SC/T 7216-2012
基本信息
标准号： SC/T 7216-2012
中文名称：鱼类病毒性神经坏死病 VNN 诊断技术规程
标准类别：水产行业标准(SC)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
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标准简介
SC/T 7216-2012 鱼类病毒性神经坏死病 VNN 诊断技术规程
SC/T7216-2012
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标准内容
ICS65.150
中华人民共和国水产行业标准
SC/T7216—2012
鱼类病毒性神经坏死病(VNN
诊断技术规程
Diagnostie protocol for fish viral nervous necrosis2012-12-07发布
2013-03-01实施
中华人民共和国农业部
本标准按照GB/I1.1给出的规则起草，SC/T7216—2012
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由农业部渔业局提出。
本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)山口。本标准起草单位：全国水产技术推总站、北京出入境验检疫局、北京市水产技术推广站、深圳山人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、厦门山人境检验检疫局。本标滩主要起草人：陈爱平，张利峰、王姝、高隆英、江育林、陈信忠、朱泽闻、景宏丽。T
1范围
SC/T7216—2012
鱼类病毒性神经坏死病【VNN)诊断技术规程本标准规定了病毒性神经坏死病的病理检查、病毒分离、病毒鉴定方法以及结果综介判定本标准适用于色类的病毒性神经坏死病的流行病学调查、诊断、检疫和疫情监测2规范性引用文件
下列文件对丁本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注期的版本适用于本文件。凡是不注尺期的引用文件，其最新版本(包括所有的修单)适用十本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出人境动物检疫采样
3缩略语
下列缩略语适用十本文件。
VNN(Viral jervous necrasis)：病毒性神经坏死病CPE(Cytopathiceffeet)：细胞病变效应RT-PCR(Reverse-transcriptionpolyierasechain reaclion)：逆转录聚合酶链式反应FITC(Fluorescein isothiocyanate）：异硫缸酸荧光素C值（Cycle threshold)：荧光信号达到设定的阈值所经厉的扩增循环次数SSN-1(Striped snakehead celi line)：条纹月鳕细胞系E11:SSN-1克隆细胞系
FAM(Carbaxyfluorescein)：羧基荧光素TAMRA(Carboxytetramethylrhodarrine)：羧基四甲基罗丹明[IRP(HorseradishPeroxidase】：辣根过氧化物酶DAB（3,3°Diaminobenzidine tetrahydrochloride);3,3'-二氨基联苯胺叫盐酸盐4器和设备
主要仪器和设备包括：
a）荧光定量PCR仪：
b）PCR仪；
高速冷冻离心机；
d）电泳仪；
凝胶成像分析系统或紫外检测仪；f)
微量可调移液器：
荧光显微镜：
倒置显微镜；
组织切片机；
生化培养箱：
k）超净工作台：
酶标仪。
SC/T 7216—2012
5试剂和材料
5.1实验用水应符个GB/T6682中一级水的要求，用-RNA提取及RT-PCR实验的水应进行DEPC处理：
5.2所有实验H试剂均为分析纯。Trizol、Ty酶、逆转录酶、RNa:抑制剂.dVTPs(含dATr、dUTPlCTP、dGTP)等核酸提取试剂、RTPCR及荧光RT-PCR所需试剂可选川专业试剂公司提供的商品化试剂及试剂盒
5.3VNV病毒参考：由农业部指定的动物病原微生物菌（毒）种保藏机构提供，5. 4 SSN1 细胞系或 E-11 细胞系,5.5免抗-VNN病毒血清巾国家指定机构提供。5.6FITC标记的羊抗兔IgG抗体以及生物素标记的羊抗免IgG抗体：5.7RTPCR物：
