl2,400 μmol/L dGTP,400 μmol/L dAIP,400 rmol/L dCTF.80Omol/LdUTP.40U/mLUDG。可采用经验证间靠的商品化预混戒。5.9核酸抽提试剂盒。
5.10无DNA酶、无RNA酶水.
5.11无水乙醇。
5.1270%乙醇：用新开启的无水乙醇和无DNA酶、无RNA酶水配制，一20C预冷，5.13三氯甲烷.
异丙畴。
6样品采集与处理
6.1样晶采集及前处理
6、1. 1 采样工具
采样工具需经(121士2)℃/0.1MPa高压15ain并烘于，或经160℃千烤2h灭菌。6。1.2血清、全血
用无菌注射器或采血专用真空管针无菌自牛静脉采血，无菌分离血清，直接用于核酸提取。用无菌注射器或采血专用真空管针无菌自牛静脉来血，将血液直接滴人抗凝剂中，并立即连续摇动,充分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲,或 0.5 mo1/L EDTA。每 6 mL血液加 1 mL抗凝剂。直接用于核酸提取。
6,1.3拭子
用无菌棉拭子采集睾道、生殖器官和眼分泌物，采集时，将狱子反复刮擦呼吸道或生殖器官粘膜，2
TTTKAONTKACA
GB/T27981—2011
取分密物后,立即将棉拭子浸人 I mL~2 mL 灭菌 0. 01 mol/L pH7. 2 的 PBS 中,1 ℃储存,尽快送达实验室。取样进行检验时，充分振动挤+试于，接池预采用4000m1离心1m，取上猜备用。6. 1. 4精液
将冷冻精液样品或新鲜精液样品分装到.5mL微量离心管中，充分解冻后，振药混均采用12000T/min离心305.取上接6.2.1或6.2.3进行核酸提联：或取原获按6.2.2或6.2.3提取核酸。毒一批次冷冻情液取3支冻精管，分别进行核醛提取和后续检测。6.1.5组织样品
韵检时无菌采集动物呼吸道粘膜、扁桃腺、肺部和支气管淋巴结，对流产胎儿，采集刚死亡胎儿肝、肺、肾、脾和胎盘组织。检测时，用无菌剪、摄取适量样品，按1：5的比例加,人灭菌0.01Ⅱol/LPH7.2的PS(例:1g组织样品加5mL溶液）.在研钵中剪碎，充分研磨，取研磨物分装到离心书中，冻融2次~3 次,4 000 r/min离心 5 min,取上清备用。6. 1. 6细胞培养物
细脑培养物冻融2次~3次：分装到1. 5 mL微量离心管中,4000 r/min离心1 min,取上清备用。6.2样品核酸抽提
6.2.1有机溶剂抽提法
适用于上述各种样品。取200μL经前处理的样品或对照，加200mL0.01mol/LpH7.2PBS缓冲液,加 SDS,蛋白酶K 至终浓度分别为 1%和 0. 5 mg/rmL,混勾器 L.振药混勾,56 ℃C温育 30 min，置沸水浴孵育8min；加等体积三氧甲烷，振落混匀，12000r/rmin，离心10min，取上清可重复三氯甲烷处理步骤一次：加等体积异丙醇（一20℃预冷），振满混勾+4C，13000/min离心10min，弃上清；加等体积70%乙醇，摄荡混句，4℃，13000/min离心10min小心吸弃上清，吸头不要碰到有沉淀一面，倒置于吸水纸上，尽量沾干藏体（不同样品需在吸水纸不同地方沾干），在洁净工作台室温于燥5ri+加入 50 μL 无 DNA 酶,尤 RNA酶水,轻轻混勺,溶解管壁上的核酸,宽温放置 10 min,直接用于检测,或贮一20 ℃备用。长期贮存,应暨一80 ℃或更低温度。6. 2. 2Chelex 100提取法
采纳世界动物卫生组织（OIE）陆生动物诊断试验和疫苗标准手册208版）操作程序，适用于精液样品。
在微量离心管中，加人10%chclex100溶液100μL，蛋白酶K(10mg/mL)11.5μL，1mol/LDTT7.5L.90μL无DNA酶、无RNA酶水，10pL精液样品，充分混勺：置56温育30min，充分摄荐混勺19置沸水浴孵育8min，充分振荡混约10s：用12000r/min离心3min，取上清直接川于检测：或贮一20℃备用。长期贮存，应置一80℃或更低温度：6.2.3试剂盒抽提法
可采用经验证等效的商品化核酸抽提试剂盒方法。7实时荧光 PCR 检测
7.1对照设立
7.1.1样品设叠要求：从样品处理开始，应设置阳性对照、阴性对照。7.1.2阳性对照：取已知阳性的同类样品作为阳性对照。也可将适量BoHV-1病毒或含阳性模板的TTTKAONTKACA
GB/T 27981—2011
质粒DNA添加到已知阴性样品中作为性对照样品。7.1.3阴性对照：取已知阴性的同类样品作为阴性对照。7.1.4空白对照，在扩增反应阶段设置。以无DVA酶、无RNA酶水作为模板设置空白对照，7. 2实时荧光 PCR 检测
7.2. 1 加样
反应体系采用 25 μL 反应体积,其中,含 2 ×定量 PCR-UIG 预混液 12. 5 μL,上、下游引物各200 nmol/L,探针100 nmol/L,模板 5 μL(100 pg~1 μg),补加适量无DNA酶、无 RNA酶水使反应总体积达25产L。加完样后，盖紧管盖，混勾，低速瞬时离心，使反应液集中管底。7.2.2扩增反应
反参数设置：
50C2min;
