GBZ/T 254-2014
基本信息
标准号： GBZ/T 254-2014
中文名称：尿中苯巯基尿酸的高效液相色谱测定方法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准简介
GBZ/T 254-2014 尿中苯巯基尿酸的高效液相色谱测定方法
GBZ/T254-2014
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标准内容
ICS13.100
中华人民共和国国家职业卫生标准GBZ/T254—2014
尿中苯疏基尿酸的高效液相色谱测定方法Determination of S-phenylmercapturic acid in urine by high performanceliquidchromatogrphy
2014-07-23发布
中华人民共和国
国家卫生和计划生育委员会
2014-12-15实施
根据《中华人民共和国职业病防治法》制定本标准本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准起草单位和主要起草人：本标准第3章尿中苯硫基尿酸的高效液相色谱方法：GBZ/T254—2014
主要起草单位：武汉科技大学医学院、湖北中医药大学、鄂州市疾病预防控制中心。主要起草人：宋世震、梅勇、叶玉杰、胡霞敏、叶方立、陈斯琪、姚群峰、谢云、吴三明。本标准第4章尿中苯硫基尿酸的高效液相色谱-质谱方法：主要起草单位：武汉科技大学医学院、武汉大学化学学院、湖北中医药大学主要起草人：宋世震、梅勇、叶玉杰、胡霞敏、叶方立、余琼卫、孙丹陵。I
1范围
尿中苯疏基尿酸的高效液相色谱测定方法本标准规定了尿中苯巯基尿酸浓度的检测方法。本标准适用于职业接触苯作业工人尿中苯巯基尿酸浓度的测定。2规范性引用文件
GBZ/T254—2014
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注H期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GBZ/T173职业卫生生物监测质量保证规范GBZ/T210.5生物材料中化学物质的测定方法第5部分：生物材料中化学物质的测定方法尿中肌酐分光光度测定方法
WS/T97
3尿中苯巯基尿酸的高效液相色谱法3
3.1原理
尿中苯巯基尿酸（S-phenylmercapturicacid，SPMA）经萃取后，经十八烷基硅烷键合硅胶柱（Octadecylsilyl，ODS)柱分离，紫外检测器检测，以SPMA峰保留时间定性，峰高或峰面积定量。3.2仪器
3.2.1高效液相色谱仪，紫外检测器。仪器操作参考条件：
色谱柱：ODS(150mmX4.6mm，5um）：a
保护柱：ODS(10mmX4.6mm，5μm）；b)
流动相：A相：乙腈；B相：乙腈100mL，甲醇24mL，用0.5%三乙胺水溶液（用磷酸调pH=2.16）定容至1000mL，梯度洗脱：0min~~34min用100%B相，34min~41min用A相：B相（10：90），4lmin~49min用100%B相；流速：2.0mL/min；柱温：35℃；
进样量：20μL；
检测波长：205nm。
3.2.2分光光度计。
聚氯乙烯塑料瓶：100mL。
离心机：0r/min5000/min。
具塞离心管：10mL、15mL。
微量注射器：25plk
GBZ/T254—2014bZxz.net
3.3试剂
3.3.1肌酐测定试剂盒（苦味酸分光光度法）。3.3.2
水，双蒸水。
磷酸，分析纯。
乙睛，色谱纯。
甲醇，色谱纯。
盐酸，分析纯。
硫酸溶液，50%（体积分数）。
氢氧化钾（分析纯）溶液，7.8mol/L。3.3.9
萃取液，氯仿：异丙醇=5：1(体积比）。氮气（95%）
标准溶液：精密称取40mgSPMA标准品置于100mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，3.3.11
充分摇勾，此溶液为400mg/LSPMA贮备液，于4℃保存备用，可保存期限30d，临用前用甲醇稀释到所需浓度的标准溶液；或用国家认可的标准溶液配制。3.4样品的采集、运输和保存
