WS/T 411-2013
基本信息
标准号： WS/T 411-2013
中文名称：抗丝状真菌药物敏感性试验 肉汤稀释法
标准类别：卫生行业标准(WS)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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标准简介
WS/T 411-2013 抗丝状真菌药物敏感性试验 肉汤稀释法
WS/T411-2013
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标准内容
ICS11.020
中华人民共和国卫生行业标准
WS/T411-—2013
抗丝状真菌药物敏感性试验
肉汤稀释法
Antifungal susceptibility testing of filamentous fungiBroth dilution ethod2013-06-03发布
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会2013-12-01实施
WS/T 411—2013
1范围
术语和定义
抗真菌药物
培养基
微量肉汤稀释法操作步骤
6宏量肉汤稀释法操作步骤
7质量控制
附录A（规范性附录）RPMI-1640肉汤培养基配方表附录B（规范性附录）燕麦培养基制备步骤参考文献
本标推依据GB/T1.1一2009给出的规则起草。WS/T411—2013
本标准起草单位：卫生部临床检验中心、北京大学人民医院、北京大学第一医院、中国医学科学院北京协和医院、首都医科大学附属北京友谊医院、卫生部北京医院，华中科技大学同济医学院附属同济医院。
本标准主要起草人：胡继红、张補、王辉、李若瑜、徐英春、苏建荣、胡云建、孙自铺。1范围
抗丝状真菌药物敏感性试验
肉汤稀释法
WS/T 411—2013
本标准规定了微量肉汤稀释法和宏量肉汤稀释法检测抗丝状真菌药物最小抑菌浓度MinimalInhibitoryConcentration(MiC)的参考方法，本标推适用于引起深部真菌感染的产孢丝状真菌的药物敏感性试验，包括山霉属Aspergillusspecies、镰刀菌属Fusariumspecies、根需属Rhizopusarrhizus，波氏假性阿利什霉Pseudallescheriaboydii、尖端赛多孢子菌Scedosporiumapiospermum，中克孢子丝菌Sporothritschenckii和其他引起感染的丝状真菌，以及引起皮肤真菌感染的毛癣菌Trichophyton，小孢子菌Microsparum，表皮癣菌Epidermophyton.spp。
2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
抗真菌药物antifungalagents
一种可用于人体内对真菌具有抑制生长或杀灭作用的生物物质，半合成或合成物质，不包括消毒剂,灭菌剂和防腐剂。
最小抑菌浓度minimalinhibitoryconcentration;MIc在脂或肉汤稀释法中，抗菌药物能抑制微生物生长的最低浓度。2.3
折点brcakpoint
临床上能将真菌分为敏感、中介和耐药的特定MIC值。折点系综合体外MIC值、PK/PD数据及临床疗效而得出，还可随环境改变面变化（如感染部位，常规药物剂量的改变、使用途径及次数的改变）。丝状真菌工作折点仅以研究为目的，临床折点尚未建立，2.4
敏感susceptihle;s
此浓度在体外检测中能抑制真菌生长，当使用推荐剂量时在临床治疗中有可能玻得成功。2.5
中介intermediate;I
菌株对常规用药时体液和组织中能达到的药物浓度反应率低于敏感株，和（或）不能被清楚地划分为“敏感”或“耐药”。在体外真菌可被抑制生长，此浓度临床治疗效果不肯定。如为药物聚集部位或高1
