GB 5413.31-2013
基本信息
标准号： GB 5413.31-2013
中文名称：婴幼儿食品和乳品中脲酶的测定
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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标准简介
GB 5413.31-2013 婴幼儿食品和乳品中脲酶的测定
GB5413.31-2013
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标准内容
中华人民共和国国家标准
GB5413.20—2013
食品安全国家标准
婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定2013-11-29发布
中华人民共和国
国家卫生和计划生育委员会
2014-06-01实施
本标准代替GB/T5413.20—1997《婴幼儿配方食品和乳粉胆碱的测定》。本标准与GB/T5413.20—1997相比，主要变化如下：-修改了标准的名称；
修改了用于酶反应的显色剂成分；增加了第二法雷氏盐分光光度法。GB5413.20—2013
1范围
食品安全国家标准
婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定本标准规定了婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定方法本标准适用于婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定。第一法酶比色法
2原理
GB5413.20—2013
试样中的胆碱经酸水解后变成游离态的胆碱，再经酶氧化后与显色剂反应生成有色物质，其颜色的深浅在一定浓度范围内与胆碱含量成正比。3试剂和材料
注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。3.1试剂
3.1.1三羟甲基氨基甲烷[(CH2OH)3CNH2]。3.1.2苯酚(C6HsOH)。
3.1.3浓盐酸(HCI)。
3.1.4氢氧化钠(NaOH)。
3.1.5胆碱氧化酶：置于-20℃保存。3.1.6过氧化物酶：置于2℃~8℃保存。3.1.74-氨基安替比林(CuHi3N3O）。3.1.8磷脂酶D：置于-20℃保存。3.2试剂配制
3.2.1盐酸(1mol/L)：量取85mL浓盐酸加水稀释至1000mL。3.2.2盐酸(3mol/L)：量取125mL浓盐酸加水稀释至500mL。3.2.3Tris缓冲溶液（0.05mol/L）：pH=8.0±0.2。称取6.057g三羟甲基氨基甲烷溶入500mL蒸馏水中，用1mol/L盐酸调pH至8.0土0.2，用蒸馏水定容至1000mL。此溶液在4℃冰箱中可保存一个月。3.2.4用于酶反应的显色剂：取100~120活力单位的胆碱氧化酶、250~280活力单位的过氧化物酶、75个~100个活力单位的磷脂酶D、15mg4-氨基安替比林，50mg苯酚置于100mL的容量瓶中，用0.05mol/LTris缓冲溶液稀释至刻度。临用时配制。3.2.5氢氧化钠溶液(500g/L)：称取500g氢氧化钠，溶于水并稀释至1000mL。1
3.3标准品
胆碱酒石酸氢盐标准品（CoHi9NO）：纯度≥99%。3.4标准溶液配制
GB5413.20—2013
3.4.1胆碱氢氧化物标准贮备溶液（2.5mg/mL）：称取在102℃+2℃烘至恒重的胆碱酒石酸氢盐523mg置于100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。冷藏于4℃+2℃冰箱中，保存不超过1周。3.4.2胆碱氢氧化物标准工作溶液（250μg/mL）：吸取10.0mL标准贮备溶液于100mL容量瓶中，用水稀释至刻度。临用时配制。4
仪器和设备
4.1天平：感量为0.01g和0.1mg。4.2恒温水浴锅：温度可控制在70℃±2℃和37℃±2℃。4.3pH计：精度0.01。
4.4分光光度计。
5分析步骤
5.1试样制备
5.1.1固体试样
称取5g（精确到0.01g）混合均匀的试样，于100mL的锥形瓶中，加入30mL盐酸溶液（3.2.1）。5.1.2液体试样
称取20g（精确到0.01g）混合均匀的试样，于100mL的锥形瓶中，加入10mL盐酸溶液（3.2.2）。5.1.3水解
