GBZ/T 249-2014 荧光原位杂交分析染色体易位估算辐射生物剂量技术方法 GBZ/T249-2014 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

1CS13,100
中华人民共和国国家职业卫生标准GBZ/T249—2014
荧光原位杂交分析染色体易位估算辐射生物剂量技术方法
Method of dose estimation using chromosome translocation withfluorescence in situ hybridization2014-05-14发布
中华人民共和国
国家卫生和计划生育委员会
2014-10-01实施
根据《中华人民共和国职业病防治法》制定木标准。本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。GBZ/T249—2014
本标准起草单位：中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所、军事医学科学院放射与医学研究所和河南省职业病防治研究院。本标雅起草人：刘肯杰、陆当、赵驿、陈英、吕玉民。1范围
荧光原位杂交分析染色体易位估算辐射生物剂量技术方法
GBZ/T249—2014
本标准规定广用荧光原位杂交分析外周血淋巴纽胞染色体易位，对电离辐射外照射受照人员的生物剂量进行估算的技术方法。
本标准适用于单色荧光素直接标记探针的染色体涂架方法。适用于发生在10年内、剂量在.2Cy5Gy范国内、急性全身均匀或近似均匀照射的事故变照人员回顾性剂量估算，也可用于受过量外照射人员的生物剂量估算。本标准不适用于慢性职业受照人员，非均匀照射、内照射、剂量大于5Gy或发生时间大丁10年的急性照射的剂量征算。
2规范性引用文件
下列义件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T28236染色体畸变估算生物剂量方法WS/T204用稳定性染色体畸变估算职业受照者剂量的方法3术语和定义
GB/T28236和WS/T204界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1
荧光原位杂交
fluorescencein situ hybridization,FISH非放射性原位杂交的一种。将变性后的标记核旨酸探针（包括直接与荧光素结合的直接标记探针；用生物素、地高辛等标记的间接标记探针）与变性后的染色体，细胞中的核酸按照碱基互补配对原则行杂交.经洗脱后直接分析或通过免疫荧光系统检测，最后在荧光显微镜下观察。3.2
染色体易位chromosometranslocaion两条染色体断裂后，相万交换染色体的远侧部分·形成两条其有着丝粒的衍生染色体的染色体畸变。有时交换是不完全的，还可以产生一对尤着丝点断片。3.3
染色体涂染chromosomepainting用染色体特异性DNA文库作为探针池（全染色体探针），可涂染整条染色体的荧光原位杂交方法。3.4
剂量-效应曲线doseeffectcurve某种生物体系受到照射后的反应与受照射剂量之间存在着某种定量关系，可用适当的数学模式表述-制备出相应的刻度曲线，可用其低算受照射剂量。1
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4荧光原位杂交标本制备
4.1仪器和设备
涉及的主要仪器和试剂配制详见附录A。4.2染色体标本制备
4.2.1样品接种和细胞培养
用0.5mL肝素抗凝全血加人到4.0mL含有20%胎牛血清的RPMI1640全培养基中，每个样品设2个平行样，培养48h~54h。
4.2.2收获细胞
用吸管吹打培养物，转人15mL刻度离心管，水平离心机250g离心10min，弃去上清，约留1mL剩余沉淀物。
4.2.3低渗
每离心答中加入37C预温的0.075m101/LKCl至8mL10mL，用吸管吹打均匀，置37℃水浴中30min
4.2.4预固定
每离心管中加人2mI.新配制的固定液[中醇！冰乙酸=3，1（体积分数)，用吸管轻轻吹吸混勾，250g离心10min.弃去上清
4.2.5固定
每离心管中加人6mL固定液，轻轻吹吸混匀，室温周定20min，250g离心10min，弃去上清。4.2.6第二次固定
加人6mL固定液，轻轻吹吸混匀.固定15min，250g离心10min，弃去1清。4.2.7细胞液的制备
适于制片的细胞悬液在混勾后应是均匀乳白色的，细胞悬液的颜色较深时可再重复4.2.6步骤1～2次。弃去部分上清，留适量上清并混勾。4.2.8制片