用聚乙烯塑料瓶收集接触苯作业的工人班后尿50mL，按100：1的体积比例加入盐酸；另留取5mL不加酸尿置于试管用作尿中肌酐测定。尿样采集后，最好在48h内检测。若需保存尿样，在4℃条件下可保存2周，在一20℃冰箱冷冻可保存4个月。3.5分析步骤
3.5.1按WS/T97尽快测定尿中肌酐浓度。3.5.2样品处理：分析时将尿样从冰箱取出丁室温下解冻，取约5.0mL尿样于10mL具塞离心管中，5000r/min离心15min，取上清液2.0mL于15ml具寒离心管中，加人2.0mL水，涡旋约15s，加0.8mL.硫酸溶液，涡旋约30s，10min内加人0.8mL氢氧化钾溶液，涡旋约30s，加人5.0mL苯取液，盖紧磨口盖，在涡旋混合器上涡旋约50s，4000r/min离心10min，分层清晰后，保留有机相，将上层水相转移至另一15InL离心管中，再加人5.0mL萃取液进行第二次萃取，合并两次举取液，水浴50℃氮气流下挥干，残渣用100μL甲醇涡旋溶解，5000r/min离心10min，取20μL甲醇清液进样测定。3.5.3标准曲线绘制：用甲醇稀释标准溶液成0.0μg/L~1000μg/L苯疏基尿酸标准系列。参照仪器操作条件，将液相色谱仪调节至佳测定状态，进样20L，测定各标准系列。每个浓度重复测定3次。由测得的峰高或峰面积均值对相应的苯基尿酸浓度（ug/L)绘制标准曲线或计算回归方程。3.5.4样品测定：用测定标准系列的操作条件测定处理好的样品和空对照溶液，测得样品的峰高或峰面积值减去空白对照的峰高或峰面积值后，由标准曲线得苯疏基尿酸的浓度（ug/L）。3.6
按式（1)计算尿中苯巯基尿酸的校正浓度：Cg
式中：
尿中苯巯基尿酸浓度，单位为微克每克肌酐（ug/g)；2
.·（1)
3.7说明
测得的尿样中苯巯基尿酸浓度，单位为微克每升（μg/L）；尿中肌酐(Cr)浓度，单位为克每升(g/L)。GBZ/T254—2014
1本法按照GBZ/T210.5的要求进行研制，方法指标符合要求，最低检出浓度为40g/L。3.7.1
2本法批内精密度（相对标准偏差）为2.44%～9.58%，批间精密度（相对标准偏差）为3.75%~3.7.2
9.23%，加标回收率为92.64%~103.66%。3.7.3样品前处理，调节尿样pH<2时，SPMA的提取回收率较高。3.7.4SPMA保留时间为31min左右，检测过程中的质量控制按照GBZ/T173执行。3.7.5
尿中苯疏基尿酸的高效液相色谱-质谱法4
4.1原理
尿中苯基尿酸（S-phenylmercapturicacid，SPMA）经液-液萃取后，经ODS柱分离，质谱检测器检测，以SPMA分子离子峰的保留时间定性，峰高或峰面积定量。4.2仪器
4.2.1分光光度计。
聚氯乙烯塑料瓶：100mL，
4.2.3离心机：0r/min~10000r/min4.2.4具塞离心管：10mL，15mL
高效液相色谱-质谱仪。
仪器操作参考条件：
色谱柱：ODS(150mm×2.0mm，4.6μm）；保护柱：ODS(50mmX2.0mm.1.6μm）；流动相：乙腈：0.3%甲酸25：75；流量：0.2mL/min；
柱温：35℃；
离子源为电喷雾离子源：负电模式：接口电压：4.5kV
脱溶剂管电压：-15V；
模块加热器温度：200℃；
脱溶剂管温度：230℃；
雾化气流：1.5L/min；
定量测定时采用选择离子监控（SIR）模式：m/2384.3试剂
肌酐测定试剂盒（苦味酸分光光度法）；水，双蒸水。
GBZ/T254—2014
乙睛，色谱纯。
甲醇，色谱纯。
5盐酸，分析纯。
4.3.6硫酸（分析纯）溶液，50%（体积分数）。4.3.7氢氧化钾（分析纯）溶液，7.8mol/L4.3.8萃取液，氯仿：异丙醇一5：1（体积比）4.3.9氮气（≥95%）。
4.3.10标准溶液：精密称取40mgSPMA标准品置于100mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，充分摇勾，此溶液为400mg/LSPMA贮备液，于4℃保存备用，可保存期限30d，临用前用甲醇稀释到所需浓度的标准溶液；或用国家认可的标准溶液配制。4.4样品的采集、运输和保存
用聚乙烯塑料瓶收集接触苯作业的工人班后尿50ml，按100：1的体积比例加入盐酸，另留取5mL不加酸尿置于试管用作尿中肌酐测定。尿样采集后，最好在48h内检测。若需保存尿样，在4℃条件下可保存2周，在一20℃冰箱冷冻可保存4个月。4.5分析步骤
