SC/T 7016.4-2012 鱼类细胞系 第4部分：虹鳟性腺细胞系(RTG-2) SC/T7016.4-2012 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

ICS65.150
中华人民共和国水产行业标准
SC/T 7016.4—2012
鱼类细胞系
第4部分：虹鳟性腺细胞系(RTG-2)Fish cell lines-
Part 4: Rainbow trout gonad cell line (RTG-2)2012-12-07发布
2013-03-01实施
中华人民共和国农业部发布
SC/T7016《鱼类细胞系分为下列部分：一一第1部分：胖头肌肉细胞系（FHM)；第2部分：草鱼肾细胞系（CIK）；一第3部分：草鱼卵巢细胞系（CO）：--第4部分：虹孵性腺细胞系（RTG2)；一第5部分：鲤上皮瘤细胞系(EPC);-第6部分：大鳞大麻哈鱼肝胎细胞系（CHISE)；--——第7部分：棕鲍细胞系（BB)；--—第8部分：斑点叉尾鲍卵巢细胞系(C));一-第9部分：蓝鳃太阳鱼细胞系（BF2)；第10部分：狗鱼性腺细胞系(PG)；第11部分：虹尊肝细胞系（R1)；第12部分：鲤血球细胞系（（C）：本部分为 SC/T 7016的第 4部分。本部分按照GB/T1.I给出的规则起草。SC/T7016.4—2012
请注意不文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的负任。本部分由表业部渔业局提出。
本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)叶L1。本部分起草单位：全国水产技术推总站、深圳出人境检验检疫局。本部分主要起草人：孙喜模、张妥、高隆英、张利峰、徐立蒲、饯冬、刘琪。T
1范围
鱼类细胞系
第4部分：虹鳟性腺细胞系（RTG-2）SC/T 70 16. 4--2012
本部分描述了虹鳟性腺细跑系（rainbowtroutgonadcelllinc，RTG-2）的形态、传代培养条件生长特性、针对部分鱼类病毒的敏感谐及传代细胞的质量控制。本部分适用于对虹鳟性腺细胞系的培养、使用和保藏。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本义件。GB/T6682分析实验室用永规格和试验方法3术语和定义
虹鳟性腺细胞系rainbowtrout gonad well line,RTG-2Wolf.K&.Quimby，M.C、1962年从虹尊（(mcorhynchusmykiss）性腺性腺经原代培养、衔i生的连续细胞系。
4细胞的形态、大小与特性
4.1形态
为成纤维样细胞（参见图A.1)。4.2大小
经细胞实时分析系统测定细胞悬浮后的平均直径约20.41um，其中最大量细胞的峰值直径约18. 03 μm (参见 B, 2)。
4.3特性
4.3.1生长特性
贴生长。
4.3.2对部分水生动物病病原的敏感性RTG-2对传染性造血器官坏死病毒(Infectiollshacmalopoictic nccrosis,HINV)、病毒性出血性败Ii症(Viral hacmoprhagic scpticacmia，VHSV)、流行性造血器官坏死病毒（Fpizonotic hacmatopoieticnecrosis,EHNV)、马亦大麻哈鱼病毒（Oncorhynchusmasoulvirus，OMV），传染性胰脏坏死病毒（lnlet:tiouspacreatirneerosis,IPNV)等病毒嫩感，接种后的CPE形态参见附录A。5主要材料与仪器设备
应符合GB/T 6682中一级水的规定。5.2细胞培养液
SC/T7016.42012
主要成分见 C. 1。
5.3细胞消化液
主要成分及其含量见C.2。
5.4仪器设备
主要包括：bzxz.net
--生化培养箱、超净工作台、真空案和废液瓶等培养细胞所用的设备—倒置品微镜;
一邮球计数板或电子细胞计数仪：一-细胞培养瓶、移液器或洗耳球以及移液管等培养细胞所用的耗材。6细胞培养条件
6.1培养温度
细胞置生化培养箱内，在15℃～20℃下培养，其最适生长温度为20℃。6.2培养液pH