将装有试样的容器放在70℃水浴中，加塞混匀，水解3h（每隔30min振摇一次），冷却。用氢氧化钠溶液调pH为3.5～4.0，转入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。5.1.4过滤
过滤水解液（5.1.3）。滤液应是澄清的，否则，用0.45μum的滤膜再次过滤。滤液放在4℃的冰箱中可以保存3d。
5.2测定
5.2.1标准曲线的制作
分别吸取2mL、4mL、6mL、8mL胆碱氢氧化物标准工作溶液于10mL的容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。准备6支试管，一个试管用作试剂空白（A），另五支试管由1至5编号，分别用于标准溶液和标准溶液的四个稀释度。按表1加入试剂。2
稀释度1/（50μg/mL）
稀释度2/（100μg/mL）
稀释度3/（150μg/mL）
稀释度4/（200μg/mL）
标准溶液/（250μg/mL）
蒸馏水
发色剂
制作标准曲线时的试剂添加量
用密封保护膜盖住试管，混匀，把试管置于37℃水浴中保温反应15min。5.2.2试样的测定
将每个试样准备2支试管（B，C），按表2加入试剂。表2
待分析滤液
蒸馏水
发色剂
试管B
滤液空白
测定试样时的试剂添加量
用密封保护膜盖住试管，混匀。把试管置于37℃水浴中保温反应15min。5.2.3比色测定
GB5413.20—2013
单位为毫升
试管C
单位为毫升
将试样及标准系列溶液从水浴中取出，冷却至室温。在波长505nm处，用蒸馏水作空白，测定吸光值。以胆碱标准溶液的浓度为横坐标，以标准溶液的吸光值减去试剂空白的吸光值为纵坐标，制作标准曲线。
分析结果的表述
6.1净吸光值的计算
通常新鲜配制的试剂会产生轻微颜色，且由于水解作用滤液也不是无色的，为了除去这些于扰因素，应该从总吸光值中减去各自的空白值（管A和管B）。试样净吸光值计算如公式（1）所示：A=Aot -Ab - A.
式中：
-试样净吸光值：
总吸光值（管C)；
-试剂吸光值（管A)：
滤液吸光值（管B）。
Abi和Aex不应大于总吸光值的20%，对于标准曲线，Aex=0。(1)
6.2胆碱含量的计算
GB5413.20—2013
在标准曲线上查出净吸光值的位置，并记下相应的浓度c，以每100g试样中胆碱氢氧化物的毫克数表示胆碱的含量（X)，单位为（mg/100g），试样中的胆碱氢氧化物含量按公式（2）计算：X=cxV×100
mx1000
式中：
X试样中的胆碱氢氧化物含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；-自标准曲线上查得的胆碱氢氧化物的浓度，微克每毫升（μg/mL）；-水解液被稀释的体积（通常为50mL），单位为毫升（mL）；m
试样的质量，单位为克（g）：
1000换算系数。
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留整数位。7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的8%。8其他
方法检出限为1mg/100g，定量限为3mg/100g。第二法雷氏盐分光光度法
9原理
试样中的胆碱用氢氧化钡-甲醇-三氯甲烷混合溶液水解抽提，经弗罗里硅土层析净化，与雷纳克铵盐溶液形成粉红色的胆碱雷纳克铵盐，用丙酮溶解洗脱，于526nm测定吸收值。在一定浓度范围内，胆碱雷纳克铵盐颜色的深浅与其含量成正比。10试剂和材料
注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。10.1试剂
弗罗里硅土：100目～200目，650℃活化。10.1.1
10.1.2甲醇（CH:OH）。
三氯甲烷（CHCl3）。
10.1.4氢氧化钡[Ba（OH）2-8H2O]。冰乙酸（CH3COOH）。
乙酸甲酯（C3H6O2）。
丙酮(CH:COCH3)。
雷纳克铵盐(C4HioCrN?S4)。
10.2试剂配制
GB5413.20—2013
10.2.1饱和氢氧化钡-甲醇-三氯甲烷溶液：称取6g氢氧化钡溶于100mL甲醇中，放入超声波中溶解后，加入10mL三氯甲烷，混匀。10.2.2冰乙酸-甲醇溶液(1+10)：1体积冰乙酸与10体积甲醇混合。10.2.3雷纳克铵盐溶液：称取0.25g雷纳克铵盐，加入10mL水中，放入超声波中溶解后过滤，临用时配制。
10.3标准品