4.5.1按WS/T97尽快测定尿中肌酐浓度。4.5.2样品处理：分析时将尿样从冰箱取出于室温下解冻，取约5.0mL尿样于10mL具塞离心管中，5000r/min离心15min，取上清液2.0ml于15mL具寒离心管中，加人2.0mL水，涡旋约15s，加0.8mL硫酸溶液，涡旋约30s,10min内加入0.8mL氢氧化钾溶液，涡旋约30s，加人5.0mL萃取液，盖紧磨口盖，在涡旋混合器上涡旋约50s，4000r/min离心10min，分层清晰后，保留有机相，将上层水相转移至另一15mL离心管中，再加入5.0mL萃取液进行第2次萃取，合并两次萃取液.水浴50℃氮气流下挥干，残渣用100uL甲醇涡旋溶解，5000r/min离心10min，取5l.甲醇上清液进样测定4.5.3标准曲线绘制：用中醇稀释标准溶液成0.0ug/L~320.0ug/L苯疏基尿酸标准系列。参照仪器操作条件，将高效液相色谱质谱仪调节至最佳测定状态，进样5mL，测定各标准系列。每个浓度重复测定3次。由测得的峰高或峰面积均值对相应的苯疏基尿酸浓度（ug/L）绘制标准曲线或计算回归方程。
4.5.4样品测定：用测定标准系列的操作条件测定上述处理好的样品和空白对照溶液·测得样品的峰高或峰面积值减去空白对照的峰高或峰面积值后，由标准曲线得苯巯基尿酸的浓度（μg/L）。4.6计算
按式（2)计算尿中苯统基尿酸的校正浓度：C2
式中：
尿中苯巯基尿酸浓度，单位为微克每克肌酐（ug/g)；测得的尿样中茉疏基尿酸浓度，单位为微克每升（ug/L)；C
c2——尿中肌酐(Cr)浓度，单位为克每升(g/L)。4.7说明
4.7.1在信噪比S/N>1C时，本法的最低检测浓度为10μg/L；在信噪比S/N=3时，最低检出浓度为4
5μg/Le
GB7./T254—2014
2本法批内精密度（相对标准偏差）为1.97%～7.96%，批间精密度（相对标准偏差）为2.72%~4.7.2
8.57%。加标回收率为93.86%~104.33%。4.7.3样品前处理，调节尿样pH<2时，SPMA的提取回收率较高。4.7.4使用0.3%甲酸流动相，SPMA色谱峰出峰时间短，且附近没有杂质峰的干扰。5以SPMA分子离子峰的保留时间定性，本实验条件下，SPMA的保留时间为7.8min左右4.7.5
在接触低浓度苯时，使用高效液相色谱-质谱法检测尿中SPMA。4.7.6
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中华人民共和国国家职业卫生标准GBZ/T254—2014
尿中苯疏基尿酸的高效液相色谱测定方法Determination of S-phenylmercapturic acid in urine by high performanceliquidchromatogrphy
2014-07-23发布
中华人民共和国
国家卫生和计划生育委员会
2014-12-15实施
根据《中华人民共和国职业病防治法》制定本标准本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准起草单位和主要起草人：本标准第3章尿中苯硫基尿酸的高效液相色谱方法：GBZ/T254—2014
主要起草单位：武汉科技大学医学院、湖北中医药大学、鄂州市疾病预防控制中心。主要起草人：宋世震、梅勇、叶玉杰、胡霞敏、叶方立、陈斯琪、姚群峰、谢云、吴三明。本标准第4章尿中苯硫基尿酸的高效液相色谱-质谱方法：主要起草单位：武汉科技大学医学院、武汉大学化学学院、湖北中医药大学主要起草人：宋世震、梅勇、叶玉杰、胡霞敏、叶方立、余琼卫、孙丹陵。I
1范围
尿中苯疏基尿酸的高效液相色谱测定方法本标准规定了尿中苯巯基尿酸浓度的检测方法。本标准适用于职业接触苯作业工人尿中苯巯基尿酸浓度的测定。2规范性引用文件
GBZ/T254—2014
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注H期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GBZ/T173职业卫生生物监测质量保证规范GBZ/T210.5生物材料中化学物质的测定方法第5部分：生物材料中化学物质的测定方法尿中肌酐分光光度测定方法
WS/T97
3尿中苯巯基尿酸的高效液相色谱法3
3.1原理
