ICS65.020.01 B40 DB37 山东省地 方 标准 DB37/T3572—2019 牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）检测技术规程 Code of practice for detection of A2 type of β-casein (A2milk) in cow's milk2019-05-29发布 山东省市场监督管理局 2019-06-29实施 发布 前言 1范围 2规范性引用文件 3术语和定义， 4检测原理， 5主要试剂配制， 6主要仪器设备 7质谱检测及数据处理参数 8检测方法. 8.1样本采集 8.2蛋白提取， 8.3蛋白质的消化 8.4质谱鉴定 9结果判定， 9.1SDS-PAGE鉴定 9.2A2型β-酪蛋白的判定. 10废弃物的处理. 11检测过程中防止交叉污染的措施附录A（资料性附录）主要试剂配制附 录 附 录 B C （资料性附录） （资料性附录） 主要仪器设备 目 蛋白检测参数及结果 次 DB37/T3572—2019 II 2 2 6 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。DB37/T3572—2019 本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东奥克斯畜牧种业有限公司、山东省畜牧总站、大同市南郊区四方高科农牧有限公司、中国农业大学、江苏省农业学院畜牧研究所。本标准主要起草人：黄金明、王秀革、瀚志花、姜强、王玲玲、张思聪、张亚冉、魏晓超、高亚平、刘文浩、高运东、侯明海、杨国瑞、戴蕴平、仲峰II 1范围 DB37/T35722019 牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）检测技术规程本标准规定了牛奶和奶粉中A2型β-酪蛋白（A2奶）的检测方法。本标准适用于牛奶和奶粉中A2型β-酪蛋白（A2奶）的检测。2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB/T19495.2—2004转基因产品检测实验室技术要求GB/Z35959—2018液相色谱-质谱联用分析方法通则术语和定义 3 下列术语和定义适用于本文件。3.1 A2型β-酪蛋白A2β-casein；A2cSN2β-酪蛋白由224个氨基酸（含有15个氨基酸的信号肽）组成，具有不同的变体型（A1、A2、A3、B、C、E、F、H1、I），当第51位、52位、82位、103位、108位、121位、137位、167位氨基酸分别为谷氨酸、谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸时，称为A2型β酪蛋白。3.2 A2奶A2milk 所含β酪蛋白为A2型的牛奶称为A2奶。3.3 质谱法Massspectrometry；MS 试样被电离后，形成不同质荷比的离子，根据这些离子的质量数和相对丰度分析试样的方法。3.4 质荷比Mass-to-chargeratio 离子的质量m与其所带的电荷数z之比，以m/z表示。检测原理 4 1 DB37/T3572—2019 β-酪蛋白变体型对应不同的氨基酸突变位点（p.51E>K、p.52E>K、p.82P>H、p.103L>I、p.108M>L、p.121H>Q、p.137S>R、p.167P>L）（参考序列：GenBankAAA30431.1），而不同氨基酸之间存在分子量差异。利用质谱分析技术，根据质荷比差异将样品蛋白质中存在氨基酸突变的肽段鉴定出来，从而确定氨基酸突变位点，实现对不同变体型β-酪蛋白检测的目的主要试剂配制 o 实验所用水为符合GB/T6682规定的双蒸水：高压灭菌条件为121℃，1.034×105Pa压力，蒸汽灭菌20min。试剂配制见附录A。 6 主要仪器设备 见附录B。 质谱检测及数据处理参数 见附录C。 3检测方法 8 8.1样本采集 8.1.1待检测的新鲜牛奶 每头奶牛采集新鲜牛奶（排除头奶或末乳）50mL，充分混匀后，-80℃保存8.1.2待检测的商品化奶粉 包装未开封，常温储存。 8.2蛋白提取 8.2.1从-80℃取出牛奶样本，常温解冻后充分混匀，取样50μL，或称取奶粉样本30mg。8.2.2向上述样品中加入500μL裂解液【8M尿素，30mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）】。冰上裂解10min。离心，4℃，20000g，30min。取上清，避免吸到油脂。8.2.3加入二硫苏糖醇（DTT）至终浓度10mM。56℃水浴1h。取出后，迅速加入碘乙酰胺（IAM）至终浓度55mM，暗室静置1h。 8.2.4使用考马斯蓝染色法（bradford法）对蛋白质进行定量。8.2.5对定量后的蛋白质进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定（如附录C.1）。8.3蛋白质的消化 8.3.1每个样品取20g蛋白，加入到10K超滤管中，14000g，4℃，离心40min，弃废液。8.3.2加入200μL的25mM碳酸氢铵（NHHC0），14000g，4℃，离心40min，弃废液。8.3.3重复上述步骤两遍。 8.3.4加入1μg/μL的胰蛋白酶（Trypsin）和V8蛋白酶（Glu-C）各1μL，37℃水浴24h。离心收集消化后的肽段 2