胆碱酒石酸氢盐(C9H19NO7)：纯度≥99%。10.4标准溶液配制
胆碱酒石酸氢盐标准溶液(1g/L)：准确称取在102℃土2℃烘至恒重的胆碱酒石酸氢盐0.1000g用蒸馏水定容至100mL容量瓶中。冷藏于4℃土2℃冰箱中，保存不超过一周。11
仪器和设备
11.1天平：感量为0.01g和0.1mg。11.2回流装置：250mL磨口锥形瓶及回流装置。11.3恒温水浴锅：温度可控制在79℃土2℃。11.4，层析柱：长约10cm、内径1cm的带50mL杯口的玻璃柱。11.5分光光度计。
分析步骤
试样制备Www.bzxZ.net
称取固体试样10g(精确到0.01g)，称取液体试样20g(精确到0.01g)于磨口锥形瓶中，加入50mL氢氧化锁-甲醇-三氯甲烷提取液。混合均匀后接入回流装置，于792℃的水浴锅内水解抽提4h。每隔1h震荡一次，以避免试样结块。水解抽提结束后，取出锥形瓶冷却至室温，过滤。滤渣用冰乙酸甲醇混合液洗涤3次4次，洗液一并收集于100mL容量瓶中。用甲醇定容至刻度，混匀。12.2标准曲线的绘制
12.2.1层析柱制备
用乳胶管连接层析柱与滴头，用少量脱脂棉堵住层析柱底部，倒入约5cm左右高的弗罗里硅土，用甲醇浸湿，备用。
12.2.2层析
分别吸取胆碱标准溶液0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL注入层析柱中，当溶液完全进入柱床后，依次用5mL和10mL甲醇，20mL乙酸甲酯洗涤层析柱。再加入5mL雷纳克铵盐溶液，用适量的冰乙酸洗去过量的雷纳克铵盐，直至层析柱上无雷纳克铵盐附着处呈现硅土原有的白色。用丙酮洗脱粉红色的胆碱雷纳克铵盐，收集于10mL的容量瓶中，用丙酮定容（如果洗脱液混浊需过0.45μm的滤膜）。在波长526nm处测定溶液的吸光值，以胆碱酒石酸氢盐含量为横坐标（mx），吸光值为纵坐标绘制标准曲线。12.3试样的测定
GB5413.20—2013
吸取10mL试样水解液（12.1）于层析柱中，其余操作按照12.2.2进行。自标准曲线上查得10mL试样水解液中胆碱酒石酸氢盐的含量。分析结果的表述
试样中的胆碱以胆碱氢氧化物计，以毫克每百克（mg/100g）表示，按公式（3）计算：X=
式中：
x100x0.474
X一试样中胆碱氢氧化物的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；试样的质量，单位为克（g)；
-层析时吸取试样水解液的体积，单位为毫升（mL）；mx
-从标准曲线上查得胆碱酒石酸氢盐的含量，单位为毫克（mg）：0.474胆碱酒石酸氢盐转化为胆碱氢氧化物的系数计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留整数位。14精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。15其他
方法检出限为2mg/100g，定量限为5mg/100g（3）
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GB5413.20—2013
食品安全国家标准
婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定2013-11-29发布
中华人民共和国
国家卫生和计划生育委员会
2014-06-01实施
本标准代替GB/T5413.20—1997《婴幼儿配方食品和乳粉胆碱的测定》。本标准与GB/T5413.20—1997相比，主要变化如下：-修改了标准的名称；
修改了用于酶反应的显色剂成分；增加了第二法雷氏盐分光光度法。GB5413.20—2013
1范围
食品安全国家标准
婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定本标准规定了婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定方法本标准适用于婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定。第一法酶比色法
2原理
GB5413.20—2013
试样中的胆碱经酸水解后变成游离态的胆碱，再经酶氧化后与显色剂反应生成有色物质，其颜色的深浅在一定浓度范围内与胆碱含量成正比。3试剂和材料
注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。3.1试剂