WS/T 411—2013
剂量使用，则临床治疗有效。该范图可作为一缓冲区，避免出于微小，不可控的技术因素导致结果解释的严重偏差。
耐药resistant,R
当使用推荐剂量时在临床治疗中很有可能失败。2.7
效价potency
抗菌药物中具有抗菌活性的部分，道过同类标准物质测定得出。单位表示为mg/g、IU/g，或用百分比表示，
质量控制
qualitycontrol:Qc
为保证检测的确性和可重复性面采取的方法或技术。3抗真菌药物
抗真菌药
抗真菌药物的标推品或参
考品可购自
贮存，推荐真空
当从震温
或在—20℃
3.2称量药物
可使用式
（1）式（2）计算药物重量
及稀释液体
式中：
药物的质量单位为毫克（mg）：下取
药物的浓度，单位为微克每毫升（ng/mL)；药物的效价单位为微克每毫克（μg/mg)；药物的体积，单位为靠弹(mL)。3.3配制药物贮存液（母液）
3.3.1药物称量
推品，布厂家推荐的条件
效期内的标准
温后市并瓶。
药物时，番恢复到索
....(1)
按照配制贮存液的浓度计算，贮存液浓度为检测时使用浓度的100倍。但有些溶解度低的药物应配制较低浓度的存液。称量应在分析天平上进行。天平应定期校准。3.3.2溶剂
-些药物需使用非水溶剂溶解，详见表1。踏剂的信息可参考厂家说明书。溶剂（分析级别）包括：三甲基亚碱(DMSO)、乙醇、聚乙二醇和羧甲基纤维素。2
抗真菌药物
两性霉素B
氛胞嘧啶
酮康唑
卡泊芬净
米卡芬净
价曲康唑
泊沙康唑
伏立康唑
表1配制抗真菌药物贮存液使用的溶剂、稀释液和检测范围裕剂bzxz.net
*DMSO=二甲基业砜。
培养基指RPMI-164C肉汤培养基，配制见表2.稀释液
培养基
增养基h
培养基\
培养基
增养基
培养基
培养基
培养基
培养基
表2RPMI-1640肉汤培养基1L制备步骤步骤
10.4gRPMI1640肉汤干粉，34.53gMOPS缓冲液，济解于900mL蒸馏水加人MOPS（终浓度为0.165mo/L)，搅拌至溶解使用1mal/L氢氧化钠调节pH至7.0（25℃）补水至1L
过滤消毒储存在4℃备用
“MOPS-3-(N-吗啡淼>丙酸3N-morpholinopropenesulfonicacid3.3.3过滤
WS/T411-—2013
检测范围
μg/mL
0.125-~64
0.125~-64
0.015 6~8
通常认为贮存液是无菌的。当有特殊要求时应进行膜过滤。但应避免使用纸张、石棉和玻璃滤器等具有吸附抗真菌药物的材质。若使用吸收材质，应在试验中记录损失量。3.3.4保存
贮存液应分装在无菌答中密封保存在一60℃环境中，不得高于一20℃。使用时应从冰箱中现用现取，未用完的应丢弃。保存条件参考厂家说明书，通常大多数药物的存液在一60℃可保存6个月。用质控菌株或参考菌株可监测药物的有效性。3.4药物稀释液
3.4.1水溶性药物稀释液
对于溶于水的抗真菌药物，直接用肉汤1：50稀释。当进行小样本量检测时推荐使用表3的稀释步骤。
WS/T411—2013
.2倍终浓度，
表3水溶性抗真菌药物敏感试验稀释步骤（小样本量）来源
储存液
步骤1
步骤3
步骤3
步骤6
非水溶性药
物稀释液
培养基
中间浓度
1：5稀释后浓度：
μg/ml
对于非水容性物带耍先用合适的溶剂配制成整浓度100倍的储存额，然后再用肉汤1：50稀释，
对皮肤来源真南标本的药物稀将步骤见表5。针对非皮肤来源真菌标本的药
物稀释步骤见表4，针
μg/mL
\DMSO-一甲基亚矾。
：2倍终浓度。
非水溶性抗真菌药物敏感试验稀释步骤（非皮肤真菌来源
建存液
贮存液
贮存液
贮存液
步骤4
步骤4
步骤4
步骤7
步骤7
溶剂DMSO
中闻装度
1:50稀释后浓度
jug/mL
μg/mL
非水溶性抗真菌药物敏感试验稀释步骤（皮肤真菌）来源