制片时将1～2滴细胞悬液滴在经无水乙醇处理、无尘纸擦洗干净的玻片上，湿热条件下使细胞和染色体均匀散开，室温空气自然于燥，4.2.9染色体标本质量的检定
在相差显微镜下，中期染色体应是中等灰色，轮廊清楚、分敏良好、很少或没有肉眼可见的细胞质。可通过调节制片的温度凝度水平、细胞慧液的浓度、以得到最理想的中期分裂相。2
4.3染色体标本预处理
4.3.1RNA酶处理
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用平衡磷酸盐缓冲溶液（PBS）在室温下洗5min在每个冰乙醇浓度巾脱水5min：室温空气白然十燥。取100LRNA工作液加到标本上.盖：24nm×50mm的盖玻片，37℃湿盒中放置1h。用2×SSC（标准柠檬酸盐-氯化钠液）室温条件下洗3次，每次5min：冰乙醇系列脱水，60C电热板上放置30min
4.3.2蛋白酶处理
染色体标本用RNA酶预处理后，杂交检测后仍有非常多的背景荧光信号.同一批标本就需要蛋白酶处理。将100μL37℃预温的0.005%的胰蛋白酶工作液加到标本上8mir1～10nin。用PBS在室湿下洗5rnin.然后用50mmol/L氯化镁济液室条件下洗5tnin，再用1%多聚甲整空温下固定13min。室温条件下在2×SSC中漂洗2次，衔次5min，然后在冰乙醇系列至混下脱水，每个浓度2minsmin:室温空气白然下燥。
4.4染色体标本变性
染色体标本在73C的标本变性液中变性2mi1~51in，冰乙醇系列（70%，90%和100%乙）脱水，空温空气自然干燥。在42℃电热板上预热5minu4.5探针变性
使用混合好的、同一炎光索直接标记某条或某几条染色体的染色体涂染探针。探针在42℃预温，并充分摇匀，并使液体沉于管底，探针么：73℃水浴中放置5min进行变性，37℃水浴中放置46min~60min进行预复性，
4.6预杂交
此步骤可在探针变性完成前30min开始进行，在染色体标本[:加100uL70%甲酰胺-2×SSC-50mtlol/LPBS，盖七24mm×50mm的盖玻片，在80℃的电热板上放置3min。迅速去除盖玻片后在冰冷的70%7.醇中处现5min.随后在90%和100%乙醇中空温处理各2min~5min室温空气白然十燥。
4.7杂交
将20μL探针加到已预杂交的标木上，盖1盖玻片，封片。标本在37℃湿盒中避光过夜，可以延长到2d.
4.8杂交后洗脱和复染
杂交后的标本取掉益玻片后，而42C的50%甲酰胺-2×SSC.0.1×SSC各洗3次，0.05%叶温20-4×SSC洗I次，每次5nin室温空气自然干燥。将用抗济灭剂溶解的复染液直接加到标本上，盖上盖玻片以备分析。
4.9复染后标本的保存
复染后标本个分析前应避光保存。如果开始分析时问逆复染完成超过1h.应在一2）℃条件下避光保存。在该条件下保存的标本荧光信号至少可保持1年。3
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5染色体易位畸变的荧光分析和记录5.1荧光显微阅片
在荧光显微镜的低倍镜下，先用复染荧光对应的滤光片调好焦距，寻找合适中期分裂相；然后在油镜（100倍）下确定中期分裂相是否在视野正中问，判断中期分裂树是否适合分析。适合分析的中期分裂剂须符合：染色休数目为46士1，分散良好，无细胞质，染色体浓缩，一个分裂相中标记的染色体最多有两个交义。
找到适合分析的中期分裂相后，史换至染色体标记荧光所对应的滤光片，计数被标记的染色体数目和判断是否存在染色休易位。
5.2染色体易位畸变判定标准
止常中期分裂相中荧光标记的染色体数门与预期标记的染色体数目一·致，染色体均为单一荧光染色.结构都是完整的；如果炭光标记的染色体中某一条染色体显示2种荧光染色，而直仅现另外一条染色体为2种荧光染色，且每条染色体H有1个养丝粒，计为1个染色体易位，如果某一条染色休显示2种炭光染色H出现1个光着丝粒断片该断片尤标记荧光染色或部分标记荧光染色，也计为1个染色休易位（见附录13)。
5.3数字图像显微摄影
检测到染色体易位畸变时·需要对中期分裂相进行拍照，荧光显微镜配有数码相机的，可用数码相机拍下该巾期分裂相的图像并在记录表（附录C)记录下文件名和中期分裂相图像特征，荧光显微镜连接有冷电荷耦合元件镜头的数宁化染色体图像分析系统，按照软件于则进行图像捕获、合成和保存，记录下义件名和中期分裂相图像特征。5.4结果数据的记录、处理和保存5.4.1分析结果的记录
