GB/T 29664-2013
基本信息
标准号： GB/T 29664-2013
中文名称：化妆品中维生素B3(烟酸、烟酰胺)的测定 高效液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
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相关标签： 化妆品 维生素 烟酸 烟酰胺 测定 高效 色谱法 色谱 串联 质谱法
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标准简介
GB/T 29664-2013 化妆品中维生素B3(烟酸、烟酰胺)的测定 高效液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法
GB/T29664-2013
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标准内容
ICS 71. 100. 70
中华人民共和国国家标准
GB/T29664-2013
化妆品中维生素B3（烟酸、烟胺）的测定高效液相色谱法和
高效液相色谱串联质谱法
Determination of vitamin B,(nicotinic acid and nicotinanide)in cosmetics--HPLCand HPLC-MS/MS2013-09-06发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2014-02-15实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规测起草。本标准由全国香料香精化妆品标雅化技术委员会（SAC/TC257)归口。GB/T29664—2013
本标准起草单位：大连市产品质量监督检验所（国家日化产品质鼠监督检验中心）、上海市日用化学工业研究所（国家香料香精化妆品质量监督检验中心）、大连标准检测技术研究中心：本标准主要起草人：毛希琴、郑顺利、胡侠，孙稚脊、吴海霞，潘炜、武晓剑、康薇1范围
化妆品中维生素B（烟酸、烟酰胺)的测定高效液相色谱法和
高效液相色谱串联质谱法
GB/T 29664—2013
本标准规定了化妆品中维生素B（烟酸、烟酰胺)测定的高效液相色谱法及高效液相色谱串联质谱法。
本标准适用于音霜、乳液、化妆水皂基如美容皂、蜡基如唇膏等化妆品中维生素B（烟酸、烟酰胺）的定量测定，其中高效液相色谱法对烟酸、烟酰胺的检出限均为2g/g，定量限均为6μ/;高效液相色谱串联质谱法对烟酸、烟酰腰的检出限均为100μg/kg，定量限均为300μg/kg。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注目期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理
烟酸、烟酰胺为极性化合物易溶于水相，化妆品中的油溶性成分易溶于有机相，而化妆品中的表面活性剂则富集于有机相与水相界面处。利用水和二氯甲烷(或异辛烷)双液相体系将目标物与化妆品中油溶性成分及表面活性剂初步分离。酸性条件下用反相及强阳离子交换混合型固相萃取材料吸附膏集目标物，脱除干扰物质后，洗脱，定容，用反相高效液相色谱分离，二极管阵列检测器检测（高效液相色谱法)或串联四级杆质谱检测(高效液相色谱串联质谱法)，标准曲线外标法定量。4试剂和材料
4试剂和材料
除非另有规定，所用试剂均为分析纯。水为GB/T6682规定的一级水。4.1甲醇：色谱纯。
4.2甲醇：分析纯。
4.3氨水：分析纯。
甲酸：色谱纯。
甲酸：分析纯。
4.6二氯甲烷：分析纯。
异辛烷：分析纯。
2%甲酸水溶液：移取2mL甲酸（4.5），用水稀释定容至100mL。4.8E
2%氨水氨化甲醇：移取2mL氨水（4.3），用甲醇稀释定容至100mL。4.9:
1%甲酸水溶液：移取1mL甲酸（4.5），用水稀释定容至100mL。4.10免费标准bzxz.net
GB/T 29664—2013
4.11Strara-X-C固相萃取小柱或相当者：60mg，3mL。使用前，依次用2tmL甲醇和2mL水活化。4.12标准储备液：准确称取烟酸和烟酰胺标准物质各250mg分别置于两个25mL的棕色容量瓶中，用蒸馏水溶解定容，配置成浓度为10mg/mL的标准储备溶液，于4℃～6℃条件下保存。保存期--般不应超过2周。