億存波
储存液
储存液
储存液
步骤4
步骤 4
步骤4
步骤7
步骤？
步骤？
步骤10
步骤10
步骤10
步骤13
步骤13
步骤13
步骤16
*DMSO=二甲基业。
2倍终浓度，
4培养基
微量肉汤稀释法培养基
溶剂DMSO
中间浓度
微量肉汤稀释法培养基推荐使用含2%葡萄糖的改良RPMI-1640肉汤，见表6。4.2
宏量肉汤稀释法培养基
WS/T411—2013
1·50稀释后浓度
μg/mL
宏量肉汤稀释法培养基推荐使用RPMI-1640肉汤，若无RPMI-1640肉汤干粉，RPMI-1640肉汤配方见附录A。
表6改良RPMI-1640肉汤培养基配方表（含2%葡萄糖）组分
蒸馏水
RPMI-1640干粉
葡萄糖
1倍浓度
2倍浓度
WS/T411—2013
5微量肉汤稀释法操作步骤
5.1丝状真菌培养及菌悬液的制备5.1.1非皮肤真菌
应在ⅡA或ⅡB生物安全柜中完成接种和菌悬液的配制等操作。大多数真菌可在马铃薯简萄糖培养基（PDA）上，经35℃培养7d后接种或直至获得生长良好的孢子，接合菌、曲霉属经48h培养后可获得孢于：镰刀菌属在35℃培养18h~72h后，再转入25℃～28℃培养至7d。
挑选曲需菌落。在1ml.0.85%无菌盐水中加人1滴（约0.01mL）吐温20后混匀，若有沉淀物应静置3min~5min。将上清液转移至无菌管巾，密封后混勾15s.采用比浊法测定菌感液浓度，曲霉属，淡紫拟青霉Paecilomyceslilacinus、宛氏拟青霉P.uariotti、皮炎外瓶等（Erophialadermatitidis）、申克孢子丝菌的吸光度（OD）值应在0.09～0.13；镰刀菌属、尖端赛多孢子菌、奔马赭霉菌Ochroconisgallopava、斑替枝孢瓶密Cladophialophorabantiana、根霉属及其他接合菌zygomycctousspecies的OD值应在0.15~0.17；双极菌属Bipolarisspp.和链格孢需属Alternariaspp.的OD值为0.25~0.3。然后用肉汤进行1：50稀释，其中中克孢了丝菌稀释度史低（为1：2稀释）。接种物稀释液浓度为终浓度（0.4×10*CFU/mL5×10*CFU/mL）的2倍。最后将0.1mL菌悬液加人微孔中。5.1.2皮肤真茵
大多数皮肤真菌在马铃薯葡萄糖培养基上生长良好。但红色毛癣菌带使用燕麦琼脂（见附录B），于35℃培养4d～5d或直至获得生长良好的抱子。用1mL0.85%盐水制备菌悬液，使用血细胞计数器计数，得到菌悬液浓度为2倍接种终浓度(1X103CFU/mL~3X10CFU/mL)
5.2接种物稀释液的定量
5.2.1非皮肤真菌
将0.01mL1：10稀释的菌悬液接种在沙氏培养基（SDA)上计数菌落形成单位（CFU/mI)。在28℃~30℃培养并每日观察计数。培养时间从不足24h（根霉）到5d(尖端赛多孢了菌）不等。5.2.2皮肤真菌
将0.01mL1：10稀释的菌悬液接种在沙氏培养基（SDA)上，计数菌落形成单位（CFU/mL）。在28~30C培养并每日观察计数。
5.3接种
检测当几，将0.1ml.2倍终浓度的接种物加人微孔中，并加人0.1mL2倍终浓度的药物稀释液。对照管中加入0.1mL接种物和0.1ml.2倍浓度的药物稀释溶剂。5.4培养
应在35℃培养，但培养时间不同：根霉屑为21h～26h，曲霉属、镰刀菌属和申克孢子丝菌为46h~50h，假性阿什利零为70h~74h。对于棘白菌素类抗真菌药物，曲霉属和宛氏拟青霉为21h~26h，假性阿什利等为46h~~72h。如6
果第一天对照孔生长良好，即在孔底部呈融合生长，亦可确定MEC值。5.5结果判读MIC和MEC值
5.5.1一般情况
WS/T411—2013
判读结果时通过与生长对照孔比较，观察生长抑制情况确定MIC值。对于棘白菌素类抗真菌药物，使用MEC.
