ICS65.020.01 B40 山东省地 DB37 方 标准 DB37/T35602019 荷斯坦牛致死单倍型（HH1、HH3、HH4和HH5）基因检测技术规程 Code of practice for molecular detection of lethal haplotypes (HH1, HH3, HH4 andHH5)inHolstein 2019-05-29发布 山东省市场监督管理局 2019-06-29实施 发布 前言 1范围. 2规范性引用文件 3术语和定义， 4检测原理 目 4.1荷斯坦牛致死单倍型HH1、HH3和HH4的检测4.2荷斯坦牛致死单倍型HH5的检测5主要试剂， 6主要仪器设备 7检测方法。 7.1样本采集 7.2DNA提取 7.3DNA浓度和纯度检测. 7.4引物序列. 7.5PCR扩增 7.6PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测7.7测序分析 8结果判定 8.1致死单倍型HH1测序结果判定与表述8.2致死单倍型HH3测序结果判定与表述8.3致死单倍型HH4测序结果判定与表述8.4致死单倍型HH5扩增条带判定与表述9废弃物的处理 10检测过程中防止交叉污染的措施（资料性附录）主要试剂 附 录A 附 （资料性附录）主要仪器设备 录 B 附 录 C （规范性附录） PCR扩增产物 次 DB37/T35602019 II 5 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口DB37/T3560—2019 本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东省畜牧总站、威海市畜牧兽医局、山东奥克斯畜牧种业有限公司、江苏省农业科学院畜牧研究所。本标准主要起草人：黄金明、瀚志花、王秀革、张思聪、赵国清、高亚平、魏晓超、姜强、刘文浩、张亚冉、李荣岭、李建斌、高运东、曲绪仙、侯明海、仲踏峰、II DB37/T3560—2019 荷斯坦牛致死单倍型（HH1、HH3、HH4和HH5）基因检测技术规程1范围 本标准规定了荷斯坦牛四种致死单倍型（HH1、HH3、HH4和HH5）的检测方法和结果判定。本标准适用于荷斯坦牛四种致死单倍型（HH1、HH3、HH4和HH5）的检测与诊断。2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2—2004转基因产品检测实验室技术要求GB/T27642—2011牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法NY/T1672一2008绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程NY/T2695—2015牛遗传缺陷基因检测技术规程DB37/T2037—2012牛白细胞黏附缺陷症（BLAD）基因分子检测技术规程3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 荷斯坦致死单倍型1Holsteinlethalhaplotype1，HH1由牛第5号染色体的调亡蛋白酶激活因子1（Apoptoticprotease-activatingfactor1，APAF1）基因产生的终止突变（g.63150400C>T：rs448942533：牛参考基因组UMD3.1）引起的一种隐性遗传缺陷。当突变等位基因纯合时，个体致死，大多数表现为妊娠早期流产，不易被观察，在健康奶牛群体中无纯合的HH1单倍型。 3.2 荷斯坦致死单倍型3Holsteinlethalhaplotype3，HH3由牛第8号染色体的染色体结构维持2（Structuralmaintenanceofchromosomes2，SMC2）基因一个错义突变（g.95410507T>C：rs456206907；牛参考基因组UMD3.1）引起的一种隐形遗传缺陷，与乳蛋白、繁殖年限、青年牛受胎率、母牛受胎率有关，当突变的等位基因纯合时致死。3.3 荷斯坦致死单倍型4Holsteinlethalhaplotype4，HH41 DB37/T35602019 由牛1号染色体的磷酸核糖甘氨酰胺转甲酰基酶（PhosphoribosylglycinamideformyltransferaseGART）基因的一个错义突变（g.1277227A>C：rs465495560：牛参考基因组UMD3.1）引起的隐性遗传缺陷。HH4导致流产，与产奶、乳蛋白和繁殖力有关，无纯合子个体。3.4 荷斯坦致死单倍型5Holsteinlethalhaplotype5，HH5由牛9号染色体的线粒体转录因子B1（TranscriptionfactorB1，mitochondrial，TFB1M）基因缺失138.348kb的区域（93232651bp至93370998bp：牛参考基因组UMD3.1）造成的一种隐性遗传缺陷，携带者影响乳蛋白量和女儿妊娠率，无纯合子个体。4检测原理 4.1荷斯坦牛致死单倍型HH1、HH3和HH4的检测根据生APAF1、SMC2和IGART基因的因果突变设计特异引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行测序分析根据DNA测序的峰图及碱基序列比对结果，判断其基因型，确认是否携带致死单倍型4.2荷斯坦牛致死单倍型HH5的检测根据牛TFB1M基因的缺失序列，首先在牛TFB1M基因缺失序列中设计一对引物，进行PCR扩增，携带者与正常者均可扩增出自的条带。其次在生TFB1M基因缺失序列两端设计一对引物，进行PCR扩增，携带者可扩增出目的条带，正常者因扩增片段太长，检测时无条带。最后根据两对引物的PCR扩增产物电泳条带，对致死单倍型HH5携带者和正常著综合进行判断主要试剂 5 除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的双蒸水；高压灭菌条件为121℃，1.034×105Pa压力，蒸汽灭菌20min。主要试剂见附录A。主要仪器设备 o 见附录B。 7检测方法 7.1样本采集 颈静脉采集血样3mL~5mL，ACD抗凝，-20℃保存。对公牛，亦可采集2~3剂细管精液（0.25mL或者0.5mL规格），液氮保存。0.1g～0.3g组织（耳组织、肌肉）或带毛囊的牛毛浸入75%的酒精，-20℃保存备用。 7.2DNA提取 7.2.1血液DNA的提取 血液DNA提取按DB37/T2037—2012中7.2.1规定的方法执行。2