ICS11.220 B41 DB37 山东省地 方 标准 DB37/T3571—2019 生副结核病Y干扰素ELISA诊断技术Diagnosis on bovine paratuberculosis by enzyme-linked immunoassay of-interferon2019-05-29发布 山东省市场监督管理局 2019-06-29实施 发布 前言 1范围 2规范性引用文件 3术语和定义， 4试验原理， 5试剂及仪器， 5.1材料. 5.2仪器. 6检测方法。 6.1试剂配制， 6.2采血... 6.3全血培养 6.4检测步骤， 7结果判定 7.1样品结果计算 7.2阴阳性结果判定标准 8废弃物的处理 9检测过程中防止交叉污染的措施10操作注意事项 附录 A 附 附 附 录 录 录 C D （资料性附录） （资料性附录） （资料性附录） （规范性附录） 目 血液处理所需材料 ELISA试验所需试剂 检测所需仪器 检测所用试剂的配制 次 DB37/T3571—2019 II 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心DB37/T35712019 本标准主要起草人：解晓莉、杨宏军、张亮、孙阳阳、程凯慧、楚会萌、刘来兴、杨美。II 1范围 牛副结核病干扰素ELISA诊断技术DB37/T3571—2019 本标准规定了牛副结核病干扰素ELISA诊断技术的术语和定义、试剂及仪器、检测方法、结果判定和操作注意事项等。 本标准所规定的技术适用于牛感染副结核分枝杆菌时干扰素的检测。2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489-—2008实验室生物安全通用要求GB/T19495.2—2004：转基因产品检测实验室技术要求SN/T1084—2010牛副结核病检疫技术规范术语和定义 3 下列术语和定义适用于本文件。3.1 牛副结核病Paratuberculosis 种由副结核分枝杆菌（禽分枝杆菌副结核亚种）引起的以慢性增生性、顽固性肠炎和进行性消瘦为特征的慢性传染病，具有强烈的传染性，可垂直传播试验原理 A 被副结核分枝杆菌致敏的T淋巴细胞再次受到相关抗原刺激后可短时间内释放大量的干扰素（-Interferon），通过干扰素的检测可实现对副结核分枝杆菌感染的诊断。试剂及仪器 5 5.1材料 5.1.1血液处理所需材料 血液培养所需材料参见附录A。 2ELISA试验所需试剂 5.1.2 ELISA试验所需试剂参见附录B 1 5.2仪器 检测所需仪器参见附录C。 6检测方法 6.1试剂配制 检测所需试剂及制备方法按附录D的规定6.2采血 DB37/T35712019 血液的采集按SN/T1084一2010规定的方法执行。将采集的血液（至少5mL）放入肝素抗凝管中，轻轻颠倒6～10次混合血液，使肝素溶解，室温（22℃土5℃）下运送到实验室并在采血后30h内进行培养。6.3全血培养 6.3.1血液分装 用一次性自动移液器在无菌条件下将抗凝血加入24孔组织培养板，每份血分三孔，1.5mL/孔。6.3.2加入抗原 6.3.2.1无菌操作下分别加入100uLPBS（阴性抗原对照），禽结核提纯菌素（A-PPD）及牛结核提纯菌素（B-PPD）至相应的孔。 6.3.2.2用微量振荡器高速振荡1min，将抗原与分装的血液充分混匀。或将细胞培养板及其盖紧紧固定在一起，在光滑的表面上顺时针和逆时针各旋转10次。6.3.3孵育 将组织培养板在37℃恒温培养箱中孵育16h～24h。6.3.4血浆样品收取及贮存 用可调移液器小心吸取约400uL的上层血浆，转入新的1.5mL离心管中。吸取血浆时应尽量避免吸入细胞。将盖子密封，表明时间、编号等信息，在2℃～8℃可贮存7天，在-20℃可贮存数月。检测前，样品应恢复至室温并充分混匀。6.4检测步骤 6.4.1溶解冻干试剂，按“说明10”平衡其他试剂。6.4.2按照商品化牛IFN-Y检测试剂盒说明书进行牛IFN-Y的ELISA检测。6.4.3质量控制。按照试剂盒质量控制标准判断试验的有效性。如果试验中阴阳性对照结果有一条不符合试验标准，试验则视为无效，应重新检测。7结果判定 7.1样品结果计算 计算每个样品阴性抗原、A-PPD和B-PPD的平均OD值。2