尿中苯巯基尿酸（S-phenylmercapturicacid，SPMA）经萃取后，经十八烷基硅烷键合硅胶柱（Octadecylsilyl，ODS)柱分离，紫外检测器检测，以SPMA峰保留时间定性，峰高或峰面积定量。3.2仪器
3.2.1高效液相色谱仪，紫外检测器。仪器操作参考条件：
色谱柱：ODS(150mmX4.6mm，5um）：a
保护柱：ODS(10mmX4.6mm，5μm）；b)
流动相：A相：乙腈；B相：乙腈100mL，甲醇24mL，用0.5%三乙胺水溶液（用磷酸调pH=2.16）定容至1000mL，梯度洗脱：0min~~34min用100%B相，34min~41min用A相：B相（10：90），4lmin~49min用100%B相；流速：2.0mL/min；柱温：35℃；
进样量：20μL；
检测波长：205nm。
3.2.2分光光度计。
聚氯乙烯塑料瓶：100mL。
离心机：0r/min5000/min。
具塞离心管：10mL、15mL。
微量注射器：25plk
GBZ/T254—2014bZxz.net
3.3试剂
3.3.1肌酐测定试剂盒（苦味酸分光光度法）。3.3.2
水，双蒸水。
磷酸，分析纯。
乙睛，色谱纯。
甲醇，色谱纯。
盐酸，分析纯。
硫酸溶液，50%（体积分数）。
氢氧化钾（分析纯）溶液，7.8mol/L。3.3.9
萃取液，氯仿：异丙醇=5：1(体积比）。氮气（95%）
标准溶液：精密称取40mgSPMA标准品置于100mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，3.3.11
充分摇勾，此溶液为400mg/LSPMA贮备液，于4℃保存备用，可保存期限30d，临用前用甲醇稀释到所需浓度的标准溶液；或用国家认可的标准溶液配制。3.4样品的采集、运输和保存
用聚乙烯塑料瓶收集接触苯作业的工人班后尿50mL，按100：1的体积比例加入盐酸；另留取5mL不加酸尿置于试管用作尿中肌酐测定。尿样采集后，最好在48h内检测。若需保存尿样，在4℃条件下可保存2周，在一20℃冰箱冷冻可保存4个月。3.5分析步骤
3.5.1按WS/T97尽快测定尿中肌酐浓度。3.5.2样品处理：分析时将尿样从冰箱取出丁室温下解冻，取约5.0mL尿样于10mL具塞离心管中，5000r/min离心15min，取上清液2.0mL于15ml具寒离心管中，加人2.0mL水，涡旋约15s，加0.8mL.硫酸溶液，涡旋约30s，10min内加人0.8mL氢氧化钾溶液，涡旋约30s，加人5.0mL苯取液，盖紧磨口盖，在涡旋混合器上涡旋约50s，4000r/min离心10min，分层清晰后，保留有机相，将上层水相转移至另一15InL离心管中，再加人5.0mL萃取液进行第二次萃取，合并两次举取液，水浴50℃氮气流下挥干，残渣用100μL甲醇涡旋溶解，5000r/min离心10min，取20μL甲醇清液进样测定。3.5.3标准曲线绘制：用甲醇稀释标准溶液成0.0μg/L~1000μg/L苯疏基尿酸标准系列。参照仪器操作条件，将液相色谱仪调节至佳测定状态，进样20L，测定各标准系列。每个浓度重复测定3次。由测得的峰高或峰面积均值对相应的苯基尿酸浓度（ug/L)绘制标准曲线或计算回归方程。3.5.4样品测定：用测定标准系列的操作条件测定处理好的样品和空对照溶液，测得样品的峰高或峰面积值减去空白对照的峰高或峰面积值后，由标准曲线得苯疏基尿酸的浓度（ug/L）。3.6
按式（1)计算尿中苯巯基尿酸的校正浓度：Cg
式中：
尿中苯巯基尿酸浓度，单位为微克每克肌酐（ug/g)；2
.·（1)
3.7说明
测得的尿样中苯巯基尿酸浓度，单位为微克每升（μg/L）；尿中肌酐(Cr)浓度，单位为克每升(g/L)。GBZ/T254—2014
1本法按照GBZ/T210.5的要求进行研制，方法指标符合要求，最低检出浓度为40g/L。3.7.1
2本法批内精密度（相对标准偏差）为2.44%～9.58%，批间精密度（相对标准偏差）为3.75%~3.7.2
9.23%，加标回收率为92.64%~103.66%。3.7.3样品前处理，调节尿样pH<2时，SPMA的提取回收率较高。3.7.4SPMA保留时间为31min左右，检测过程中的质量控制按照GBZ/T173执行。3.7.5
尿中苯疏基尿酸的高效液相色谱-质谱法4
4.1原理