4.13系列标准溶液
4.13.1系列标准溶液A：首先将两种标准储备液等体积混合，配置成5mg/mL的混合标准溶液，然后用2%甲酸水（4.8）稀释配置成烟酸和烟酰胺浓度均分别为1μg/mL，5产g/mL、10μg/mL50μg/mL100μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的系列标准混合溶液用于液相色谱测试。以上系列标准溶液，均需现用现配。
4.13.2系列标准溶液B：首先将两种标雅储备液等体积混合，配置成5mg/mL的混合标准溶液，然后用2%甲酸水（48）稀释配置成烟酸和烟酰胺浓度均分别为5Hg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L500ug/L、1000ug/L的系列标准混合溶液用于液质联用测试。以上系列标准溶液，均需现用现配。4.140.2产m微孔尼龙滤膜。
4.15标准物质见表1。
表1标准物质英文名称、INCI名称、CAS号、分子式、分子结构式、相对分子质鱼、纯度化合物名称
英文名称
INCI名称
CAS号
分子式
分子结构式
相对分子质量
5仪器和设备
Nicotinic acid
Niacin
59-67-6
C H,NO,
5.1高效液相色谱仪-二极管阵列检测器(高效液相色谱法）。299.0%
烟酰胺
Nicotinamide
Niacinamide
98-92-0
5.2高效液相色谱串联四级杆质谱联用仪(ESI源）（高效液相色谱串联质谱法）。5.3分析天平：感量0.1mg，0.01mg。5.4氮吹仪。
5.5游涡混合器。
5.6超声波清洗器。
5.7离心机：转速不小于5000r/min离心试管容量15mL。5.8移液枪或移液器。
6试样制备
6.1膏霜、乳液、化妆水、洗发水等化妆品样品的制备GB/T29664—2013
6.1.1称取0.2g样品（精确至0.01g)于15mL具寒塑料离心管中，60℃条件下氮吹，尽量除去样品中的水分。向离心管中准确加人4mL2%甲酸水溶液（4.8)，涡旋混合使样品均匀分散后超声15min~30min,向离心管中加人3mL二氯甲烷（4.6),祸旋混合2min，然后于5000 r/min离心5min~20min。
6.1.2准确移取1mL上层溶液过Strara-X-C固相萃取小柱（4.11)，待自然流干后，依次加入1mL1%甲酸水溶液(4.10)和1mL甲(4.2)淋洗柱床，最后添加4mL2%氨水氨化甲醇(4,9)进行洗脱：待自然流干后，吹出柱床内溶液并收集所有流出溶液，氮吹挥干溶剂.准确添加1mL水溶解，祸旋混合1 min，确保瓶内残留物全部溶解后，用0.2μm微孔尼龙滤膜过滤，待测。6.2美容皂等固态基类化妆品样品的制备6.2.1用刮铲或小刀将皂基样品创成碎屑或丝状薄片，刨碎后迅速密封在容器中，并尽快进行称量。称取0.2g（精确至0.01g），于15mL具塞塑料离心管中，先向离心管中准确加人4mL2%甲酸水溶液（4.8）并置于沸水浴中5min~10min使皂基融化，涡旋混合使样品溶解并均勾分散，待冷却，继续向离心管中加人3mL二氛甲烷（4.6），涡旋混合2min后，于5000r/min离心5min~20min。6. 2.2 余下步骤与 6.1. 2 相同。注：由于皂基变成碎屑或薄片时，样品表面积显著增大，皂中的水分会迅速挥发，带来称且误差。因此建议尽盘缩短取皂,碎皂及称量的时间，且实验室湿度高于50%，温度低于25℃。6.3唇套等蜡基化妆品样品的制备6.3. 1称取0.2g样品(精确至0.01g)于15mL具塞塑料离心管中，向离心管中加人2 mL异辛烷（4.7)，涡旋。若样品不能够完全分，需将离心管置于80℃水浴中3min～5min，待样品完全融化后，向离心管中准确加人4mL2%甲酸水溶液（4.8)（80C水浴预热）,涡旋1min后，将离心管重新置于80C水浴平衡5min，取出再涡旋1min。若样品能够完全分散，则无需水浴加热·直接向离心管中准确加人4mL2%甲酸溶液（4.8)（80℃水浴预热），涡旋2min。必要时于5000r/min离心5min~20 min.