5.5.2两性霉素B
两性霉素BAmphotericinB)生长终点定义明确，为100%抑制任何可见的生长，但拖尾现象不常见，拖尾现象可能反映与临床相关的耐药。5.5.3氟胞嘧啶、氟康唑、酮康唑氟胞嘧啶（Flucytosinc）和吡咯类，例如：氟康噬（Fluconazole）、醒康唑（Ketoconazole）不像两性霉素B牛长终点定义那样严格，与生长对照相孔比较，非皮肤真菌生长抑制50%以上、皮肤真菌生长抑制80%以上判断为终点。
5.5.4伊曲康唑、泊沙康唑，里氟康唑、伏立康唑对于伊曲康唑（Itraconazole)以及其他吡略类药物，例如：泊沙康唑（Pasaconazole），里氟康唑（Re-vuconazole）和伏立康哗（Voriconazole)终点定义为1oo%抑制生长。曲震及其他条件致病性丝状真菌生长终点拖尾现象很少见，拖尾现象可能反映临床相关耐药。当检测皮肤真菌对伊曲康唑、泊沙康噬、伏立康唑的MIC时，终点定义为抑制生长80%以上。5.5.5棘白菌素类
虽然对棘白菌素类药物（Echinacaudins），例如：安尼芬净（Anidulafungin）、卡泊芬净（Caspofurnigin）和米卡芬净（Micafungin）生长终点判定不如两性霉素B明确，但是应用MEC生长终点的概念，提高了试验的可重复性。5.5.6环吡酮
环吡酮（Ciclopirox)终点判定不像两性素B定义那样严格，为抑制生长80%以上：5.5.7灰黄霉素
灰黄霉素（Griseofulvin）终点判定不像两性霉素B定义那样严格，为抑制生长80%以上。5.5.8特比蔡芬
特比蔡芬（Terbinafine）终点判定不像两性霉素B定义那样严格，为抑制生长80%以上。5.6结果解释
5.6.1一般情况
丝状真菌的临床折点尚未建立，但对于伊曲康唑、泊沙康唑，伏立康唑、两性霉素B和卡泊芬净5种药物已建立了以研究为目的的鉴定耐药株的工作折点（workingbreakpoint）。研究显示曲霉属对5种药物、尖端赛多孢子菌和淡紫拟青霉对泊沙康唑和卡泊芬净、双极菌属和链格孢霉属对吡略类、接合菌对泊沙康唑和两性霉素B的MIC都低于1μg/mL。对于上述5种药物的工作折点：敏感为MIC或7
WS/T 411—2013
MEC<1μg/ml.，中介为MIC或MEC一2g/mL，耐药为MIC或MEC≥4μg/mL5.6.2两性霉素B
大多数丝状真菌的MIC在0.5μg/mL~2μg/mL之间：但土曲、局限枝顶孢霉、淡紫拟青霉、尖端赛多孢子菌、多育赛多孢的MIC可高于2μg/ml（分布范围为2μg/mL~16μg/mL）。尽管研究数据显示两性霉素B的MIC值和疗效无相关性但MIC高于2Jg/mL治疗失败可能性较人，而MIC低于2ug/mL可提示治疗成功。
5.6.3氟胞嘧啶
大多数丝状真菌对氟胞嘧啶均不敏感，MIC值均64ug/mL。但曲霉属和暗色真菌例外5.6.4氯康唑
大多数丝状真菌对氟康唑均不敏感，MIC值均>64μug/mL。但双相真菌和皮肤真菌例外。5.6.5酮康唑
大多数丝状真菌的MIC在0.03μg/mL~16ug/mL之间。但研究数据未显示MIC值和疗效的相关性。
5.6.6伊曲康唑、泊沙康唑，里氣康唑，伏立康唑应使用造当的溶剂溶解伊曲康唑。与葡康唑不同，对于非皮肤真菌伊山康唑MIC值8μg/ml与耐药相关，但研究数据未显示MIC值和疗效的相关性。而对于皮肤真菌，伊曲康唑、泊沙康唑、里氟康唑、伏立康唑的MIC值都较低，但氟康唑的MIC>16μg/mL5.6.7棘白菌素类
安尼芬净、卡泊芬净和米卡芬净对曲霉属的MECs车1μg/mL，MEC值和疗效的相关性尚未确定。
5.6.8环吡酮
环吡翻的MIC≤1ug/mL，但MIC值和疗效的相关性尚未确定。5.6.9灰黄霉素
灰黄霉素的MIC≤1μg/mL。但MIC值和疗效的相关性尚未确定5.6.10特比蔡芬