VNN-R3:5'-XGA GIC- AAC -ACG-GGT- GAA GA 3'VNN-F2.5'- (XT GTC AGT-CAF-GTG-TCG CT 3'5.8荧光RT-PCR的引物：
VERYF:5'-GCA-CCT-(GT-CGG-GAA: AGG AG 3VERYR:5* GAC ACA GCA CTG-ACA-T- TGA-3*;探针: 5'-{FAMCGT-CAC-CIG GTC GG- TGA TAC TCX IGT 3'(IAMRA)。5.9Davidson'sAFA固定液（参见A.1)。5.10胰蛋白酶一-EDTA混合消化液（参见A.2)。5.11细胞培养液（参见A.3)，
5.12PBS(参见A.4)
5.13 PIBST(参见 A.5)
5. 14 TBS(参见 A. 6)。
TBE中泳缓冲液（参见A.7)。
6病理检查
6.1取样
活体解剖取鱼类的眼和脑
6.2固定
迅速将组织切成厚度不超过3mm的组织块，用DavidsunsAFA固定液固定21以上:，根据组织块人小，固定时间可适当调整或放置过夜。固定后，样品放在70%乙悼中保存。6.3脱水、包埋和切片
固定好的组织块用水充分洗涤，按下列程序处理：70%乙醇（60min）-85%乙醇（60min）→95%乙醇（60min）→无水乙醇1（3)min）-无水乙醇Ⅱ（30min）→二巾苯+无水乙醇（体积比1：1）（30min）→二中苯「（3min）→二甲苯Ⅱ（3)min）→二装十石蜡（休积比1：1)（15min)→右蜡I（15min)→有蜡Ⅱ（1min)→蜡包埋→切片根据组织块人小和种类,各步时间作适当调整)。切片厚度不超过6m。
6.4切片处理染色
一苯(5 min)→苯一无水乙醇(体积比 1：1)（3 min)*元水乙醇(3 min)+95 %乙醇(3min）+85%乙醇(3min）70%乙醇(3min)→燕馏水(5min)→亦木素(60 in)→缓慢水流冲洗(32
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min~5min）→伊红（5min）→蒸馏水（5min）→85%乙醇（5min）>95%乙醇（5min）→无水乙醇I（5min)→无水乙醇Ⅱ（5tnin）→二甲苯十无水乙醇（体积比1：1)（5min）→二甲苯I（5min）→：4苯Ⅱ(5 tmin)→中性树脂封片。
6.5病理检查结果判定
用普通显微镜观察，如果视网膜，脑和脊索等神经组织出现明显的空泡化和坏死病变，判定为VNN可疑。
7病毒分离
7.1采样
取类的脑和眼，鱼苗及较小的仔鱼用整条鱼。取样数量按期GB/T18088的规定。7.2样品处理
先用组织研磨器将样品勾浆成糊状。再按1：10的最终稀释度重悬于培养液中。如果在匀浆前未用抗菌素处理过样品，则须将样品匀浆后再悬浮于含有1000IU/mL青索和1000μg/ml链素的培养液中，于15℃下孵育2h～4h或4℃下孵育6h~-24t。7000r/min离心15min：收集上清液。7.3细胞培养和观察
7.3.1对1：10的纠织匀浆上清液冉作两欲10倍稀释，然后将1：10、1；100和1：1000稀释度的上清被分别接种到2块牛.长24h内的96孔板 SSN1或E-11细胞单层中，每孔最多接种 100μ1.稀释液。设2个阳性对照（接种VNN病毒参考株)和2个窄白刘照(末接种病毒的網胞）。7.3.215%~20%吸附0.5h~1h后，加人含5%胎牛血清的细胞培养液。1述2块细胞培养板分别置18℃～20℃和24℃~26℃生化培养箱中培养。7.3.3每天用显微镜观察细胞变化.连续观察10l。阳性对照出现明显的CPE，空对照细胞生长正常，实验结果有效：当待恼样品细胞培养物出现CPE时，立即进行病声鉴定。如果10d店仍未出现CPE.言传次，
7.3.4将需传代的细胞培养物冻融1次，5000r/min离心15min，收集t清液，接种于新的SSN1或E-11单层细胞，再培养观察10d。术出现CPE的样品可判定为阴性，出现CPE者应作进-步鉴定。8病毒鉴定方法
8.1免疫荧光
8.1.1样品处理：7.3的细胞培养样品，弃培养液，用PBS洗涤1次，中醇固定10min.白然风十。临床组织样品制作冰冻切片，再而冷丙酮固定。8.1.2加人免抗-VNN病毒血清（适当稀释度）37℃湿盒中作用30min.用PBST洗涤4次，8.1.3加人FITC标记的羊抗免IgG抗体，37℃作用30nin，用PBST洗涤。8.1.4在荧光显微镜下观察。受VNN感染的缅胞或脑、脊索和视网膜组织可以观察到特异性的荧光.无特异性荧光的样品VNN为阴性。8.2免疫组织化学