6.3.2取1mL下层水相，0.2μm微孔尼龙滤膜（4.14)过滤，待测。如遇千扰，可参照步骤6.1.2对样品进行净化处理。
注：对烟酸、烟酰胺含量超过1%的化妆品样品建议将提取溶液2%甲水溶被的体积增加为8mL，其他条件不变，以避免超出固相萃取小柱的柱负载盘，导致目标物回收率的降低。7分析步骤
7.1高效液相色谱法
7.1.1液相色谱分析参考条件
液相色谱测定的参考条件如下：a）色谱柱：SBAq（或相当者）,1.8μm，3mm×100mmb）柱温：30℃：
c）流动相：A为100%水（含0.1%甲酸）；B为100%甲醇《含0.1%甲酸）；3
GB/T29664—2013
d）流速：0.3mL/min；
检测波长：260nrn；
进样量：2μ
液相色谱分离条件见表2。
时间/min
表2液柏色谱分离条件
流速/(mL/min)
流动相A/%
疏动相 B/%
注1：0~6min为色谱分离过程，6min~9min为洗脱强保留杂质的过程，9min~13min为色谱柱重新平衡过程。
注2：若上述液相色谱条件下遇到于扰，可改用100%水（含0.1%乙酸）为A相重新进行测试。B相相应改为60%甲醇水溶液（含0.1%乙酸）,相应流动相切换时间也需根据情况进行调整。注3：柱的内径和长度及色谱填料粒径可根据色谱分离情况自由选择。7.1.2定性分析
7.1.2定性分析
将在相同的液相色谱条件下获得的样品溶液的液相色谱分离谱图与标准物质的液相色谱分离谱图进行比较，若样品谱图中存在保留时间与某标准物质的保留时间一致的色谱峰，并且其扣除背景后的紫外吸收图谱与该标准物质的紫外吸收图谱一致，则可确认样品中存在该物质。0.1%甲酸为流动相及0.1%乙酸为流动相的标准物质的液相色谱分离谱图分别参见附录A中图A.1及图A.2,标准物质紫外吸收光谱谱图参见附录A中图A.3，实际样品液相色谱分离谱图（0.1%甲酸为流动相）参见附录B中图B.1。
7. 1. 3定量分析
各取1mL系列标准溶液A(4.13.1)过Strara-X-C固相萃取小柱（4.11)，待自然流干后，依次加人1mL.1%甲酸水溶液(4.10)和1mL甲醇（4.2)淋洗柱床，最后添加4mL2%氨水氨化甲醇(4.9）进行洗脱，待自然流干后，吹出柱床内溶液，收集所有流出溶液，氨吹挥干溶剂，准确添加1mL水（80C水浴中预热>定容溶解，涡旋混合1min，确保瓶内残留物全部溶解后，用0.2μm微孔尼龙滤膜过滤，待测。移取上述系列溶液，注人高效液相色谱仪中进行测定，以色谱峰的峰面积对目标化合物的原始浓度制作标准曲线。
样品溶液中烟酸和烟酰胺的含量，用标准曲线外标法确定。化妆品样品中烟酸和烟酰胺的含量则按式（1)进行计算。样品中维生素B，的含显则等于样品中烟酸和烟酰胺的含量之和。（对样品溶液中目标物的含量高于1000μB/mL的样品，为提高定量的准确性，建议减少进样量或适当稀释后进样。）样品中目标物的含量(mg/g)=×V）X10-
.（1)
式中：
GB/T 29664—2013
从标准曲线中计算出的样品溶液中目标物的质量浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；V
按稀释倍数折算的被测样液总体积，单位为毫升（mL）；m称取样品的质量，单位为克(g)。计算结果至少保留两位有效数字。7.1.4回收率和精密度
在添加浓度0.01mg/g～10mg/g的范围内，回收率在80%～100%之间，相对标准偏差为0.2%～6.2%。
7.1.5允许差
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于其算术平均值的10%7.2高效液相色谱串联质谱法
7.2.1液相色谱分离参考条件
液相色谱测定的参考条件如下：a）色谱柱:SB-Aq(或柑当者）,1.8μm,3mm×100mm，柱温：30℃，
流动相：5%甲醇水溶液（含0.05%甲酸）；流速：0.2mL/min；
进样量：2uL，
注：柱的内径和长度及色谱填料粒径可根据色谱分离情况自由选择。7.2.2质谱参考条件
