SC/T 7016.3-2012 鱼类细胞系 第3部分：草鱼卵巢细胞系(CO) SC/T7016.3-2012 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

ICS65.150
中华人民共和国水产行业标准
SC/T7016.3—2012
鱼类细胞系
第3部分：草鱼卵巢细胞系(CO）Fishcell lines-
Part 3: Grass carp ovary cell line (CO)2012-12-07发布
2013-03-01实施
中华人民共和国农业部
SC/T7016《岔类细胞系》分为下列部分：第1部分：胖头够肌肉细胞系(FHM)；第2部分：草鱼肾细胞系（CIK)：第3部分：草鱼卵巢细胞系(CO)；第4部分：虹鳟性腺细胞系（RTG-2）-第5部分：鲤上皮瘤细胞系（EPC）；第6部分：大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系(CHSE)；一第7部分：棕鲫细胞系（BB)；一%一第8部分：斑点叉尾衡卵巢细胞系（CCO)：：一第9部分：蓝鳃太阳鱼细胞系（BF-2)；一一第10部分：狗鱼性腺细胞系（PG）；第11部分：虹鳟细胞系（R1）；第12部分：鲤白血球细胞系（CLC）：本部分为SC/T7016的第3部分。
本部分按照GB/T1.1给山的规则起草，SC/T7016.3—2012
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承扣识别这些专利的责任。本部分由农业部渔业局提山，
本部分由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。本部分起草单位：全国水产技术摊广总站，深圳出人境检验检疫局。本部分主要起节人：陈爱平、高英、张利峰、徐立蒲、钱冬、刘琪。T
1范围
鱼类细胞系
第3部分：草鱼卵巢细胞系(CO)
SC/T7016.3—2012
本部分描述了草鱼卵巢细胞系(grasscarpovarycell line,(X))的形态、传代培养条件、生长特性、针对部分水生动物病毒的敏感谱及传代细胞的质量控制。本部分适用于对草鱼卵巢细胞系的培养、使川和保藏。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件.仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注口期的引文件，其最新版本(包括所有的修收单)适用于本文件。GB/T6682分析实验牵瓜水规格和试验方法3术语和定义
草鱼卵巢细胞系grasscarpovarycellline,co陈燕新、李正秋1978年从草鱼（Ctenophuryngodonidella）卵巢组织细胞经原代培养、衔生的连续细胞。
4细胞的形态、大小与特性
4.1形态
为L皮样细胞(参见图A.1)，
4.2大小
经细胞实时分析系统测定细胞悬浮后的平均直径约为11.78um，其中最大量细胞的峰值直径约为9. 92 μm(参见 B3. 2),
4.3特性
4.3.1生长特性
贴壁生长。
4.3.2对部分水生动物病病原的敏感性C) 对鲤春病毒血症病毒(Spring viracmia of carp virus,SVCV)、草鱼血病病毒(Grass carp reovinus,GCRV)、鲤呼肠孤病毒(Carp rcovirus),鱼虹彩病毒(Soft shelled turtle iridovirus,STIV)等病毒敏感，接种后的 CPE形态参见附录 A。5主要材料与器设备
应符合GB/T 6682 4T一级水的规定。5.2细胞培养液
主要成分见C.1。
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5.3细胞消化液
主要成分及其含见C.2。
5.4仪器设备
手要包括：
生化培养箱、超净工作台、真空泵和废液瓶等培养细胞所用的设备；一-倒置显微镜：
血球计数板或电子细胞计数仪；一细胞培养瓶、移液器或洗耳球以及移液管等培养绑胞所用的耗材。6细胞培养条件
6.1培养温度