将选择分析的每一个中期分裂析记录在荧光原位杂交分析染色体易位畸变分析记录表（附录C)中。
5.4.2全基因组易位率的换算
将检测到的染色体易位率，通过公式（1)计算全基因组易位率：F
Fr=2.05/(1-)
我中：
F：检测到的染色体易位率：
F.—全基因组易位率；
f—荧光标记的染色体 DVA占整个基因组DNA的份额（见附录D)。6剂量-效应曲线的建立
6.1供血者要求
2～3名成年健康人、非放射工作者、男女均可。年龄在18～60岁，半年内尤急慢性疾病、无射线和化学毒物接触史，近一个月内无病毒感染史6.2照射条件
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应提供可靠的、明确的被照射样品的物理剂量：样品受照射均勾：剂量范围在O.IGy～~5Gy：照射剂量率一般选择0.3Gy/min1Gy/min，照射剂量点在6~8个，1Gy以下至少选3个点，在37℃土0.5亡温度条件下进行照射，照射后在上述温度下修复2h，然后进行培养。6.3荧光原位杂交标本制备、分析及记录荧光原位杂交标本制备染色体易位畸变荧光分析和记录按照第1章一第5章中所述方法进行。6.4数据处理
两组间差异用泊松分布的U检验，多组问差只用检验：用全基内组易位率F：与照射剂量的关系进行曲线拟合，对拟合回归方程进行假设检验用方差分析。6.5剂量-效应曲线拟合
参照WS/T204中相关章节。对低传能线密度（I.ET）的电离辐射，电离辐射诱导的染色体易位指标与受照射剂量之问的剂量效应关系以拟合一次多项式为宜，按照公式(2)避行计算：Y=r-aD+ &D
式中：
本标准中指全基因组染色体易位率（畸变/细胞）：D—照射剂量，单位为戈瑞(Gy)：（一常数项，本标谁于指全基因组本底易位率（畸变/细胞）；剂量平方项系数；
剂量自线项系数。
对于高IET电离辐射，剂量效应关系宜采用直线模式，计算见公式（3）：Y-c+
式中：
Y一本标准中指全基因组染色体易位率（畸变/细胞）D
照射剂量，单位为戈瑞（Gy）；常数项，本标准中指全基因组本底易位率（畸变/细胞），剂量直线项系数。
7剂量估算
7.1FISH标本的制备、易位分析和数据处理+(2)
所要估算剂量的样品染色体标本制备、预处理、杂交、洗脱、易位畸变判定标准和数据的处理等均应与建立剂量-效应曲线相同。
7.2分析细胞数的确定
可先分析200个细胞，将得到的染色体易位率户、代人公式（4）计算出需要分析的细胞数n=(1-)×96. 04
式中：
需要分析的细胞数；bZxz.net
（4）
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易位崎变率。
96,04——根据95%可信区间计算获得的常数。根据所受照射剂量不同，一般每个标本需分析500～2000个中期分裂相。7.3检测染色体易位率和95%可信区间的计算检测染色体易位率的计算按照公式（5)计算：F.
F检测到的染色体易位率：
一检测到的染色体易位数；
一观察细胞数。
检测染色体易位率的95%可信区问按照式（6)计算：Fp上1.96S.
F一检测到的染色体易位率：
1.96——95%可信区问的u值；
武中：
一检测染色体易位率的标准误，按照式（7）计算：检测染色体易位率的标准误；
检测到的染色体易位数；
观察细胞数。
7.4剂量估算
.（5）
将所要估算剂量的标本中得到的全基因组易位率及95%可信区问的上下限代人建立的剂量效应曲线，就可以估算出受照剂量（见附录E）。8质坚控制
8.1进行荧光原位杂交的实验室应有2名以1专业技术人员，经严格训练，掌握电离辐射生物效应的基础知认，应具有细跑遗传学的非本知识，熟练掌握荧光原位杂交技术和识别易位染色体畸变。为减少分析判定结果的差异，应统一判定标准。8.2进行荧光原位杂交的实验室应通过国家计量认证或国家实验室认可。开展荧光原位杂交的实验室的条件和必备的仪器设备见附录E。8.3进行剂量估算的实验室应建立自已的剂量-效应曲线；有条件的实验室可不同辐射类型、不同剂量率（低1.FT辐射）的剂量效应曲线。8.4剂量估算只能在曲线剂量范围内应，不得外推；应考虑被分析人员的年龄、吸烟等因素对结果的影响。
8.5标本应统一编号、统一保存
8.6实验过程中应有染色体标本质量检测、杂交前变性标本质量检测记录，以确保在每一步关键步骤前的标本质量。
A.1主要仪器设备
附录A
（资料性附录）
主要仪器设备和试剂配制
37℃恒温箱：用于细胞培养和杂交。A.11
A.1.2普通离心机：水平式离心机，用于收获细胞A.1.3相差显微镜：用于观察染色体制片的效果。GBZ/T249—2014