95 c 2 mil
—95℃15s，60℃45s，45个循环，荧光收集设置在每次循环的退火延伸时进行。荧光素或检测通道设置：果旧FAM通道或将报告荧光(rcportdyc)设定为FAM,采用其他报告荧光应按仪器说明对应设定通道：率灭荧光（quenchdye)设定为Nane，校推荧光（referencedye）设定为None。可根据不间品牌仪器说明等效设置参数。7.2.3结果判定
7.2.3.1结果分析亲件设定
综合分析仪器给出的各项结果，基线（baseline）以仪器给出的默认值作为参考·阔值（thrcshold）设定原则以阅值线刚好超过正带阴性对照样品扩增曲线的最高点为准，具体还需报据仪器噪声情况进行调，选择反成所设定的荧光基团对的通道进行分析。7. 2, 3. 2质控
阴性对照和空白对照应无 Ct值,阳性对照的 Ct 值应≤30 且出现典型的扩增曲线。如对照不满足以上案件，此次实验视为无效。7. 2. 3. 3荧光 PCR 反应结果判定在魔控有效的条件下进行结果判定。阴性反应结果判定，检测钻果呈现无Ct值的反应判为明性反应。阳性反应结果判定,检测结果呈现Ct 值≤35且扩增曲线有明显的对数增长期，判为阳性反应。对于35Ct值45的样品，应进行重复试验。如果重复试验的Ct值4，且曲线有明显的对数增长期,判为阳性反应。否则判为阴性反应。悠要时，对韧次检刻是阳性成应的样品进行惠复检测。8注意事项
检测过程防止交叉污染应注意的事项见附录B。TTTKAONTKACA
A, 10. 01 mol/L pH7.2 PBS
附录A
(规范性附录）
溶滤的配制
GB/T 27981—20.11
A液(0.2mol/L磷酸一氢钠溶液):称取磷酸二氢钠(NaHPO,H.0)27.6g,落于蒸馅永中,定容至1I
B被(0.2mol/L磷酸氛一钠溶液）称取磷酸氢二钠（NaHPO，·7H,O)53.6g（或NazHPO.12Hz0,71.6名t或NazHPO4-2Hz0,35.6g)加蒸馏水溶解，定容至1L。0. 2 mol/L A液
0. 2 mol/L B 液
無化钠
将上述体积 A 液与 B 液混合,溶解氟化钠,并用然馏水定容至 1 L,即为 0. 01 mol/L pH7. 2 PBS缓冲液。
A.2柠檬酸钠缓冲液
柠檬酸(C.H.O,·H,O)
柠檬酸钠(NaC.HO,-H.O)
葡萄糖(CH.OHO)
称取上述试剂,溶解于蒸馏水,定容至1 L,混勺勾：采用<121土2)/0.1MPa高压灭菌15 min后贮存于 4℃。
A. 30. 5 mol/L EDTA(pH 8. 0)称取 I86.1 名 EDTA,加人 800 mL蒸馏水中,磁力搅拌器上刷烈搅拌,用氢氧化钠(Na0H)调 pH至 8. 0,定容至 1 L,分装后采用(121士2)℃/0. 1 MPa高压灭菌 15 min,贮室温。A, 4 10% cheler 100
称取敢10gchelex100树脂-加人适量灭菌双蒸水中，定容至100mL。吸取时边搅拌边用灭菌吸头移取。
A, 51 moI/L DTT
称取3.09gDTT加20mL0.01mol/L乙酸钠
A6蛋白酶K溶液（10mg/mL）
称取100mg蛋白酶K加9.5mL水中，轻轻摇动：直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到 10 tmL。
TTTKONYKAA
GB/T 27981—2011
附录B
（规范性附录）
检测过程防止交叉污架的措施
B.1来样及样品处理过程，应防止不同样品之间通过器其，手套等的交叉污染。来样及样品处理工其应经过高压灭菌或高温烘烤处理，…套工具仅限，-个拌品使用。存放样品的容应清洗，高压灭菌或高温烘烤处理或使用一次性灭菌容器。B.2实验过程，应穿工作服和载一次性手套，勤换手套，工作服应经常清洗。B.3使用带滤芯吸嘴。吸嘴，离心管，PCR管等应经过高压灭菌处理，一次性使用，不得回收清洗后重复使用。
B.4样品处理与PCR加样应在不同的区域进行，不同区域配备独立的加样工具和用具。该区域可以是独文的空间间隔、有紫外消毒设施的独立的设备如核酸提取工作站、PCR加样工作站、可瘤闭进行紫外消毒的超净工作台，生物安全柜等。若在散开的空间进行核殿提取或PCR圳样，该空间应安装紫外灯或配备具有等同降解核酸功能的设备如移动紫外灯，带外消毒功能的空气消毒净化器等。上述区域在每次使用后应及时清洁处理，并在使用前后照射紫外30 min以上。每个区域应有专门的废弃物容器，该容器应能耐受煮沸，10必饮氯酸钠猝液消毒处理。每次实验结束，应在紫外消毒前，及时清理度弃物及消毒容器，并将该废弃物容器放回工作区进行紫外消毒。B.5PCR反应液等试剂应按检测需求分装贮存，避免同：-管试剂多次开启使用。B.6装有核酸模板，样品或试剂的离心管在打开之前，应短暂离心，避免离心管用力前开，所有操作尽避免产生气溶胶。
B.7上机运行前，应检查并盖紫各PCR管，以防荧光物质或模板泄渐而污架机器。B.8应遵循基因检测实验室其他技术要求。TTTKAONYKACA
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。