质谱测定的参考条件如下：
电离方式：电喷雾电离，正离子模式，ESI（+）；a
雾化气：氮气，241.325kPa（约合35psi)：干燥气：氮气，流速10L/min，温度：350℃；c）
碰撞气：氨气
毛细管电压：3500V
检测方式：多反应监测(MRM);
其他质谱条件见表3。
表3烟酸和烟酰胺质谱分析参考参数表3烟酸和烟酰胺质谱分析参考参数烟
母离子
碎双电压
定册子离子（碰撞电压）
定性子高子1（碰撞电压）
定性子高子之（碰撞电压）
烟酰胺
GB/T 29664—2013
7.2.3定性分析
在同一色谱/质谱条件下进行标准溶液和样品溶液的测定，如果样品溶液中检出的色谱峰的保留时间与某标准物质色谱峰的保留时间一致，所选择的3对子离子的质荷比也一致，而且样品定性离子的相对丰度与浓度相当标准工作溶液的定性离子的相对丰度相比较，相对偏差不超过表4规定的范围，则可判定样品中存在该物质。标准物质总离子流质谱图和提取离子（定量）质谱图见附录A中图A.1。表4定性确定时相对离子丰度的最大充许偏差相对离子丰度/%
充许的相对循差/%
7.2.4定量分析
>20~50
>10~20
各取1mL系列标准溶液B(4.13.2)过Strara-X-C固相萃取小柱（4.11)，待自然流干后，依次加人1mL1%甲酸水溶液（4.10)和1mL甲醇（4.2)淋洗柱床，最后添加3mL2%氨水氨化甲醇（4.9）进行洗脱，待自然流干后，吹出柱床内溶液并收集所有流出溶液，氮吹挥干溶剂，准确添加1mL水（80C水浴中预热）定容溶解，涡旋混合1min，确保瓶内残留物全部溶解后，用0.2μm微孔尼龙滤膜过滤，待测。移取上述系列溶液，以色谱峰的峰面积对目标化合物的原始浓度制作标准曲线。样品溶液中烟酸和烟酰胺的含鼠，用标准曲线外标法确定。化妆品样品中烟酸和烟酰胺的含量则按公式(2)进行计算。样品中继生素B：的含量则等于样品中烟酸和烟酰胺的含量之和。（对样品溶液中目标物的含量高于1000g/L的样品，为提高定量的推确性，建议减少进样量或适当稀释后进样）样品中目标物的含量..x.（．
式中：
C从标准曲线中计算出的样品溶液中目标物的质量浓度，单位为微克每升（μ/L)；V一-按稀释倍数折算的被测样液总体积，单位为旁升（mL）；m—-称取样品的质量，单位为克（g）。计算结果至少保留两位有效数字。7.2.5回收率和精密度
在添加浓度0.1μg/g～10μg/g的范围内，回收率在80%110%之间，相对标准偏差为0.5%~7%。7.2.6充许差
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于其算术平均值的10%。6
附录A
（资料性录）
烟酸烟酰胺标准物质液相色谱图、紫外吸收光谱图及总离子流质谱图和提取离子（定量）质谱图5
标准物质液相色谱图（0.1%甲酸水为流动相）图A. 1
焖酰喉
GB/T29664—2013
10tfmin
图A.2标准物质液相色谱图（0.1%乙酸水为流动相）GB/T 29664-2013
190210230250270290310330350370390波长/nm
烟酰胺
19021230250270290310330350370390波长/nm
图A.3标准物质紫外吸收光谱图
+TIC（总离子流质谱图）
+MRM 124. 1>79, 9) 烟酸
+MRM 123.1>80. 0)烟酰胺
图A.4标准物质总离子流质谱图和提取离子（定盘）质谱图GB/T29664—2013
实际样品相色谱图
（资料性附录）
附录B
捆瞬胺
实际样品液相色谱图（0.1%甲酸水为流动相）5
GB/T29664-2013
打印日期：2013年11月19日F009A中华人民共和国
国家标准
化妆品中维生素B（烟酸、烟酰胺）的测定高效液相色谱法和
高效液相色谱串联质谱法
CB/T 29654—2013
中国标准出版杜出版发行
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013)北京市西城区三里河北街16号（100045)网址 spe. net. cn