3.1.1三羟甲基氨基甲烷[(CH2OH)3CNH2]。3.1.2苯酚(C6HsOH)。
3.1.3浓盐酸(HCI)。
3.1.4氢氧化钠(NaOH)。
3.1.5胆碱氧化酶：置于-20℃保存。3.1.6过氧化物酶：置于2℃~8℃保存。3.1.74-氨基安替比林(CuHi3N3O）。3.1.8磷脂酶D：置于-20℃保存。3.2试剂配制
3.2.1盐酸(1mol/L)：量取85mL浓盐酸加水稀释至1000mL。3.2.2盐酸(3mol/L)：量取125mL浓盐酸加水稀释至500mL。3.2.3Tris缓冲溶液（0.05mol/L）：pH=8.0±0.2。称取6.057g三羟甲基氨基甲烷溶入500mL蒸馏水中，用1mol/L盐酸调pH至8.0土0.2，用蒸馏水定容至1000mL。此溶液在4℃冰箱中可保存一个月。3.2.4用于酶反应的显色剂：取100~120活力单位的胆碱氧化酶、250~280活力单位的过氧化物酶、75个~100个活力单位的磷脂酶D、15mg4-氨基安替比林，50mg苯酚置于100mL的容量瓶中，用0.05mol/LTris缓冲溶液稀释至刻度。临用时配制。3.2.5氢氧化钠溶液(500g/L)：称取500g氢氧化钠，溶于水并稀释至1000mL。1
3.3标准品
胆碱酒石酸氢盐标准品（CoHi9NO）：纯度≥99%。3.4标准溶液配制
GB5413.20—2013
3.4.1胆碱氢氧化物标准贮备溶液（2.5mg/mL）：称取在102℃+2℃烘至恒重的胆碱酒石酸氢盐523mg置于100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。冷藏于4℃+2℃冰箱中，保存不超过1周。3.4.2胆碱氢氧化物标准工作溶液（250μg/mL）：吸取10.0mL标准贮备溶液于100mL容量瓶中，用水稀释至刻度。临用时配制。4
仪器和设备
4.1天平：感量为0.01g和0.1mg。4.2恒温水浴锅：温度可控制在70℃±2℃和37℃±2℃。4.3pH计：精度0.01。
4.4分光光度计。
5分析步骤
5.1试样制备
5.1.1固体试样
称取5g（精确到0.01g）混合均匀的试样，于100mL的锥形瓶中，加入30mL盐酸溶液（3.2.1）。5.1.2液体试样
称取20g（精确到0.01g）混合均匀的试样，于100mL的锥形瓶中，加入10mL盐酸溶液（3.2.2）。5.1.3水解
将装有试样的容器放在70℃水浴中，加塞混匀，水解3h（每隔30min振摇一次），冷却。用氢氧化钠溶液调pH为3.5～4.0，转入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。5.1.4过滤
过滤水解液（5.1.3）。滤液应是澄清的，否则，用0.45μum的滤膜再次过滤。滤液放在4℃的冰箱中可以保存3d。
5.2测定
5.2.1标准曲线的制作
分别吸取2mL、4mL、6mL、8mL胆碱氢氧化物标准工作溶液于10mL的容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。准备6支试管，一个试管用作试剂空白（A），另五支试管由1至5编号，分别用于标准溶液和标准溶液的四个稀释度。按表1加入试剂。2
稀释度1/（50μg/mL）
稀释度2/（100μg/mL）
稀释度3/（150μg/mL）
稀释度4/（200μg/mL）
标准溶液/（250μg/mL）
蒸馏水
发色剂
制作标准曲线时的试剂添加量
用密封保护膜盖住试管，混匀，把试管置于37℃水浴中保温反应15min。5.2.2试样的测定
将每个试样准备2支试管（B，C），按表2加入试剂。表2
待分析滤液
蒸馏水
发色剂
试管B
滤液空白
测定试样时的试剂添加量
用密封保护膜盖住试管，混匀。把试管置于37℃水浴中保温反应15min。5.2.3比色测定
GB5413.20—2013
单位为毫升
试管C
单位为毫升
将试样及标准系列溶液从水浴中取出，冷却至室温。在波长505nm处，用蒸馏水作空白，测定吸光值。以胆碱标准溶液的浓度为横坐标，以标准溶液的吸光值减去试剂空白的吸光值为纵坐标，制作标准曲线。
分析结果的表述
6.1净吸光值的计算
通常新鲜配制的试剂会产生轻微颜色，且由于水解作用滤液也不是无色的，为了除去这些于扰因素，应该从总吸光值中减去各自的空白值（管A和管B）。试样净吸光值计算如公式（1）所示：A=Aot -Ab - A.