8.2.1对已经用10%福尔马林固定了的样品，要去掉蜡，将切片再水化，8.2.2用3%H202在室温孵育20i.消除内源性过氧化物酶。8.2.3把切片用PBS洗5ming
8.2.4用含有0.1%胰白酶和0.1%氯化钙的Tris缀冲液37%孵育30rnin。8.2.5把切片用PBS洗3次。
8.2.6在每块切片.上加人含5%小牛血清白蛋（RSA）的TS封闭，室温孵育20min，3
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8.2.7除去多余的封闭液。
8.2.8加入有2.5%BSA的兔抗NNV病毒血消稀释液.37%湿盒中孵育60mlin8. 2. 9用PEST洗涤2次,每次 3 min。8.2. 10而 I35洗 3饮.每饮 3min。8.2.11滴加FIRP标记的羊抗兔lg抗体，37℃孵育30min，而T3S洗涤3次，每次3inin8.2.12加入底物DAB室激作用20min。8.2.13蒸馅水洗涤5min
8.2.14Harris氏苏木素复染 30 s,自来水冲洗，用廿油明胶封片。8.2.15显微镜观察，VNN感染的组织被染成棕色，可判断为阳性。8.3RT-ICR方法
8.3.1样品处理
细胞培养样品，取150μL出现CPE的细胞培养物于1.5mL离心管中；对组织样品，无临床症状鱼类取5尾～10尾鱼的脑和眼，即处理或冻存备用。将这些组织匀浆后取:0mg~-100mg于1.5mL离心管中。实验须设立阳性对照、阴性对照和空白对照。用VNN病毒核酸作为阳性对照，用术感染VNN的鱼正常红织作为阴性对照，用等体积的DEPC处理水代替模板作为空口对照，8.3.2核酸提取
8.3.2.1每管加人600l.裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200ml一份样本换用个吸头，再加入200L氯仿，混句器上娠荡混匀58（不能过于强烈以免产生乳化层，也可以用手倒混句)，于4℃.12000r/min离心15 min。8.3.2.2取与8.3.2.1相同数量灭菌的l.Inl,Eppcndorf管,加人500μL异丙两醇（-20℃冷）,做标记。吸取8.3.2、1各管中的上清液转移至相应的管中，上清液成至少吸取500ul，不能吸出中问层，颠倒混勾。
8.3.2.3-4℃12000r/min离心15rin(Eppendorl管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置破水纸上，新+液体（不同样品领在吸水纸不同地方沾）：加人60μ75%乙醇，颠倒洗涤。
8.3.2.4丁1°、12000r/min离心10minEppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）小心倒去上清，倒胃丁吸水纸上，尽量沾十液休（不同样品须在吸水不同地方沾下）。8.3.2.54000r/min离心10s(Ependorf管：H口保持朝离心机转轴方i放置）.将管整上的残余液体甩到管底部，小心倒去「清，用微员加样器将其吸十，一份样本换用一个吸头，吸买不要碰到有沉症一面,室渊下燥 3 i,不能过 」下燥,以免 RNA 不溶,8.3.2.6加人11叫.LEPr水,轻轻混勾,溶解管壁上的RNA,2000 r/mrin离心5 s,冰上保存备用。提取的RVA须在2h内进行PCR扩增。若需长期保存，须放置在-70℃冰箱内。8.3.3反应体系
深用50叫反应体系，在PCR管中依次加人DI1C处理水19.5μI5×逆转录酶缓冲液10uL，引物 VNN-R3 和 VNN-F2(40 μmol/1.)各1 μI., MgClz(25 nmol/L)5μl-dNTPs(101nol/L) 1 μL,逆转录酶（5U/μL)μLRNase抑剂(20J/uL)0.5μDNA聚合悔(5/)1L.模板10μl8. 3. 4 RT - PCR
将加好样的IR反应管放人PR仪。反应参数设置为42℃30nin.95℃:5i，然后954s、55%408.72℃40s循环35次，最后72℃延件5min，1℃保存。8.3.5电泳
用TTE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖平板，加溴化<锭（A.10）或其他核酸染色剂。将6.样4
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品和2μI.样品缓冲液混合后加人样品孔，设立.DNAMarkcr作对照。紫外检测仪下观察结果。8. 3. 6 RT - PCR 结果判定