总编室：（010)64275323发行中心：（010)51780235读者服务部：(010)68523946
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销
开本880×12301/16印张1
字数20千字
2013年11月第一版 2013年11月第一次印刷书号：155066-1-47734定价
如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究
举报电话：（010）68510107
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中华人民共和国国家标准
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本标准按照GB/T1.1—2009给出的规测起草。本标准由全国香料香精化妆品标雅化技术委员会（SAC/TC257)归口。GB/T29664—2013
本标准起草单位：大连市产品质量监督检验所（国家日化产品质鼠监督检验中心）、上海市日用化学工业研究所（国家香料香精化妆品质量监督检验中心）、大连标准检测技术研究中心：本标准主要起草人：毛希琴、郑顺利、胡侠，孙稚脊、吴海霞，潘炜、武晓剑、康薇1范围
化妆品中维生素B（烟酸、烟酰胺)的测定高效液相色谱法和
高效液相色谱串联质谱法
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本标准规定了化妆品中维生素B（烟酸、烟酰胺)测定的高效液相色谱法及高效液相色谱串联质谱法。
本标准适用于音霜、乳液、化妆水皂基如美容皂、蜡基如唇膏等化妆品中维生素B（烟酸、烟酰胺）的定量测定，其中高效液相色谱法对烟酸、烟酰胺的检出限均为2g/g，定量限均为6μ/;高效液相色谱串联质谱法对烟酸、烟酰腰的检出限均为100μg/kg，定量限均为300μg/kg。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注目期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理
烟酸、烟酰胺为极性化合物易溶于水相，化妆品中的油溶性成分易溶于有机相，而化妆品中的表面活性剂则富集于有机相与水相界面处。利用水和二氯甲烷(或异辛烷)双液相体系将目标物与化妆品中油溶性成分及表面活性剂初步分离。酸性条件下用反相及强阳离子交换混合型固相萃取材料吸附膏集目标物，脱除干扰物质后，洗脱，定容，用反相高效液相色谱分离，二极管阵列检测器检测（高效液相色谱法)或串联四级杆质谱检测(高效液相色谱串联质谱法)，标准曲线外标法定量。4试剂和材料
4试剂和材料
除非另有规定，所用试剂均为分析纯。水为GB/T6682规定的一级水。4.1甲醇：色谱纯。
4.2甲醇：分析纯。
4.3氨水：分析纯。
甲酸：色谱纯。
甲酸：分析纯。
4.6二氯甲烷：分析纯。
异辛烷：分析纯。
2%甲酸水溶液：移取2mL甲酸（4.5），用水稀释定容至100mL。4.8E
2%氨水氨化甲醇：移取2mL氨水（4.3），用甲醇稀释定容至100mL。4.9:
1%甲酸水溶液：移取1mL甲酸（4.5），用水稀释定容至100mL。4.10免费标准bzxz.net
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4.11Strara-X-C固相萃取小柱或相当者：60mg，3mL。使用前，依次用2tmL甲醇和2mL水活化。4.12标准储备液：准确称取烟酸和烟酰胺标准物质各250mg分别置于两个25mL的棕色容量瓶中，用蒸馏水溶解定容，配置成浓度为10mg/mL的标准储备溶液，于4℃～6℃条件下保存。保存期--般不应超过2周。
4.13系列标准溶液
