DB37/T 3560-2019
ICS 65.020.01
B40
山东省地方标准
DB37/T 3560-2019

荷斯坦牛致死单倍型（HH1、HH3、HH4和HH5）基因检测技术规程
Code of practice for molecular detection of lethal haplotypes (HH1, HH3, HH4 and HH5) in Holstein

2019-05-29发布
2019-06-29实施
山东省市场监督管理局 发布

前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。
本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。
本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东省畜牧总站、威海市畜牧兽医局、山东奥克斯畜牧种业有限公司、江苏省农业科学院畜牧研究所。
本标准主要起草人：黄金明、瀚志花、王秀革、张思聪、赵国清、高亚平、魏晓超、姜强、刘文浩、张亚冉、李荣岭、李建斌、高运东、曲绪仙、侯明海、仲踏峰。

荷斯坦牛致死单倍型（HH1、HH3、HH4和HH5）基因检测技术规程

1 范围
本标准规定了荷斯坦牛四种致死单倍型（HH1、HH3、HH4和HH5）的检测方法和结果判定。本标准适用于荷斯坦牛四种致死单倍型（HH1、HH3、HH4和HH5）的检测与诊断。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.2-2004 转基因产品检测实验室技术要求
GB/T 27642-2011 牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法
NY/T 1672-2008 绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程
NY/T 2695-2015 牛遗传缺陷基因检测技术规程
DB37/T 2037-2012 牛白细胞黏附缺陷症（BLAD）基因分子检测技术规程

3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。

3.1
荷斯坦致死单倍型1 Holstein lethal haplotype 1, HH1
由牛第5号染色体的调亡蛋白酶激活因子1（Apoptotic protease-activating factor 1, APAF1）基因产生的终止突变（g.63150400C>T: rs448942533: 牛参考基因组UMD3.1）引起的一种隐性遗传缺陷。当突变等位基因纯合时，个体致死，大多数表现为妊娠早期流产，不易被观察，在健康奶牛群体中无纯合的HH1单倍型。

3.2
荷斯坦致死单倍型3 Holstein lethal haplotype 3, HH3
由牛第8号染色体的染色体结构维持2（Structural maintenance of chromosomes 2, SMC2）基因一个错义突变（g.95410507T>C: rs456206907; 牛参考基因组UMD3.1）引起的一种隐形遗传缺陷，与乳蛋白、繁殖年限、青年牛受胎率、母牛受胎率有关，当突变的等位基因纯合时致死。

3.3
荷斯坦致死单倍型4 Holstein lethal haplotype 4, HH4
由牛1号染色体的磷酸核糖甘氨酰胺转甲酰基酶（Phosphoribosylglycinamideformyltransferase GART）基因的一个错义突变（g.1277227A>C: rs465495560: 牛参考基因组UMD3.1）引起的隐性遗传缺陷。HH4导致流产，与产奶、乳蛋白和繁殖力有关，无纯合子个体。

3.4
荷斯坦致死单倍型5 Holstein lethal haplotype 5, HH5
由牛9号染色体的线粒体转录因子B1（Transcription factor B1, mitochondrial, TFB1M）基因缺失138.348kb的区域（93232651bp至93370998bp: 牛参考基因组UMD3.1）造成的一种隐性遗传缺陷，携带者影响乳蛋白量和女儿妊娠率，无纯合子个体。

4 检测原理

4.1 荷斯坦牛致死单倍型HH1、HH3和HH4的检测
根据APAF1、SMC2和GART基因的因果突变设计特异引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行测序分析。根据DNA测序的峰图及碱基序列比对结果，判断其基因型，确认是否携带致死单倍型。

4.2 荷斯坦牛致死单倍型HH5的检测
根据牛TFB1M基因的缺失序列，首先在牛TFB1M基因缺失序列中设计一对引物，进行PCR扩增，携带者与正常者均可扩增出目的条带。其次在牛TFB1M基因缺失序列两端设计一对引物，进行PCR扩增，携带者可扩增出目的条带，正常者因扩增片段太长，检测时无条带。最后根据两对引物的PCR扩增产物电泳条带，对致死单倍型HH5携带者和正常者综合进行判断。

5 主要试剂
除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的双蒸水；高压灭菌条件为121℃，1.034×10^5 Pa压力，蒸汽灭菌20min。主要试剂见附录A。

6 主要仪器设备
见附录B。

7 检测方法

7.1 样本采集
颈静脉采集血样3mL~5mL，ACD抗凝，-20℃保存。对公牛，亦可采集2~3剂细管精液（0.25mL或者0.5mL规格），液氮保存。0.1g～0.3g组织（耳组织、肌肉）或带毛囊的牛毛浸入75%的酒精，-20℃保存备用。

7.2 DNA提取
7.2.1 血液DNA的提取
血液DNA提取按DB37/T 2037-2012中7.2.1规定的方法执行。