阳性对照在421ht~430bp位置出现一条单的核酸条带（见附录B），阴性对照和空白对照没有该核酸带，实验结果成立：待测样品在421bp~～~430bp位置出现核酸条带者为阳性；无带或带的大小不是421hp~430 bp的样品为阴性。8.4实时荧光RT-PCR方法
8.4.1样品处理和RNA提取
按8.3给出的方法迹行
8.4.2反应体系
采用 50 aL反应体系。在荧光 PCR管中依次加人 DFPC处理水 18.5 ml,5×逆转录海缓冲10μL，正向引物VERYF、反向号[物VERYR和探针（40μumul/1.)各1ml，MgCl（25mnl/1.）5μLdN'IPs (10 mmol/L) 1 μL,逆转录酶(5 U/ μL)I μL,RNase 抑制剂(20 U/μL)0. 5 μl,DNA 聚合酶(5U/μL)1μ.模板10mL。
8. 4. 3 荧光 RT-ICR
将PCR管置于荧光定量PCR仪。反应参数设置为 42℃45min,95℃10min,1个循环;95:10 s5840s.40个循环。收集FAM荧光，观察结果。8.4.4荧光RT-PCR结果判定
检测样品无C,值并且无增曲线时.即判定VNN阴性；检测样品的（C.值小于或等于30时，且出现典型的增曲线，即判定VNN阳性；检测样品的C,值大于30时，应重新进行检测。重新检测无C,值者为 VNN阴性，则为 VNN阳性。
9结果综合判定
9.1样品鱼满足以下之-的为病毒性神经坏死病可疑病例有临床症状；
显微观察有空泡病变；
细胞分离病毒出现CPE；免费标准bzxz.net
免疫荧光或免疫组织化学；
RTICR或实时荧光RT-PCR中在何-种检测为阳性。9.2有临床症状或有病理变化(参见附录3)的鱼的组织器官，直接采用免疫荧光或免疫组织化学RT-[CR或实时荧光RTPCR进行检测。如果使用其中一种方法出现阳性，即可判定为病毒性神经坏死病。
9.3无临床症状的色，如果用细胞分离病毒、免疫荧光或免疫组织化学、RT-PCR或实时炭光RTPCR中任何俩种不网方法检测结果为阳性，确诊为病毒性神经坏死病毒阳性。5
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A. 1 Davidsun's AFA固定液
37%中醛
9%%乙醇
冰醋酸
蒸馏水
220 rnL
115 mL
A.2胰蛋白酶—EDTA混合消化液
氯化钠(NaCl.分析纯）
氛化钾（KC1.分析纯）
磷殷二氢钾(KH,P)：分析纯）
磷酸氢二铆（KHPO，分析纯）
乙-胺四乙酸(ELTA，分析纯）
胰酶（分析纯）
双蒸水
过滤除菌后分装备所。
A.3细胞培养液
（资料性附录】
试剂配制
100 nL
1.15培养基（含Eagles），按说明书的要求配制。然后，加人10%的胎牛l清，抽滤除闲，4℃保存。在细胞培养板中使用时，加人过滤除菌的TIEPES,使其在培养液中的终浓度为0.02mol/LA.4PBS（磷酸缓冲盐水）
磷酸氨二钳(Na,HHP)）
磷酸二氧钾(KH:PO)）
氯化钠(Nac1)
氯化钾（KC1)
先加适量双蒸水，完个溶解后月双蒸水定容至1000mL，调整II至7.4，A.5PBST（磷酸缓冲盐水—吐温）1 000 ml, PBs 中加人 0, 5 ml.叶温-80(Tween80).混匀。A. 6 TBS (Tr-is Buffered Saline)Tris
氯化钠
先加适量蒸馏水，完全溶解后用蒸馏水定容举1000ml。调整pH到9.0。再加人0.5mL吐温20,混勾。室川保存3个,4℃可保存更久A.7TBE电泳缓冲液(5X浓缩液）
先加适量蒸馏水，完全溶解后切蒸馏水定容牟1000ml。用5tmoL/1.的盐酸调到pII8.0。6
B溴化乙锭(EthidiumBronnide,EB)而灭菌蒸馏水配制成10mg/mL的浓缩液。用时每100mL琼脂中加5μLSC/T 7216—2012
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附录R
【资料性附录】
病毒性神经坏死病临床症状和病理变化病毒性神经坏死病又称为病毒性脑病和视网膜病，是一种严重危害海水鱼类鱼苗的病毒性疾病。病原为病毒性神经环死病毒(Viral nervousnecrosisvirus，VNNV)，属野山村病毒科乙型野田村病毒属成员。