细跑置生化养箱内，在15℃~~28℃下培养，其最适生长温度对25℃，6.2培养液pH
7. 2~7. 6。
7细胞传代与保藏bzxz.net
7.1传代程序
7.1.1吸弃旧培养液
丁超净上作台内无菌环境下吸痒长满单层O的细胞培养瓶中的润培荞綫7.1.2消化细胞
旧细胞消化羧消化分散细胞。淤细胞培养瓶一侧加人细胞消化液，一般在50mL细胞培养瓶中加人5ml.无右或按细胞培养瓶培养面每平方厘米加人0.1 mI.~0.2 ml,加人量必须完全浸没细胞层。贴壁长满的CO)消化时间-般为l.5 min～3 min，细胞开始旱雾状之后吸弃细胞消化液，轻轻拍打培养瓶以分散纠胞，
7.1.3更换细胞培养液与分瓶
将消化液吸弃后,在50 ml,细胞培养瓶中加入10 ml.15 ml,细胞培养液（免（.1),按每瓶 5 mL分成2摘~3瓣，使细胞浓度达到1×10个/mL，分瓶后在25℃下培养，品h内细胞贴壁并长：18 1后能基本长满革晨细胞。不同规格的细胞培养瓶按培养面每乎方厘求巩人0.1mL~-.2m的细胞培养液。
7.1.4细胞的传代周期
细胞长满单层5d后再次传代较好。7.2细胞的保藏
7.2.1保藏条件
7. 2. 1. 1 温度与天数
传代后的)经25℃24h的培养后：移人生化培养箱15℃或20℃保藏。在15下可保存45d，20℃下m保存30d-~45d，
7.2.1.2保藏液pHl
7. 2-7.6.
7.2.2液氨冻存
保种也可在液氮中冻存。细胞冻存液中需要加人10%的二中基亚砜（DMS0)作为保护剂，其胎牛血清浓度应为20%,保种纫胞经程序降温后放入液氮中。2
3传代细胞的质量检查
传代细跑的质最检查包括：
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培养的C)，依4.3.2在一年内至少要进行一欲病毒感谱的检测，其接种后的CPE形态参见附录A；
一在移人生化培养箱的第二天用倒置显微镜观察细胞形态、生长情况.并连续观察7d-~10d：—可根据培养液中酚红的颜色判定培养液的PII是否保持在7.2~~7.6：细胞培养液混浊或出现丝状物时，视为细菌或真菌污染。3
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附录A
资料性附录）
CO及其接种病毒产生的CPE形态图A.1长满单层正常的CO见图A.1
A.2CO在接种：
和鲤形
长满单层正常的CO
RESEARCH
孤病毒后出现的CPD见图A2、图A.3图A2 CO在接种SVCV后出现的PE图A3CO在接种鲤呼肠孤病毒后出现的CPEA3CO在接种STIV和GCRV后出现的CPE见图A.4.图A5图A4CO在接种SIIV后出现的CPE
图A5CO在接种GCRV后出现的CPE
附录B
【资料性附录】
细胞实时分析系统测定的悬浮CO特性细胞实时分析系统(CASYTT)测定的悬浮CO)特性见图 B. 1。
细孢直径（m）
图 B. 1细胞实时分析系统(CASY TT)测定的悬浮 CO 特性最浮CO检测参数
细胞计数：9576个；
平均体积：1110fI.；
体积峰值：511.2I.;
乎均直径：11.78μm；
直径降值：9.92μm。
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C.1细胞培养液
附录C
【规范性附录]
试剂配制
根据Mcdium199培养基（含Earle's平衡盐溶液）说明书要求，在容器中加人适量的水，并将容器放到磁力搅揽拌器上.边搅拌边加人199培养基（含Earle's平衡盐溶液）干粉。当充分搅匀和溶解后，加入10%经56℃30min灭活的胎牛血清，而粉状NaHα)调节培养液的pH至7.2～7.4。尽快过滤除菌，分装后一20℃保存。
细胞消化液
Na.TIP() - 121I20
KH,PO,
1 000 ml
在 1I.水中依饮加人以上试剂,并加人 NaIX),0.4 g--0. 6 g，因 pH-7.4 时 EDTA 摊溶,必须将 pH调至7.48.0。充分搅拌至完全溶解后，过滤除菌并分装一20℃C保存。6
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