4.13.1系列标准溶液A：首先将两种标准储备液等体积混合，配置成5mg/mL的混合标准溶液，然后用2%甲酸水（4.8）稀释配置成烟酸和烟酰胺浓度均分别为1μg/mL，5产g/mL、10μg/mL50μg/mL100μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的系列标准混合溶液用于液相色谱测试。以上系列标准溶液，均需现用现配。
4.13.2系列标准溶液B：首先将两种标雅储备液等体积混合，配置成5mg/mL的混合标准溶液，然后用2%甲酸水（48）稀释配置成烟酸和烟酰胺浓度均分别为5Hg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L500ug/L、1000ug/L的系列标准混合溶液用于液质联用测试。以上系列标准溶液，均需现用现配。4.140.2产m微孔尼龙滤膜。
4.15标准物质见表1。
表1标准物质英文名称、INCI名称、CAS号、分子式、分子结构式、相对分子质鱼、纯度化合物名称
英文名称
INCI名称
CAS号
分子式
分子结构式
相对分子质量
5仪器和设备
Nicotinic acid
Niacin
59-67-6
C H,NO,
5.1高效液相色谱仪-二极管阵列检测器(高效液相色谱法）。299.0%
烟酰胺
Nicotinamide
Niacinamide
98-92-0
5.2高效液相色谱串联四级杆质谱联用仪(ESI源）（高效液相色谱串联质谱法）。5.3分析天平：感量0.1mg，0.01mg。5.4氮吹仪。
5.5游涡混合器。
5.6超声波清洗器。
5.7离心机：转速不小于5000r/min离心试管容量15mL。5.8移液枪或移液器。
6试样制备
6.1膏霜、乳液、化妆水、洗发水等化妆品样品的制备GB/T29664—2013
6.1.1称取0.2g样品（精确至0.01g)于15mL具寒塑料离心管中，60℃条件下氮吹，尽量除去样品中的水分。向离心管中准确加人4mL2%甲酸水溶液（4.8)，涡旋混合使样品均匀分散后超声15min~30min,向离心管中加人3mL二氯甲烷（4.6),祸旋混合2min，然后于5000 r/min离心5min~20min。
6.1.2准确移取1mL上层溶液过Strara-X-C固相萃取小柱（4.11)，待自然流干后，依次加入1mL1%甲酸水溶液(4.10)和1mL甲(4.2)淋洗柱床，最后添加4mL2%氨水氨化甲醇(4,9)进行洗脱：待自然流干后，吹出柱床内溶液并收集所有流出溶液，氮吹挥干溶剂.准确添加1mL水溶解，祸旋混合1 min，确保瓶内残留物全部溶解后，用0.2μm微孔尼龙滤膜过滤，待测。6.2美容皂等固态基类化妆品样品的制备6.2.1用刮铲或小刀将皂基样品创成碎屑或丝状薄片，刨碎后迅速密封在容器中，并尽快进行称量。称取0.2g（精确至0.01g），于15mL具塞塑料离心管中，先向离心管中准确加人4mL2%甲酸水溶液（4.8）并置于沸水浴中5min~10min使皂基融化，涡旋混合使样品溶解并均勾分散，待冷却，继续向离心管中加人3mL二氛甲烷（4.6），涡旋混合2min后，于5000r/min离心5min~20min。6. 2.2 余下步骤与 6.1. 2 相同。注：由于皂基变成碎屑或薄片时，样品表面积显著增大，皂中的水分会迅速挥发，带来称且误差。因此建议尽盘缩短取皂,碎皂及称量的时间，且实验室湿度高于50%，温度低于25℃。6.3唇套等蜡基化妆品样品的制备6.3. 1称取0.2g样品(精确至0.01g)于15mL具塞塑料离心管中，向离心管中加人2 mL异辛烷（4.7)，涡旋。若样品不能够完全分，需将离心管置于80℃水浴中3min～5min，待样品完全融化后，向离心管中准确加人4mL2%甲酸水溶液（4.8)（80C水浴预热）,涡旋1min后，将离心管重新置于80C水浴平衡5min，取出再涡旋1min。若样品能够完全分散，则无需水浴加热·直接向离心管中准确加人4mL2%甲酸溶液（4.8)（80℃水浴预热），涡旋2min。必要时于5000r/min离心5min~20 min.