其临床症状为一系列与神经有关的分常表现。负放具不正常的螺旋状或旋转式游动或静正时腹部朝上，月爪于触病鱼，病鱼会立即游动等现象，且鱼体体色异常（苍白）。不同种类的免临床症状不同、有的色会出现缴过度膨胀，有的病鱼厌食、消瘦等。发病严重的鱼前伴随着极高的死亡率，最常见的病理变化是中枢神经纠织空泡化，通常出现在视网膜中心层，损伤视网膜。多数种类的仙郡会山现神经性坏死。
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鱼类病毒性神经坏死病(VNN
诊断技术规程
Diagnostie protocol for fish viral nervous necrosis2012-12-07发布
2013-03-01实施
中华人民共和国农业部
本标准按照GB/I1.1给出的规则起草，SC/T7216—2012
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由农业部渔业局提出。
本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)山口。本标准起草单位：全国水产技术推总站、北京出入境验检疫局、北京市水产技术推广站、深圳山人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、厦门山人境检验检疫局。本标滩主要起草人：陈爱平，张利峰、王姝、高隆英、江育林、陈信忠、朱泽闻、景宏丽。T
1范围
SC/T7216—2012
鱼类病毒性神经坏死病【VNN)诊断技术规程本标准规定了病毒性神经坏死病的病理检查、病毒分离、病毒鉴定方法以及结果综介判定本标准适用于色类的病毒性神经坏死病的流行病学调查、诊断、检疫和疫情监测2规范性引用文件
下列文件对丁本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注期的版本适用于本文件。凡是不注尺期的引用文件，其最新版本(包括所有的修单)适用十本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出人境动物检疫采样
3缩略语
下列缩略语适用十本文件。
VNN(Viral jervous necrasis)：病毒性神经坏死病CPE(Cytopathiceffeet)：细胞病变效应RT-PCR(Reverse-transcriptionpolyierasechain reaclion)：逆转录聚合酶链式反应FITC(Fluorescein isothiocyanate）：异硫缸酸荧光素C值（Cycle threshold)：荧光信号达到设定的阈值所经厉的扩增循环次数SSN-1(Striped snakehead celi line)：条纹月鳕细胞系E11:SSN-1克隆细胞系
FAM(Carbaxyfluorescein)：羧基荧光素TAMRA(Carboxytetramethylrhodarrine)：羧基四甲基罗丹明[IRP(HorseradishPeroxidase】：辣根过氧化物酶DAB（3,3°Diaminobenzidine tetrahydrochloride);3,3'-二氨基联苯胺叫盐酸盐4器和设备
主要仪器和设备包括：
a）荧光定量PCR仪：
b）PCR仪；
高速冷冻离心机；
d）电泳仪；
凝胶成像分析系统或紫外检测仪；f)
微量可调移液器：
荧光显微镜：
倒置显微镜；
组织切片机；
生化培养箱：
k）超净工作台：
酶标仪。
SC/T 7216—2012
5试剂和材料
5.1实验用水应符个GB/T6682中一级水的要求，用-RNA提取及RT-PCR实验的水应进行DEPC处理：
5.2所有实验H试剂均为分析纯。Trizol、Ty酶、逆转录酶、RNa:抑制剂.dVTPs(含dATr、dUTPlCTP、dGTP)等核酸提取试剂、RTPCR及荧光RT-PCR所需试剂可选川专业试剂公司提供的商品化试剂及试剂盒
5.3VNV病毒参考：由农业部指定的动物病原微生物菌（毒）种保藏机构提供，5. 4 SSN1 细胞系或 E-11 细胞系,5.5免抗-VNN病毒血清巾国家指定机构提供。5.6FITC标记的羊抗兔IgG抗体以及生物素标记的羊抗免IgG抗体：5.7RTPCR物：
VNN-R3:5'-XGA GIC- AAC -ACG-GGT- GAA GA 3'VNN-F2.5'- (XT GTC AGT-CAF-GTG-TCG CT 3'5.8荧光RT-PCR的引物：