尿中苯基尿酸（S-phenylmercapturicacid，SPMA）经液-液萃取后，经ODS柱分离，质谱检测器检测，以SPMA分子离子峰的保留时间定性，峰高或峰面积定量。4.2仪器
4.2.1分光光度计。
聚氯乙烯塑料瓶：100mL，
4.2.3离心机：0r/min~10000r/min4.2.4具塞离心管：10mL，15mL
高效液相色谱-质谱仪。
仪器操作参考条件：
色谱柱：ODS(150mm×2.0mm，4.6μm）；保护柱：ODS(50mmX2.0mm.1.6μm）；流动相：乙腈：0.3%甲酸25：75；流量：0.2mL/min；
柱温：35℃；
离子源为电喷雾离子源：负电模式：接口电压：4.5kV
脱溶剂管电压：-15V；
模块加热器温度：200℃；
脱溶剂管温度：230℃；
雾化气流：1.5L/min；
定量测定时采用选择离子监控（SIR）模式：m/2384.3试剂
肌酐测定试剂盒（苦味酸分光光度法）；水，双蒸水。
GBZ/T254—2014
乙睛，色谱纯。
甲醇，色谱纯。
5盐酸，分析纯。
4.3.6硫酸（分析纯）溶液，50%（体积分数）。4.3.7氢氧化钾（分析纯）溶液，7.8mol/L4.3.8萃取液，氯仿：异丙醇一5：1（体积比）4.3.9氮气（≥95%）。
4.3.10标准溶液：精密称取40mgSPMA标准品置于100mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，充分摇勾，此溶液为400mg/LSPMA贮备液，于4℃保存备用，可保存期限30d，临用前用甲醇稀释到所需浓度的标准溶液；或用国家认可的标准溶液配制。4.4样品的采集、运输和保存
用聚乙烯塑料瓶收集接触苯作业的工人班后尿50ml，按100：1的体积比例加入盐酸，另留取5mL不加酸尿置于试管用作尿中肌酐测定。尿样采集后，最好在48h内检测。若需保存尿样，在4℃条件下可保存2周，在一20℃冰箱冷冻可保存4个月。4.5分析步骤
4.5.1按WS/T97尽快测定尿中肌酐浓度。4.5.2样品处理：分析时将尿样从冰箱取出于室温下解冻，取约5.0mL尿样于10mL具塞离心管中，5000r/min离心15min，取上清液2.0ml于15mL具寒离心管中，加人2.0mL水，涡旋约15s，加0.8mL硫酸溶液，涡旋约30s,10min内加入0.8mL氢氧化钾溶液，涡旋约30s，加人5.0mL萃取液，盖紧磨口盖，在涡旋混合器上涡旋约50s，4000r/min离心10min，分层清晰后，保留有机相，将上层水相转移至另一15mL离心管中，再加入5.0mL萃取液进行第2次萃取，合并两次萃取液.水浴50℃氮气流下挥干，残渣用100uL甲醇涡旋溶解，5000r/min离心10min，取5l.甲醇上清液进样测定4.5.3标准曲线绘制：用中醇稀释标准溶液成0.0ug/L~320.0ug/L苯疏基尿酸标准系列。参照仪器操作条件，将高效液相色谱质谱仪调节至最佳测定状态，进样5mL，测定各标准系列。每个浓度重复测定3次。由测得的峰高或峰面积均值对相应的苯疏基尿酸浓度（ug/L）绘制标准曲线或计算回归方程。
4.5.4样品测定：用测定标准系列的操作条件测定上述处理好的样品和空白对照溶液·测得样品的峰高或峰面积值减去空白对照的峰高或峰面积值后，由标准曲线得苯巯基尿酸的浓度（μg/L）。4.6计算
按式（2)计算尿中苯统基尿酸的校正浓度：C2
式中：
尿中苯巯基尿酸浓度，单位为微克每克肌酐（ug/g)；测得的尿样中茉疏基尿酸浓度，单位为微克每升（ug/L)；C
c2——尿中肌酐(Cr)浓度，单位为克每升(g/L)。4.7说明
4.7.1在信噪比S/N>1C时，本法的最低检测浓度为10μg/L；在信噪比S/N=3时，最低检出浓度为4
5μg/Le
GB7./T254—2014
2本法批内精密度（相对标准偏差）为1.97%～7.96%，批间精密度（相对标准偏差）为2.72%~4.7.2
8.57%。加标回收率为93.86%~104.33%。4.7.3样品前处理，调节尿样pH<2时，SPMA的提取回收率较高。4.7.4使用0.3%甲酸流动相，SPMA色谱峰出峰时间短，且附近没有杂质峰的干扰。5以SPMA分子离子峰的保留时间定性，本实验条件下，SPMA的保留时间为7.8min左右4.7.5
在接触低浓度苯时，使用高效液相色谱-质谱法检测尿中SPMA。4.7.6
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