6.3.2取1mL下层水相，0.2μm微孔尼龙滤膜（4.14)过滤，待测。如遇千扰，可参照步骤6.1.2对样品进行净化处理。
注：对烟酸、烟酰胺含量超过1%的化妆品样品建议将提取溶液2%甲水溶被的体积增加为8mL，其他条件不变，以避免超出固相萃取小柱的柱负载盘，导致目标物回收率的降低。7分析步骤
7.1高效液相色谱法
7.1.1液相色谱分析参考条件
液相色谱测定的参考条件如下：a）色谱柱：SBAq（或相当者）,1.8μm，3mm×100mmb）柱温：30℃：
c）流动相：A为100%水（含0.1%甲酸）；B为100%甲醇《含0.1%甲酸）；3
GB/T29664—2013
d）流速：0.3mL/min；
检测波长：260nrn；
进样量：2μ
液相色谱分离条件见表2。
时间/min
表2液柏色谱分离条件
流速/(mL/min)
流动相A/%
疏动相 B/%
注1：0~6min为色谱分离过程，6min~9min为洗脱强保留杂质的过程，9min~13min为色谱柱重新平衡过程。
注2：若上述液相色谱条件下遇到于扰，可改用100%水（含0.1%乙酸）为A相重新进行测试。B相相应改为60%甲醇水溶液（含0.1%乙酸）,相应流动相切换时间也需根据情况进行调整。注3：柱的内径和长度及色谱填料粒径可根据色谱分离情况自由选择。7.1.2定性分析
7.1.2定性分析
将在相同的液相色谱条件下获得的样品溶液的液相色谱分离谱图与标准物质的液相色谱分离谱图进行比较，若样品谱图中存在保留时间与某标准物质的保留时间一致的色谱峰，并且其扣除背景后的紫外吸收图谱与该标准物质的紫外吸收图谱一致，则可确认样品中存在该物质。0.1%甲酸为流动相及0.1%乙酸为流动相的标准物质的液相色谱分离谱图分别参见附录A中图A.1及图A.2,标准物质紫外吸收光谱谱图参见附录A中图A.3，实际样品液相色谱分离谱图（0.1%甲酸为流动相）参见附录B中图B.1。
7. 1. 3定量分析
各取1mL系列标准溶液A(4.13.1)过Strara-X-C固相萃取小柱（4.11)，待自然流干后，依次加人1mL.1%甲酸水溶液(4.10)和1mL甲醇（4.2)淋洗柱床，最后添加4mL2%氨水氨化甲醇(4.9）进行洗脱，待自然流干后，吹出柱床内溶液，收集所有流出溶液，氨吹挥干溶剂，准确添加1mL水（80C水浴中预热>定容溶解，涡旋混合1min，确保瓶内残留物全部溶解后，用0.2μm微孔尼龙滤膜过滤，待测。移取上述系列溶液，注人高效液相色谱仪中进行测定，以色谱峰的峰面积对目标化合物的原始浓度制作标准曲线。
样品溶液中烟酸和烟酰胺的含量，用标准曲线外标法确定。化妆品样品中烟酸和烟酰胺的含量则按式（1)进行计算。样品中维生素B，的含显则等于样品中烟酸和烟酰胺的含量之和。（对样品溶液中目标物的含量高于1000μB/mL的样品，为提高定量的准确性，建议减少进样量或适当稀释后进样。）样品中目标物的含量(mg/g)=×V）X10-
.（1)
式中：
GB/T 29664—2013
从标准曲线中计算出的样品溶液中目标物的质量浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；V
按稀释倍数折算的被测样液总体积，单位为毫升（mL）；m称取样品的质量，单位为克(g)。计算结果至少保留两位有效数字。7.1.4回收率和精密度
在添加浓度0.01mg/g～10mg/g的范围内，回收率在80%～100%之间，相对标准偏差为0.2%～6.2%。
7.1.5允许差
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于其算术平均值的10%7.2高效液相色谱串联质谱法
7.2.1液相色谱分离参考条件
液相色谱测定的参考条件如下：a）色谱柱:SB-Aq(或柑当者）,1.8μm,3mm×100mm，柱温：30℃，
流动相：5%甲醇水溶液（含0.05%甲酸）；流速：0.2mL/min；
进样量：2uL，
注：柱的内径和长度及色谱填料粒径可根据色谱分离情况自由选择。7.2.2质谱参考条件
质谱测定的参考条件如下：
电离方式：电喷雾电离，正离子模式，ESI（+）；a