VERYF:5'-GCA-CCT-(GT-CGG-GAA: AGG AG 3VERYR:5* GAC ACA GCA CTG-ACA-T- TGA-3*;探针: 5'-{FAMCGT-CAC-CIG GTC GG- TGA TAC TCX IGT 3'(IAMRA)。5.9Davidson'sAFA固定液（参见A.1)。5.10胰蛋白酶一-EDTA混合消化液（参见A.2)。5.11细胞培养液（参见A.3)，
5.12PBS(参见A.4)
5.13 PIBST(参见 A.5)
5. 14 TBS(参见 A. 6)。
TBE中泳缓冲液（参见A.7)。
6病理检查
6.1取样
活体解剖取鱼类的眼和脑
6.2固定
迅速将组织切成厚度不超过3mm的组织块，用DavidsunsAFA固定液固定21以上:，根据组织块人小，固定时间可适当调整或放置过夜。固定后，样品放在70%乙悼中保存。6.3脱水、包埋和切片
固定好的组织块用水充分洗涤，按下列程序处理：70%乙醇（60min）-85%乙醇（60min）→95%乙醇（60min）→无水乙醇1（3)min）-无水乙醇Ⅱ（30min）→二巾苯+无水乙醇（体积比1：1）（30min）→二中苯「（3min）→二甲苯Ⅱ（3)min）→二装十石蜡（休积比1：1)（15min)→右蜡I（15min)→有蜡Ⅱ（1min)→蜡包埋→切片根据组织块人小和种类,各步时间作适当调整)。切片厚度不超过6m。
6.4切片处理染色
一苯(5 min)→苯一无水乙醇(体积比 1：1)（3 min)*元水乙醇(3 min)+95 %乙醇(3min）+85%乙醇(3min）70%乙醇(3min)→燕馏水(5min)→亦木素(60 in)→缓慢水流冲洗(32
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min~5min）→伊红（5min）→蒸馏水（5min）→85%乙醇（5min）>95%乙醇（5min）→无水乙醇I（5min)→无水乙醇Ⅱ（5tnin）→二甲苯十无水乙醇（体积比1：1)（5min）→二甲苯I（5min）→：4苯Ⅱ(5 tmin)→中性树脂封片。
6.5病理检查结果判定
用普通显微镜观察，如果视网膜，脑和脊索等神经组织出现明显的空泡化和坏死病变，判定为VNN可疑。
7病毒分离
7.1采样
取类的脑和眼，鱼苗及较小的仔鱼用整条鱼。取样数量按期GB/T18088的规定。7.2样品处理
先用组织研磨器将样品勾浆成糊状。再按1：10的最终稀释度重悬于培养液中。如果在匀浆前未用抗菌素处理过样品，则须将样品匀浆后再悬浮于含有1000IU/mL青索和1000μg/ml链素的培养液中，于15℃下孵育2h～4h或4℃下孵育6h~-24t。7000r/min离心15min：收集上清液。7.3细胞培养和观察
7.3.1对1：10的纠织匀浆上清液冉作两欲10倍稀释，然后将1：10、1；100和1：1000稀释度的上清被分别接种到2块牛.长24h内的96孔板 SSN1或E-11细胞单层中，每孔最多接种 100μ1.稀释液。设2个阳性对照（接种VNN病毒参考株)和2个窄白刘照(末接种病毒的網胞）。7.3.215%~20%吸附0.5h~1h后，加人含5%胎牛血清的细胞培养液。1述2块细胞培养板分别置18℃～20℃和24℃~26℃生化培养箱中培养。7.3.3每天用显微镜观察细胞变化.连续观察10l。阳性对照出现明显的CPE，空对照细胞生长正常，实验结果有效：当待恼样品细胞培养物出现CPE时，立即进行病声鉴定。如果10d店仍未出现CPE.言传次，
7.3.4将需传代的细胞培养物冻融1次，5000r/min离心15min，收集t清液，接种于新的SSN1或E-11单层细胞，再培养观察10d。术出现CPE的样品可判定为阴性，出现CPE者应作进-步鉴定。8病毒鉴定方法
8.1免疫荧光
8.1.1样品处理：7.3的细胞培养样品，弃培养液，用PBS洗涤1次，中醇固定10min.白然风十。临床组织样品制作冰冻切片，再而冷丙酮固定。8.1.2加人免抗-VNN病毒血清（适当稀释度）37℃湿盒中作用30min.用PBST洗涤4次，8.1.3加人FITC标记的羊抗免IgG抗体，37℃作用30nin，用PBST洗涤。8.1.4在荧光显微镜下观察。受VNN感染的缅胞或脑、脊索和视网膜组织可以观察到特异性的荧光.无特异性荧光的样品VNN为阴性。8.2免疫组织化学
8.2.1对已经用10%福尔马林固定了的样品，要去掉蜡，将切片再水化，8.2.2用3%H202在室温孵育20i.消除内源性过氧化物酶。8.2.3把切片用PBS洗5ming
8.2.4用含有0.1%胰白酶和0.1%氯化钙的Tris缀冲液37%孵育30rnin。8.2.5把切片用PBS洗3次。