特比萘芬对人多数皮肤真菌的MIC≤0.25μg/mL，但已有报道红色毛癣菌的MIC≥0.5μg/mLMIC值和疗效的相关性尚未确定。6宏量肉汤稀释法操作步骤
6.1药物稀释液
按照3.3配制药物贮存液。然后用RPMI-1640肉汤将贮存液1：10稀释，得到10倍终浓度的稀释液。
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中华人民共和国卫生行业标准
WS/T411-—2013
抗丝状真菌药物敏感性试验
肉汤稀释法
Antifungal susceptibility testing of filamentous fungiBroth dilution ethod2013-06-03发布
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会2013-12-01实施
WS/T 411—2013
1范围
术语和定义
抗真菌药物
培养基
微量肉汤稀释法操作步骤
6宏量肉汤稀释法操作步骤
7质量控制
附录A（规范性附录）RPMI-1640肉汤培养基配方表附录B（规范性附录）燕麦培养基制备步骤参考文献
本标推依据GB/T1.1一2009给出的规则起草。WS/T411—2013
本标准起草单位：卫生部临床检验中心、北京大学人民医院、北京大学第一医院、中国医学科学院北京协和医院、首都医科大学附属北京友谊医院、卫生部北京医院，华中科技大学同济医学院附属同济医院。
本标准主要起草人：胡继红、张補、王辉、李若瑜、徐英春、苏建荣、胡云建、孙自铺。1范围
抗丝状真菌药物敏感性试验
肉汤稀释法
WS/T 411—2013
本标准规定了微量肉汤稀释法和宏量肉汤稀释法检测抗丝状真菌药物最小抑菌浓度MinimalInhibitoryConcentration(MiC)的参考方法，本标推适用于引起深部真菌感染的产孢丝状真菌的药物敏感性试验，包括山霉属Aspergillusspecies、镰刀菌属Fusariumspecies、根需属Rhizopusarrhizus，波氏假性阿利什霉Pseudallescheriaboydii、尖端赛多孢子菌Scedosporiumapiospermum，中克孢子丝菌Sporothritschenckii和其他引起感染的丝状真菌，以及引起皮肤真菌感染的毛癣菌Trichophyton，小孢子菌Microsparum，表皮癣菌Epidermophyton.spp。
2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
抗真菌药物antifungalagents
一种可用于人体内对真菌具有抑制生长或杀灭作用的生物物质，半合成或合成物质，不包括消毒剂,灭菌剂和防腐剂。
最小抑菌浓度minimalinhibitoryconcentration;MIc在脂或肉汤稀释法中，抗菌药物能抑制微生物生长的最低浓度。2.3
折点brcakpoint
临床上能将真菌分为敏感、中介和耐药的特定MIC值。折点系综合体外MIC值、PK/PD数据及临床疗效而得出，还可随环境改变面变化（如感染部位，常规药物剂量的改变、使用途径及次数的改变）。丝状真菌工作折点仅以研究为目的，临床折点尚未建立，2.4
敏感susceptihle;s
此浓度在体外检测中能抑制真菌生长，当使用推荐剂量时在临床治疗中有可能玻得成功。2.5
中介intermediate;I
菌株对常规用药时体液和组织中能达到的药物浓度反应率低于敏感株，和（或）不能被清楚地划分为“敏感”或“耐药”。在体外真菌可被抑制生长，此浓度临床治疗效果不肯定。如为药物聚集部位或高1
WS/T 411—2013
剂量使用，则临床治疗有效。该范图可作为一缓冲区，避免出于微小，不可控的技术因素导致结果解释的严重偏差。