A.1.4恒温水浴箱，至少2个，温度可调室温～80℃，用于低渗，探针和标本的变性、洗脱。A.1.5恒温电热板：温度可调，温度范围在室温~90)℃，用于载玻片标本的加热：A.1.6混旋振荡器：速度可调，用于样品的泥句。A.1.7小型离心机：用于.5mL~2ml.小试管中样品的离心。A.1.8冰箱：低温冰箱（一20℃，用于存配好的试剂和血清、复染后标本保存）和普通冰箱（用于贮存少量实验用试剂。
A.1.9荧光显微镜：用于荧光原位杂交标本的显微分析，至少配有2种滤光片，如DAPI、FITC或Cy3，或者用于观察P1和FITC荧光的滤光片：也可以用同时可观察2种荧光信号的滤光片。最好配有数码相机或冷（CI)的数字化染色体图像分析系统。A.1.10湿盒：用于杂交标本的保温，能避光.保持一定的湿度。A.2主要试剂的配制
A.2.1RPMI1640全培养基：JI.RPMI1640培养基中含有10.4各RPMI1640粉末、1.3g无水碳酸氧钠，pH在7.0~7.2之间。RPMI1649全培养基中含20%胎牛血清、莓素100IC/mI.、链需素1c0mg/mL、物血球凝集素200μg/mL、秋水仙素0.02μg/mL4.2.2冰乙醇系列：浓度分别为70%.90%、100%乙醇，提前配制好，保存在一20℃冰箱巾，用时置十冰
A.2.3RNA酶工作液水415μl、20XSSC50μL、10μg/μL的RNA酶5μLA.2.40.005%的胰蛋自酶工作液：10胰蛋白嗨50L.99ml.水和11Iol/L盘酸1mL，事先配制在一25条件下保存
A.2.550mmol/LMgCl：1mol/.MgClz5ml.和PBS95ml，用时现配。A.2.6染色体标本变性液：70%甲酰胺-2×SSC.用甲酰胺35mL、蒸留水10mL、20×SSC5tmL.混勾，4℃保存，每2周~4周新鲜配制一次.A.2.770%甲酰胺-2×SSC标准柠檬酸盐-氯化钠液）-50mmol/LPBS（预杂交液）：用100%去离子甲饿胺350ul、0.5mo1/LPBS50l.和20×SSC5uμL配制A.2.850%甲酰胺-2×ssC:100ml100%甲酰胺、20mL20×SSC:80ml..80mL蒸馅水。A.2.90.1×SSC.1mL20×SSC加139mL蒸馅水。A.2.100.05%吐温20-4×SSC:20×SSC200mL、蒸馏水800mL、0.5l吐温20A.2.11抗痒灭剂溶液：100mgp-二氛氯化苯二胺溶于10mlPBS，调节pH至8.0,并加9Cml甘油，用0.22μm滤器过滤去除未溶解颗粒储存于一20℃。GBZ/T 249—2014
A.2.120.15μg/mLDAPl:1.5μgIDAP[粉木游解于10mL抗率灭剂溶被A.2.1320×SSC（标准柠檬酸盐-点化钠液）：175.3g氯化钠，88.2g柠檬酸钠，辫于800ml.蒸馏水巾，加10mol/LNaOH调pH至7.0.加水定容至1L，高压灭菌备。附录B
（资料性附录）
染色体涂染检测易位畸变示例
染色体涂染检测易位畸变示例见图B.a）正常细胞
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b）4号染色体易位畸变细胞
图B.1用1、2和4号染色体涂染探针的杂交结果注1：典型的正常和易位杂交结果：需要分析的染色体为Cy3标记，荧光显微镜下用Cy3滤光片观察信号为红色：复染用T>API.荧光显微镜下用DAPI滤光片观察所有染色体为蕊色注2：涂染探针和复染的组合可以改变，常用的除Cy3和DAPI组合外，还有待分析染色体的用FITC标记，信号为绿色，复势可用DAFI(蓝色）或PI(红色）。GBZ/T249—2014
附录C
（资料性附录）
荧光原位杂交分析染色体易位畸变分析记录表和报告单C,1荧光原位杂交分析染色体易位嗮变分析记录表见表c.1。
荧光原位杂交分析染色体易位畸变分析记录表表C.1
受检者编号：
受检者姓名：
分析细胞数量：
载玻片编凸：
检测单位：
分析人：
分析几期：
检测到染色体易位数
显微镜编号：
荧光原位杂交分析染色体易位畸变分析记录表复核人：
复核日期：
第贞共页
注：适用于记录每个细胞中的染色体易位；N装示未见染色体易位畸变的中期细胞，代表1个染色体易位：记录每个分析细胞的显微镜坐标（如10.0/110.2，)或图片保存文件名（如liuhong101，21）：如果在一个视野中有多个中期分裂相，还应画出在低宿镜下的镜像，以便复核。10
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