标准内容
ICS11.020
中华人民共和国卫生行业标准
WS/T412-2013
血清甘油三酯测定参考方法
同位素稀释气相色谱质谱法
Reference measurement method for serum triglyceridcs-Isotope dilution gas chromatography mass spectrometry2013-06-03发布
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会璃防
2013-12-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草WS/T412-2013
本标准起草单位:卫生部临床检验中心,中国医学科学院北京协和医院、北京大学第一医院、首都医科大学附属同仁医院。
本标推主要起草人:胡翠华、张传宝、马蝶、陈文祥、中子瑜、邱玲、王学晶、刘向祎。1范围
血清甘油三酯测定参考方法
同位素稀释气相色谱质谱法
WS/T412—2013
本标准规定了血清甘油三酯测定参考方法的同位素稀释气相色谱-质谱法的技术要求,包括样本采集与处理、仪器测定、数据分析和不确定度分析等内容。本标准适用于实验室血清比油三酯的测定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注月前的引用文件,仪注日期的版本适用丁本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验案用水规格和试验方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
参考测量方法
referrance measurenent method经过充分研究的测量方法,其测量值的测量不确定度适合其预期用途,用于评价测量相同量的其他测量方法的正确性和鉴定参考物质方面的用途。3.2
互通性commutability
临床检验参考物质或校准物质的互通性,指用不同测量过程测量该物质时,各测量过程测量结果之间的数宁关系,与用这些测量过程测量实际临床样本时测量结果的数字关系的一致程度,亦即该物质理化性质与实际临床样本的接近程度。4方法原理
本标准建立的血清甘油三酯参考测量方法以同位素稀释气相色谱质谱法为测量原理。方法是以稳定同位素3个13C标记的甘油为内标添加至血清中,氢氧化钠乙醇溶液水解血清甘油酯为游离什油,用丙酮沉淀蛋白,使用N-(特丁基二甲基硅烷基)甲基三氟乙既胺(MTBSTFA)衍生甘油为特丁基二甲基硅烷醚(tBDMS),气相色谱质谱在电子轰击(EI)电离模式下选择检测甘油和内标的特征离子,用甘油和内标峰面积比计算血清甘油三酯浓度。5试剂
所用试剂如下:
a)水(HO):除非有特别说明,应使用GB/T6682定义的一级实验用水;1
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N-(特丁基二甲基硅烷基)甲基三氟乙酰胶(MTBSTFA):衍生级;无水乙醇:色谱纯;
氢氧化钠:分析纯:
盐酸:分析纯;
四氯化碳:分析纯;
丙酮:色谱纯;
乙腊:色谱纯。
6仪器
取样装置
自动稀释分配器
稀释注射器2500mL,攻样注射器250mL。在23℃时,去离子水取样体积达到了该仪器说明书标示的30%~50%,对应的准确度为±1.0%,不精密度≤0.2%。6.1.2微量移液器
L.200M和50
经校推合
合格的微量移液幕,规格分别为1000应6.2前处理装置
混匀器
具有调连
6.2.2恒湿
:可在30
有水平转头
6.2.3离心
C温度区间保持恒温
能达到!
离心力
6.2.4旋涡混合
器:具有调速功能。
厂燥箱可在30%
6.2.5真空!
氮吹仪!具有30℃
6.3分析仪器
气相色谱仪
200温度区间保特恒温和干燥。
00C温度区间加热功能的干性氮吹仪进样口:具有不分流进样功能
柱温箱:具有程序开温功能。可在300温度区间内进行调节。
毛细管色谱柱:内涂层为100%甲基聚硅氧烷,柱长30m,内径0.25mtm,涂层内膜0. 25μm载气:高纯氨气,99.999%,
质谱仪
具右气质联机接口。
6.3.2.2具有电子轰击离子源。
3具有选择离子检测功能,并使用白动调谐模式进行质量校正。6.3.2.3
数据处理系统:能够实时采集、记录及存储质谱数据。7样本
7.1分析样本
包括校准物质、正常人或病人血清、质控血清(冰冻或冻干)。样本所需用量为0.1mL。2
7.2样本的保存
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人血清样本若不立即测定,则应于一20℃保存,长期保存应置于,70℃。冰冻样本应在室温下融化、充分混匀后使用。冻干样本应按照相关说明书所描述的使用期限和条件保存,临用前按照说明复溶重组,充分混匀。
8校准
8.1标准物质
使用有证甘油标推物质,标准物质的使用、保存及有效期限应符合有证标准物质的说明。8.2内标
使用3个13C标记的甘油,标示同位素丰度大于99%8.3甘油校准工作液的制备
分别准确吸取定量的甘油标准物质,用移液管准确量取m工,10nL,20mL30mL和40mL
容量瓶,用去离子水稀释定容配制成浓度为50mg/dlmL
于5个100
300mg/dl400mg/aL的校准工作落液保存。
8.4甘油内标二作液的制备
推确吸取内标原液,置
一4冰箱中保有
作液,置于
9样本前处
9.1通则
L安瓶,每支务O.#
100ing/aL,200mg/dL
置于20℃冰箱中
,用去离子水稀释定容,配制成浓度为400mg/dL的工容最瓶中,
本参考测量方法用于新鲜冰冻或冻干血清样本的甘油浓度测定在处理样本时,应严格遵从对潜在生物传染性样本处理的相美规定,使用时遵循生物安全规则,并根据规定对废物进行处理
9.2取样和加内标及水解甘油酯
用稀释器的稀释功能取样同时加入内标和水解液。内标混勾在氢氧化钠乙醇溶液中,用作冲洗液。样本体积为0.1mL,冲洗液体积1mL,冲人5mL安颜中。漩涡混勾后,置50℃水浴温育30in。9.3中和及净化