雾化气：氮气，241.325kPa（约合35psi)：干燥气：氮气，流速10L/min，温度：350℃；c）
碰撞气：氨气
毛细管电压：3500V
检测方式：多反应监测(MRM);
其他质谱条件见表3。
表3烟酸和烟酰胺质谱分析参考参数表3烟酸和烟酰胺质谱分析参考参数烟
母离子
碎双电压
定册子离子（碰撞电压）
定性子高子1（碰撞电压）
定性子高子之（碰撞电压）
烟酰胺
GB/T 29664—2013
7.2.3定性分析
在同一色谱/质谱条件下进行标准溶液和样品溶液的测定，如果样品溶液中检出的色谱峰的保留时间与某标准物质色谱峰的保留时间一致，所选择的3对子离子的质荷比也一致，而且样品定性离子的相对丰度与浓度相当标准工作溶液的定性离子的相对丰度相比较，相对偏差不超过表4规定的范围，则可判定样品中存在该物质。标准物质总离子流质谱图和提取离子（定量）质谱图见附录A中图A.1。表4定性确定时相对离子丰度的最大充许偏差相对离子丰度/%
充许的相对循差/%
7.2.4定量分析
>20~50
>10~20
各取1mL系列标准溶液B(4.13.2)过Strara-X-C固相萃取小柱（4.11)，待自然流干后，依次加人1mL1%甲酸水溶液（4.10)和1mL甲醇（4.2)淋洗柱床，最后添加3mL2%氨水氨化甲醇（4.9）进行洗脱，待自然流干后，吹出柱床内溶液并收集所有流出溶液，氮吹挥干溶剂，准确添加1mL水（80C水浴中预热）定容溶解，涡旋混合1min，确保瓶内残留物全部溶解后，用0.2μm微孔尼龙滤膜过滤，待测。移取上述系列溶液，以色谱峰的峰面积对目标化合物的原始浓度制作标准曲线。样品溶液中烟酸和烟酰胺的含鼠，用标准曲线外标法确定。化妆品样品中烟酸和烟酰胺的含量则按公式(2)进行计算。样品中继生素B：的含量则等于样品中烟酸和烟酰胺的含量之和。（对样品溶液中目标物的含量高于1000g/L的样品，为提高定量的推确性，建议减少进样量或适当稀释后进样）样品中目标物的含量..x.（．
式中：
C从标准曲线中计算出的样品溶液中目标物的质量浓度，单位为微克每升（μ/L)；V一-按稀释倍数折算的被测样液总体积，单位为旁升（mL）；m—-称取样品的质量，单位为克（g）。计算结果至少保留两位有效数字。7.2.5回收率和精密度
在添加浓度0.1μg/g～10μg/g的范围内，回收率在80%110%之间，相对标准偏差为0.5%~7%。7.2.6充许差
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于其算术平均值的10%。6
附录A
（资料性录）
烟酸烟酰胺标准物质液相色谱图、紫外吸收光谱图及总离子流质谱图和提取离子（定量）质谱图5
标准物质液相色谱图（0.1%甲酸水为流动相）图A. 1
焖酰喉
GB/T29664—2013
10tfmin
图A.2标准物质液相色谱图（0.1%乙酸水为流动相）GB/T 29664-2013
190210230250270290310330350370390波长/nm
烟酰胺
19021230250270290310330350370390波长/nm
图A.3标准物质紫外吸收光谱图
+TIC（总离子流质谱图）
+MRM 124. 1>79, 9) 烟酸
+MRM 123.1>80. 0)烟酰胺
图A.4标准物质总离子流质谱图和提取离子（定盘）质谱图GB/T29664—2013
实际样品相色谱图
（资料性附录）
附录B
捆瞬胺
实际样品液相色谱图（0.1%甲酸水为流动相）5
GB/T29664-2013
打印日期：2013年11月19日F009A中华人民共和国
国家标准
化妆品中维生素B（烟酸、烟酰胺）的测定高效液相色谱法和
高效液相色谱串联质谱法
CB/T 29654—2013
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2013年11月第一版 2013年11月第一次印刷书号：155066-1-47734定价
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