7. 2-~7. 6。
7细胞传代与保藏
7.1传代程序
7.1.1吸弃旧培养液
在超净工作台内：无菌环娩下啵弃长满单层RT2的细胞培养瓶中的口培养液。7.1.2消化细胞
州细胞消化液消化分散细胞。沿纽胞培养瓶一侧加人细胞消化液，一般在50nI，培养瓶中加,人5mL左右或按细胞培养瓶培养面每半方厘米加入0.1ml.~0.2ml.,孤入量必须完企授没细胞层。贴壁长满的RTG2消化时间一般为1.5min~4min，细胞开始呈雾状之后吸弃细胞消化液，轻轻拍打细胞培养瓶以分散细胞。
7.1.3更换细胞生长液与稀释
将消化液吸弃后.在50ml.培养瓶中加人5mL.或按细胞培养瓶培养面每平方厘米加人0.1ml.~0.2 mL的卵胞牛长液(C.1)
细胞浓度超过1×10个/ml.时，按1：2稀释并分瓶。细胞传代后18h～24h能基本长满培养瓶培养面。RTC-2绑胞的培养浓度较上皮样细胞的培养浓度低近一半，浓度过高易造成细胞形态的收变。
7.1.4细胞的传代周期
细胞长满单层并在.1次传代5d以上才叫再次传代7.2细胞的保藏
7.2.1保藏条件
7.2.1.1温度与天数
传代盾的RTG-2经20℃24h的培养后，可移人生化培养箱15℃或20℃保藏，在15℃下可保存20d~30，20下保存5~20d。
7.2.1.2保藏液pI1
7. 2~7, 6.
7.2.2液氮冻存
保种时也可在液氮中冻存。细胞冻存液中需要加人10%的二用其亚磁（DMSO)作为保护剂，其胎2
牛血清浓度应为20%，
8传代细胞的质量控制
传代细胞的质最检查包括：
SC/ T 70 16. 4—20 12
一-培养的RTG-2，依4.3.2在一年内至少要进行一次病毒敏感谱的检测，其接种后的CPE形态现录A；
--在移人牛化培养箱的第：二天用倒置显微镜观察细胞形态、生长情况并连续观察7t～10d，：-可根据培养液中酚红的颜色判定培养液的p是否保持在7.2～~7.6：一一细胞培养液混浊或出现丝状物时，视为细菌或真菌污染。SC/T7016.42012
（资料性附录】
RTG-2及其接种IHNV等产生的CPE及空斑形态图A.长满单层正常的RrG-2见图A.1。图A.1长满单层正常的KIG-2(左：普通光场;右：相差)A. 2 RTG -2在接种 EHNV 和 OMV后出现的 CPE见图 A 2、图 A. 3。图 A. 2RIG-2 在接种 EHNV后出现的 CPE图 A 3 HIG-2 在接种 UMV后出现的 CPESC/T7016.4—2012
A.3RTG-2在接种IHNV后出现的CPE见图A.4。RTG-2在接种VHSV后产生的空斑见图A.5。
图A.4RTG-2在接种IHNV后
出现的CPE
图A.5RTG-2在接种VHSV后产生的空斑A.4RTG-2接种IPNV后出现的CPE和产生的空斑见图A.6、图A.7。图A.6RTG-2接种IPNV后出现的CPE图A7RTG-2在接种IPNV后
产生的空斑
SC/T 7016.4-2012
附录B
（资料性附录）
细胞实时分析系统测定的悬浮RIG-2特性细胞实时分析系统(CASYIT)测定的悬浮RTG-2特性B.1
见图 B. 1。
Agysysrhw
细胞直(μm）
图B.1细胞实时分析系统(CASYTT)测定的悬浮RIG-2特性B.2悬浮RTG-2检测参数
细胞计数:2314 2个；
平-均休积：5780fL;
体积峰值：3067L：
平均直径：20.41m；
直径峰值：18.03mm。
C.1培养液
附录C
(规范性附录)
试剂配制
SC/T 7016.4-2012
根据MEM培养基说明书要求，在容器中册人适量的一级水，并将穿器放到磁力搅拌器上，边搅料边奶人MEM增养基+粉。当充分搅匀和游解后，加入10%经56℃30tnin灭活的胎牛血清。用NaHC()粉末调节培养液的pII至7.2~7.6。尽快过滤除菌，分装后-20C保存。C.2细胞消化液
NagP, 12z
1000mL
在1L水中顺序加人以上试剂，并加入NalICX)0.4g~0.6g。因pH7.4时EDTA难率，必须将pH调至7.1~-8.0。充分搅拌至完全溶解后，过滤除菌并分装，20℃保存。
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