耐药resistant,R
当使用推荐剂量时在临床治疗中很有可能失败。2.7
效价potency
抗菌药物中具有抗菌活性的部分，道过同类标准物质测定得出。单位表示为mg/g、IU/g，或用百分比表示，
质量控制
qualitycontrol:Qc
为保证检测的确性和可重复性面采取的方法或技术。3抗真菌药物
抗真菌药
抗真菌药物的标推品或参
考品可购自
贮存，推荐真空
当从震温
或在—20℃
3.2称量药物
可使用式
（1）式（2）计算药物重量
及稀释液体
式中：
药物的质量单位为毫克（mg）：下取
药物的浓度，单位为微克每毫升（ng/mL)；药物的效价单位为微克每毫克（μg/mg)；药物的体积，单位为靠弹(mL)。3.3配制药物贮存液（母液）
3.3.1药物称量
推品，布厂家推荐的条件
效期内的标准
温后市并瓶。
药物时，番恢复到索
....(1)
按照配制贮存液的浓度计算，贮存液浓度为检测时使用浓度的100倍。但有些溶解度低的药物应配制较低浓度的存液。称量应在分析天平上进行。天平应定期校准。3.3.2溶剂
-些药物需使用非水溶剂溶解，详见表1。踏剂的信息可参考厂家说明书。溶剂（分析级别）包括：三甲基亚碱(DMSO)、乙醇、聚乙二醇和羧甲基纤维素。2
抗真菌药物
两性霉素B
氛胞嘧啶
酮康唑
卡泊芬净
米卡芬净
价曲康唑
泊沙康唑
伏立康唑
表1配制抗真菌药物贮存液使用的溶剂、稀释液和检测范围裕剂bzxz.net
*DMSO=二甲基业砜。
培养基指RPMI-164C肉汤培养基，配制见表2.稀释液
培养基
增养基h
培养基\
培养基
增养基
培养基
培养基
培养基
培养基
表2RPMI-1640肉汤培养基1L制备步骤步骤
10.4gRPMI1640肉汤干粉，34.53gMOPS缓冲液，济解于900mL蒸馏水加人MOPS（终浓度为0.165mo/L)，搅拌至溶解使用1mal/L氢氧化钠调节pH至7.0（25℃）补水至1L
过滤消毒储存在4℃备用
“MOPS-3-(N-吗啡淼>丙酸3N-morpholinopropenesulfonicacid3.3.3过滤
WS/T411-—2013
检测范围
μg/mL
0.125-~64
0.125~-64
0.015 6~8
通常认为贮存液是无菌的。当有特殊要求时应进行膜过滤。但应避免使用纸张、石棉和玻璃滤器等具有吸附抗真菌药物的材质。若使用吸收材质，应在试验中记录损失量。3.3.4保存
贮存液应分装在无菌答中密封保存在一60℃环境中，不得高于一20℃。使用时应从冰箱中现用现取，未用完的应丢弃。保存条件参考厂家说明书，通常大多数药物的存液在一60℃可保存6个月。用质控菌株或参考菌株可监测药物的有效性。3.4药物稀释液
3.4.1水溶性药物稀释液
对于溶于水的抗真菌药物，直接用肉汤1：50稀释。当进行小样本量检测时推荐使用表3的稀释步骤。
WS/T411—2013
.2倍终浓度，
表3水溶性抗真菌药物敏感试验稀释步骤（小样本量）来源
储存液
步骤1
步骤3
步骤3
步骤6
非水溶性药
物稀释液
培养基
中间浓度
1：5稀释后浓度：
μg/ml
对于非水容性物带耍先用合适的溶剂配制成整浓度100倍的储存额，然后再用肉汤1：50稀释，
对皮肤来源真南标本的药物稀将步骤见表5。针对非皮肤来源真菌标本的药
物稀释步骤见表4，针
μg/mL
\DMSO-一甲基亚矾。
：2倍终浓度。
非水溶性抗真菌药物敏感试验稀释步骤（非皮肤真菌来源
建存液
贮存液
贮存液
贮存液
步骤4
步骤4
步骤4
步骤7
步骤7
溶剂DMSO
中闻装度
1:50稀释后浓度
jug/mL
μg/mL
非水溶性抗真菌药物敏感试验稀释步骤（皮肤真菌）来源
億存波
储存液
储存液
储存液
步骤4
步骤 4
步骤4
步骤7
步骤？
步骤？
步骤10
步骤10
步骤10