8.2.6在每块切片.上加人含5%小牛血清白蛋（RSA）的TS封闭，室温孵育20min，3
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8.2.7除去多余的封闭液。
8.2.8加入有2.5%BSA的兔抗NNV病毒血消稀释液.37%湿盒中孵育60mlin8. 2. 9用PEST洗涤2次,每次 3 min。8.2. 10而 I35洗 3饮.每饮 3min。8.2.11滴加FIRP标记的羊抗兔lg抗体，37℃孵育30min，而T3S洗涤3次，每次3inin8.2.12加入底物DAB室激作用20min。8.2.13蒸馅水洗涤5min
8.2.14Harris氏苏木素复染 30 s,自来水冲洗，用廿油明胶封片。8.2.15显微镜观察，VNN感染的组织被染成棕色，可判断为阳性。8.3RT-ICR方法
8.3.1样品处理
细胞培养样品，取150μL出现CPE的细胞培养物于1.5mL离心管中；对组织样品，无临床症状鱼类取5尾～10尾鱼的脑和眼，即处理或冻存备用。将这些组织匀浆后取:0mg~-100mg于1.5mL离心管中。实验须设立阳性对照、阴性对照和空白对照。用VNN病毒核酸作为阳性对照，用术感染VNN的鱼正常红织作为阴性对照，用等体积的DEPC处理水代替模板作为空口对照，8.3.2核酸提取
8.3.2.1每管加人600l.裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200ml一份样本换用个吸头，再加入200L氯仿，混句器上娠荡混匀58（不能过于强烈以免产生乳化层，也可以用手倒混句)，于4℃.12000r/min离心15 min。8.3.2.2取与8.3.2.1相同数量灭菌的l.Inl,Eppcndorf管,加人500μL异丙两醇（-20℃冷）,做标记。吸取8.3.2、1各管中的上清液转移至相应的管中，上清液成至少吸取500ul，不能吸出中问层，颠倒混勾。
8.3.2.3-4℃12000r/min离心15rin(Eppendorl管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置破水纸上，新+液体（不同样品领在吸水纸不同地方沾）：加人60μ75%乙醇，颠倒洗涤。
8.3.2.4丁1°、12000r/min离心10minEppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）小心倒去上清，倒胃丁吸水纸上，尽量沾十液休（不同样品须在吸水不同地方沾下）。8.3.2.54000r/min离心10s(Ependorf管：H口保持朝离心机转轴方i放置）.将管整上的残余液体甩到管底部，小心倒去「清，用微员加样器将其吸十，一份样本换用一个吸头，吸买不要碰到有沉症一面,室渊下燥 3 i,不能过 」下燥,以免 RNA 不溶,8.3.2.6加人11叫.LEPr水,轻轻混勾,溶解管壁上的RNA,2000 r/mrin离心5 s,冰上保存备用。提取的RVA须在2h内进行PCR扩增。若需长期保存，须放置在-70℃冰箱内。8.3.3反应体系
深用50叫反应体系，在PCR管中依次加人DI1C处理水19.5μI5×逆转录酶缓冲液10uL，引物 VNN-R3 和 VNN-F2(40 μmol/1.)各1 μI., MgClz(25 nmol/L)5μl-dNTPs(101nol/L) 1 μL,逆转录酶（5U/μL)μLRNase抑剂(20J/uL)0.5μDNA聚合悔(5/)1L.模板10μl8. 3. 4 RT - PCR
将加好样的IR反应管放人PR仪。反应参数设置为42℃30nin.95℃:5i，然后954s、55%408.72℃40s循环35次，最后72℃延件5min，1℃保存。8.3.5电泳
用TTE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖平板，加溴化<锭（A.10）或其他核酸染色剂。将6.样4
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品和2μI.样品缓冲液混合后加人样品孔，设立.DNAMarkcr作对照。紫外检测仪下观察结果。8. 3. 6 RT - PCR 结果判定
阳性对照在421ht~430bp位置出现一条单的核酸条带（见附录B），阴性对照和空白对照没有该核酸带，实验结果成立：待测样品在421bp~～~430bp位置出现核酸条带者为阳性；无带或带的大小不是421hp~430 bp的样品为阴性。8.4实时荧光RT-PCR方法