式中：
-试样净吸光值：
总吸光值（管C)；
-试剂吸光值（管A)：
滤液吸光值（管B）。
Abi和Aex不应大于总吸光值的20%，对于标准曲线，Aex=0。(1)
6.2胆碱含量的计算
GB5413.20—2013
在标准曲线上查出净吸光值的位置，并记下相应的浓度c，以每100g试样中胆碱氢氧化物的毫克数表示胆碱的含量（X)，单位为（mg/100g），试样中的胆碱氢氧化物含量按公式（2）计算：X=cxV×100
mx1000
式中：
X试样中的胆碱氢氧化物含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；-自标准曲线上查得的胆碱氢氧化物的浓度，微克每毫升（μg/mL）；-水解液被稀释的体积（通常为50mL），单位为毫升（mL）；m
试样的质量，单位为克（g）：
1000换算系数。
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留整数位。7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的8%。8其他
方法检出限为1mg/100g，定量限为3mg/100g。第二法雷氏盐分光光度法
9原理
试样中的胆碱用氢氧化钡-甲醇-三氯甲烷混合溶液水解抽提，经弗罗里硅土层析净化，与雷纳克铵盐溶液形成粉红色的胆碱雷纳克铵盐，用丙酮溶解洗脱，于526nm测定吸收值。在一定浓度范围内，胆碱雷纳克铵盐颜色的深浅与其含量成正比。10试剂和材料
注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。10.1试剂
弗罗里硅土：100目～200目，650℃活化。10.1.1
10.1.2甲醇（CH:OH）。
三氯甲烷（CHCl3）。
10.1.4氢氧化钡[Ba（OH）2-8H2O]。冰乙酸（CH3COOH）。
乙酸甲酯（C3H6O2）。
丙酮(CH:COCH3)。
雷纳克铵盐(C4HioCrN?S4)。
10.2试剂配制
GB5413.20—2013
10.2.1饱和氢氧化钡-甲醇-三氯甲烷溶液：称取6g氢氧化钡溶于100mL甲醇中，放入超声波中溶解后，加入10mL三氯甲烷，混匀。10.2.2冰乙酸-甲醇溶液(1+10)：1体积冰乙酸与10体积甲醇混合。10.2.3雷纳克铵盐溶液：称取0.25g雷纳克铵盐，加入10mL水中，放入超声波中溶解后过滤，临用时配制。
10.3标准品
胆碱酒石酸氢盐(C9H19NO7)：纯度≥99%。10.4标准溶液配制
胆碱酒石酸氢盐标准溶液(1g/L)：准确称取在102℃土2℃烘至恒重的胆碱酒石酸氢盐0.1000g用蒸馏水定容至100mL容量瓶中。冷藏于4℃土2℃冰箱中，保存不超过一周。11
仪器和设备
11.1天平：感量为0.01g和0.1mg。11.2回流装置：250mL磨口锥形瓶及回流装置。11.3恒温水浴锅：温度可控制在79℃土2℃。11.4，层析柱：长约10cm、内径1cm的带50mL杯口的玻璃柱。11.5分光光度计。
分析步骤
试样制备Www.bzxZ.net
称取固体试样10g(精确到0.01g)，称取液体试样20g(精确到0.01g)于磨口锥形瓶中，加入50mL氢氧化锁-甲醇-三氯甲烷提取液。混合均匀后接入回流装置，于792℃的水浴锅内水解抽提4h。每隔1h震荡一次，以避免试样结块。水解抽提结束后，取出锥形瓶冷却至室温，过滤。滤渣用冰乙酸甲醇混合液洗涤3次4次，洗液一并收集于100mL容量瓶中。用甲醇定容至刻度，混匀。12.2标准曲线的绘制
12.2.1层析柱制备
用乳胶管连接层析柱与滴头，用少量脱脂棉堵住层析柱底部，倒入约5cm左右高的弗罗里硅土，用甲醇浸湿，备用。
12.2.2层析
分别吸取胆碱标准溶液0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL注入层析柱中，当溶液完全进入柱床后，依次用5mL和10mL甲醇，20mL乙酸甲酯洗涤层析柱。再加入5mL雷纳克铵盐溶液，用适量的冰乙酸洗去过量的雷纳克铵盐，直至层析柱上无雷纳克铵盐附着处呈现硅土原有的白色。用丙酮洗脱粉红色的胆碱雷纳克铵盐，收集于10mL的容量瓶中，用丙酮定容（如果洗脱液混浊需过0.45μm的滤膜）。在波长526nm处测定溶液的吸光值，以胆碱酒石酸氢盐含量为横坐标（mx），吸光值为纵坐标绘制标准曲线。12.3试样的测定
GB5413.20—2013
吸取10mL试样水解液（12.1）于层析柱中，其余操作按照12.2.2进行。自标准曲线上查得10mL试样水解液中胆碱酒石酸氢盐的含量。分析结果的表述
试样中的胆碱以胆碱氢氧化物计，以毫克每百克（mg/100g）表示，按公式（3）计算：X=
式中：
x100x0.474
X一试样中胆碱氢氧化物的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；试样的质量，单位为克（g)；
-层析时吸取试样水解液的体积，单位为毫升（mL）；mx
-从标准曲线上查得胆碱酒石酸氢盐的含量，单位为毫克（mg）：0.474胆碱酒石酸氢盐转化为胆碱氢氧化物的系数计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留整数位。14精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。15其他
方法检出限为2mg/100g，定量限为5mg/100g（3）
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