步骤13
步骤13
步骤13
步骤16
*DMSO=二甲基业。
2倍终浓度，
4培养基
微量肉汤稀释法培养基
溶剂DMSO
中间浓度
微量肉汤稀释法培养基推荐使用含2%葡萄糖的改良RPMI-1640肉汤，见表6。4.2
宏量肉汤稀释法培养基
WS/T411—2013
1·50稀释后浓度
μg/mL
宏量肉汤稀释法培养基推荐使用RPMI-1640肉汤，若无RPMI-1640肉汤干粉，RPMI-1640肉汤配方见附录A。
表6改良RPMI-1640肉汤培养基配方表（含2%葡萄糖）组分
蒸馏水
RPMI-1640干粉
葡萄糖
1倍浓度
2倍浓度
WS/T411—2013
5微量肉汤稀释法操作步骤
5.1丝状真菌培养及菌悬液的制备5.1.1非皮肤真菌
应在ⅡA或ⅡB生物安全柜中完成接种和菌悬液的配制等操作。大多数真菌可在马铃薯简萄糖培养基（PDA）上，经35℃培养7d后接种或直至获得生长良好的孢子，接合菌、曲霉属经48h培养后可获得孢于：镰刀菌属在35℃培养18h~72h后，再转入25℃～28℃培养至7d。
挑选曲需菌落。在1ml.0.85%无菌盐水中加人1滴（约0.01mL）吐温20后混匀，若有沉淀物应静置3min~5min。将上清液转移至无菌管巾，密封后混勾15s.采用比浊法测定菌感液浓度，曲霉属，淡紫拟青霉Paecilomyceslilacinus、宛氏拟青霉P.uariotti、皮炎外瓶等（Erophialadermatitidis）、申克孢子丝菌的吸光度（OD）值应在0.09～0.13；镰刀菌属、尖端赛多孢子菌、奔马赭霉菌Ochroconisgallopava、斑替枝孢瓶密Cladophialophorabantiana、根霉属及其他接合菌zygomycctousspecies的OD值应在0.15~0.17；双极菌属Bipolarisspp.和链格孢需属Alternariaspp.的OD值为0.25~0.3。然后用肉汤进行1：50稀释，其中中克孢了丝菌稀释度史低（为1：2稀释）。接种物稀释液浓度为终浓度（0.4×10*CFU/mL5×10*CFU/mL）的2倍。最后将0.1mL菌悬液加人微孔中。5.1.2皮肤真茵
大多数皮肤真菌在马铃薯葡萄糖培养基上生长良好。但红色毛癣菌带使用燕麦琼脂（见附录B），于35℃培养4d～5d或直至获得生长良好的抱子。用1mL0.85%盐水制备菌悬液，使用血细胞计数器计数，得到菌悬液浓度为2倍接种终浓度(1X103CFU/mL~3X10CFU/mL)
5.2接种物稀释液的定量
5.2.1非皮肤真菌
将0.01mL1：10稀释的菌悬液接种在沙氏培养基（SDA)上计数菌落形成单位（CFU/mI)。在28℃~30℃培养并每日观察计数。培养时间从不足24h（根霉）到5d(尖端赛多孢了菌）不等。5.2.2皮肤真菌
将0.01mL1：10稀释的菌悬液接种在沙氏培养基（SDA)上，计数菌落形成单位（CFU/mL）。在28~30C培养并每日观察计数。
5.3接种
检测当几，将0.1ml.2倍终浓度的接种物加人微孔中，并加人0.1mL2倍终浓度的药物稀释液。对照管中加入0.1mL接种物和0.1ml.2倍浓度的药物稀释溶剂。5.4培养
应在35℃培养，但培养时间不同：根霉屑为21h～26h，曲霉属、镰刀菌属和申克孢子丝菌为46h~50h，假性阿什利零为70h~74h。对于棘白菌素类抗真菌药物，曲霉属和宛氏拟青霉为21h~26h，假性阿什利等为46h~~72h。如6
果第一天对照孔生长良好，即在孔底部呈融合生长，亦可确定MEC值。5.5结果判读MIC和MEC值
5.5.1一般情况
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判读结果时通过与生长对照孔比较，观察生长抑制情况确定MIC值。对于棘白菌素类抗真菌药物，使用MEC.