加人0.8mL盐酸,混匀。再加入1.5mL四氯化碳,混匀,4000r/min离心10min。9.4沉淀蛋白
取0.2ml.上清液于2mL安瓶中,加人2mL丙酮,漩涡振荡5min,40001/min离心25min。9.5衍生化
取上清液0.8mL至2mL样本瓶中,50℃氮气流下吹下。残渣加人0.5mLMTBSTFA和3
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0.5mL乙晴,密封混匀,60℃下1h。反应完毕后冷却至室温,用于进行气相色谱-质谱(GC/MS)分析。
10仪器分析
10.1仪器条件设定
10.1.1气相色谱条件设定
选择适当操作条件来分析甘油和甘油-内标衍生产物,推荐条件为:进样方式:不分流进样1uL
进样口温度:250℃;
载气流速:1.0mL/min,省气模式持续恒流;d)气质接口温度:255℃;
毛细管色谱注:固定相100%二甲基聚硅氧烷,柱长30m,内径0.25mm,膜厚0.25ume
梯度升温:初始温度110℃,以50℃/min的速度升温至250℃,停留1.6rin10.1.2
质谱条件设定
使用全扫描(SCAN)方式进行定性分析,用于谱库检索,确认待测物性质。10.1.2.1
使用选择离子检测(SIM)方式进行定量分析,检测待测物的特征离子峰。10.1.2.2
10.1.2.3在高分辨率状态下,调整溶剂延时和驻留时间的设置,使色谱峰分离达到理想效果。仪器调谐,仪器分析开始前带选用自动调谐方式进行调谐,校正质量69、219,502离子峰的10.1.2.4
质荷比,进行调诺评价,通过后保存调谐文件。10.2SIM检测过程
10.2.1按10.1要求设气相色谱-质谱联用仪条件。10.2.2分析系列:每个样本与校准品同一批测定,每个样本应重复3次进样测定。10.2.3原始数据的有效性检查:在样本SIM分析过程时,观察检测到的峰型,确保峰型正常、仪器运行可靠。要求3次重复进样测定所得油和内标的峰面积比的变异系数小于1%。10.3样本测定
将分析样本按照10.1~10.2所述的程序进行测定,得到监测离子对的色谱图。11
数据处理
11.1有效数据
符合10.2.3要求的3次重复进样测定结果的均值为样本测定的有效数据。11.2原始资料的处理
用气质联用仪的数据分析软件对SIM检测的色谱图进行积分处理,提取监测离子对,在积分器中选择化学积分模式,设定好积分参数,对样本与内标的离子丰度值进行峰面积积分。11.3定量计算
11.3.1采用内标法
计算样本与内标的峰面积比值,用两者的峰面积比进行定量计算。4
11.3.2标准曲线的构建
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以峰面积比值为白变量,标示浓度值为因变量得出直线回归方程,用公式(1)表示为:Y=ax+6
式中:
X分析样本中待测化合物的量:
一样本与内标的峰面积比;
一截距;
b一斜率。
测量所需的最小校准点数是5个,标准漆液浓度值和峰面积比值的相关系数大于0.9999。11.3.3样本浓度的计算和结果换算(1)
将样本蜂面积比值代入公式(1),计算得样本浓度。样本质量浓度单位为mmol/L(毫摩尔/升),如果需要有换算成mg/dl(毫克/分升)的情况,用公式(2)计算:to=2X885.4/10
式中:
试样中山油的合量,单位为毫克每分升(mg/dL);试样中比池的含量,单位为毫摩尔每升(mmol/L);885.4—甘油的摩尔质量,单位为克每摩尔(g/moL)。11.4不确定度评估
11.4.1不确定度来源分析
本标准建立的血消甘油三酯参考方法是以同位素稀释气相色谱质谱法为测量原理。以标准曲线法为校准方法。校准溶液的配制,样本和内标的加入使用释器。分析测定的不确定度来源包括A类和B类不确定度。A类不硫定度为样本的重复测定、标准曲线法中元二次回归方程的偏差:B类不确定度为油校准品的配制、片油校准品的纯度。11.4.2合成不确定度(U,)的计算根据11.4.1中不确定度来源计算合成不确定度。11.4.3扩展不确定(U)的计算
扩展不确定度(U)为包含因子乘以合成不确定度,用公式(3)表示为:U-kU.
式中:
k——包含因子,在95%的可置信水平取k-2;U。—合成不确定度。
12测量准确度
(3)
实验室内验证所建测量过程的准确性,可以通过如下实验说明:测定有证参考物质,所得结果应在不超过认定值的不确定度范围。测量过程的批内、批间和总不精密度应小于2%。5
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3特殊情况
使用本标准描述的参考测量程序测定制备物或有证标准物质的血清H油三酯浓度,其结果不能直接用于其他常规甘油三酯测定方法的校准。应考虑制备物或有证标准物质的互通性对常规廿油三酯测定方法的影响。
14报告
14.1样本来源的说明
应报告样本的类型:血清、制备物(质控品或校准品)或有证标准物质。应报告样本的保存方式和保存时间。重组的样本应同时报告重组的过程。14.2使用测量程序的说明
应说明所使用测量程序的原理为同位素释气相色谱质谱法。报告所使用的校准物质的名称和认定纯度。
14.3测量结果
应报告血清甘油三酯浓度的单位为mol/L。应报告测量结果的不确定度。参考文献
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中华人民共和国卫生
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同位素稀释气相色谱质谱法
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开本880×12301/16印张0.75字数15下字2013年6月第一版2013年6月第一次印刷*
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