8.4.1样品处理和RNA提取
按8.3给出的方法迹行
8.4.2反应体系
采用 50 aL反应体系。在荧光 PCR管中依次加人 DFPC处理水 18.5 ml,5×逆转录海缓冲10μL，正向引物VERYF、反向号[物VERYR和探针（40μumul/1.)各1ml，MgCl（25mnl/1.）5μLdN'IPs (10 mmol/L) 1 μL,逆转录酶(5 U/ μL)I μL,RNase 抑制剂(20 U/μL)0. 5 μl,DNA 聚合酶(5U/μL)1μ.模板10mL。
8. 4. 3 荧光 RT-ICR
将PCR管置于荧光定量PCR仪。反应参数设置为 42℃45min,95℃10min,1个循环;95:10 s5840s.40个循环。收集FAM荧光，观察结果。8.4.4荧光RT-PCR结果判定
检测样品无C,值并且无增曲线时.即判定VNN阴性；检测样品的（C.值小于或等于30时，且出现典型的增曲线，即判定VNN阳性；检测样品的C,值大于30时，应重新进行检测。重新检测无C,值者为 VNN阴性，则为 VNN阳性。
9结果综合判定
9.1样品鱼满足以下之-的为病毒性神经坏死病可疑病例有临床症状；
显微观察有空泡病变；
细胞分离病毒出现CPE；免费标准bzxz.net
免疫荧光或免疫组织化学；
RTICR或实时荧光RT-PCR中在何-种检测为阳性。9.2有临床症状或有病理变化(参见附录3)的鱼的组织器官，直接采用免疫荧光或免疫组织化学RT-[CR或实时荧光RTPCR进行检测。如果使用其中一种方法出现阳性，即可判定为病毒性神经坏死病。
9.3无临床症状的色，如果用细胞分离病毒、免疫荧光或免疫组织化学、RT-PCR或实时炭光RTPCR中任何俩种不网方法检测结果为阳性，确诊为病毒性神经坏死病毒阳性。5
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A. 1 Davidsun's AFA固定液
37%中醛
9%%乙醇
冰醋酸
蒸馏水
220 rnL
115 mL
A.2胰蛋白酶—EDTA混合消化液
氯化钠(NaCl.分析纯）
氛化钾（KC1.分析纯）
磷殷二氢钾(KH,P)：分析纯）
磷酸氢二铆（KHPO，分析纯）
乙-胺四乙酸(ELTA，分析纯）
胰酶（分析纯）
双蒸水
过滤除菌后分装备所。
A.3细胞培养液
（资料性附录】
试剂配制
100 nL
1.15培养基（含Eagles），按说明书的要求配制。然后，加人10%的胎牛l清，抽滤除闲，4℃保存。在细胞培养板中使用时，加人过滤除菌的TIEPES,使其在培养液中的终浓度为0.02mol/LA.4PBS（磷酸缓冲盐水）
磷酸氨二钳(Na,HHP)）
磷酸二氧钾(KH:PO)）
氯化钠(Nac1)
氯化钾（KC1)
先加适量双蒸水，完个溶解后月双蒸水定容至1000mL，调整II至7.4，A.5PBST（磷酸缓冲盐水—吐温）1 000 ml, PBs 中加人 0, 5 ml.叶温-80(Tween80).混匀。A. 6 TBS (Tr-is Buffered Saline)Tris
氯化钠
先加适量蒸馏水，完全溶解后用蒸馏水定容举1000ml。调整pH到9.0。再加人0.5mL吐温20,混勾。室川保存3个,4℃可保存更久A.7TBE电泳缓冲液(5X浓缩液）
先加适量蒸馏水，完全溶解后切蒸馏水定容牟1000ml。用5tmoL/1.的盐酸调到pII8.0。6
B溴化乙锭(EthidiumBronnide,EB)而灭菌蒸馏水配制成10mg/mL的浓缩液。用时每100mL琼脂中加5μLSC/T 7216—2012
SC/T 7216—2012
附录R
【资料性附录】
病毒性神经坏死病临床症状和病理变化病毒性神经坏死病又称为病毒性脑病和视网膜病，是一种严重危害海水鱼类鱼苗的病毒性疾病。病原为病毒性神经环死病毒(Viral nervousnecrosisvirus，VNNV)，属野山村病毒科乙型野田村病毒属成员。
其临床症状为一系列与神经有关的分常表现。负放具不正常的螺旋状或旋转式游动或静正时腹部朝上，月爪于触病鱼，病鱼会立即游动等现象，且鱼体体色异常（苍白）。不同种类的免临床症状不同、有的色会出现缴过度膨胀，有的病鱼厌食、消瘦等。发病严重的鱼前伴随着极高的死亡率，最常见的病理变化是中枢神经纠织空泡化，通常出现在视网膜中心层，损伤视网膜。多数种类的仙郡会山现神经性坏死。
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