5.5.2两性霉素B
两性霉素BAmphotericinB)生长终点定义明确，为100%抑制任何可见的生长，但拖尾现象不常见，拖尾现象可能反映与临床相关的耐药。5.5.3氟胞嘧啶、氟康唑、酮康唑氟胞嘧啶（Flucytosinc）和吡咯类，例如：氟康噬（Fluconazole）、醒康唑（Ketoconazole）不像两性霉素B牛长终点定义那样严格，与生长对照相孔比较，非皮肤真菌生长抑制50%以上、皮肤真菌生长抑制80%以上判断为终点。
5.5.4伊曲康唑、泊沙康唑，里氟康唑、伏立康唑对于伊曲康唑（Itraconazole)以及其他吡略类药物，例如：泊沙康唑（Pasaconazole），里氟康唑（Re-vuconazole）和伏立康哗（Voriconazole)终点定义为1oo%抑制生长。曲震及其他条件致病性丝状真菌生长终点拖尾现象很少见，拖尾现象可能反映临床相关耐药。当检测皮肤真菌对伊曲康唑、泊沙康噬、伏立康唑的MIC时，终点定义为抑制生长80%以上。5.5.5棘白菌素类
虽然对棘白菌素类药物（Echinacaudins），例如：安尼芬净（Anidulafungin）、卡泊芬净（Caspofurnigin）和米卡芬净（Micafungin）生长终点判定不如两性霉素B明确，但是应用MEC生长终点的概念，提高了试验的可重复性。5.5.6环吡酮
环吡酮（Ciclopirox)终点判定不像两性素B定义那样严格，为抑制生长80%以上：5.5.7灰黄霉素
灰黄霉素（Griseofulvin）终点判定不像两性霉素B定义那样严格，为抑制生长80%以上。5.5.8特比蔡芬
特比蔡芬（Terbinafine）终点判定不像两性霉素B定义那样严格，为抑制生长80%以上。5.6结果解释
5.6.1一般情况
丝状真菌的临床折点尚未建立，但对于伊曲康唑、泊沙康唑，伏立康唑、两性霉素B和卡泊芬净5种药物已建立了以研究为目的的鉴定耐药株的工作折点（workingbreakpoint）。研究显示曲霉属对5种药物、尖端赛多孢子菌和淡紫拟青霉对泊沙康唑和卡泊芬净、双极菌属和链格孢霉属对吡略类、接合菌对泊沙康唑和两性霉素B的MIC都低于1μg/mL。对于上述5种药物的工作折点：敏感为MIC或7
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MEC<1μg/ml.，中介为MIC或MEC一2g/mL，耐药为MIC或MEC≥4μg/mL5.6.2两性霉素B
大多数丝状真菌的MIC在0.5μg/mL~2μg/mL之间：但土曲、局限枝顶孢霉、淡紫拟青霉、尖端赛多孢子菌、多育赛多孢的MIC可高于2μg/ml（分布范围为2μg/mL~16μg/mL）。尽管研究数据显示两性霉素B的MIC值和疗效无相关性但MIC高于2Jg/mL治疗失败可能性较人，而MIC低于2ug/mL可提示治疗成功。
5.6.3氟胞嘧啶
大多数丝状真菌对氟胞嘧啶均不敏感，MIC值均64ug/mL。但曲霉属和暗色真菌例外5.6.4氯康唑
大多数丝状真菌对氟康唑均不敏感，MIC值均>64μug/mL。但双相真菌和皮肤真菌例外。5.6.5酮康唑
大多数丝状真菌的MIC在0.03μg/mL~16ug/mL之间。但研究数据未显示MIC值和疗效的相关性。
5.6.6伊曲康唑、泊沙康唑，里氣康唑，伏立康唑应使用造当的溶剂溶解伊曲康唑。与葡康唑不同，对于非皮肤真菌伊山康唑MIC值8μg/ml与耐药相关，但研究数据未显示MIC值和疗效的相关性。而对于皮肤真菌，伊曲康唑、泊沙康唑、里氟康唑、伏立康唑的MIC值都较低，但氟康唑的MIC>16μg/mL5.6.7棘白菌素类
安尼芬净、卡泊芬净和米卡芬净对曲霉属的MECs车1μg/mL，MEC值和疗效的相关性尚未确定。
5.6.8环吡酮
环吡翻的MIC≤1ug/mL，但MIC值和疗效的相关性尚未确定。5.6.9灰黄霉素
灰黄霉素的MIC≤1μg/mL。但MIC值和疗效的相关性尚未确定5.6.10特比蔡芬
特比萘芬对人多数皮肤真菌的MIC≤0.25μg/mL，但已有报道红色毛癣菌的MIC≥0.5μg/mLMIC值和疗效的相关性尚未确定。6宏量肉汤稀释法操作步骤
6.1药物稀释液
按照3.3配制药物贮存液。然后用RPMI-1640肉汤将贮存液1：10稀释，得到10倍终浓度的稀释液。
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