SC/T 7218.2-2015
基本信息
标准号： SC/T 7218.2-2015
中文名称：指环虫病诊断规程 第2部分：页形指环虫病
标准类别：水产行业标准(SC)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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标准简介
SC/T 7218.2-2015 指环虫病诊断规程 第2部分：页形指环虫病
SC/T7218.2-2015
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标准内容
ICS 65.020.30
中华人民共和国水产行业标准
SC/T7218.2-2015
指环虫病诊断规程
第2部分：页形指环虫病
Protocols for diagnosis of Dactylogyriasis-Part 2:Infection with Dactytogyrus lamellatus2015-02-09发布
2015-05~01实施
中华人民共和国农业部
SC/T7218“指坏出病诊断规程》为系列标准：-第1部分小鞘指环虫病；
-第2部分页形指坏虫病
第3部分：鳙指坏出病；
-第4部分;坏鳃指坏业病；
本部分是《指环出病诊断规程》的第2部分。本部分按照CB/T1.1一2009给出的规则起草。SC/T 7218. 2--2015
请注意本文件的桌些内容可能涉皮专利，本文件的发希机构不承担识别这些专利的责任。本部分由农业部渔业渔政臂理局提出，本部分出全国水产标准化技术委员会（SAC/T156)财口。本部分起草单位：河北省水产养殖病害防治监测总站。本部分主要起草人：曹杰英、张志华、刘文青、李全振、李凤超、康现江、赵宝华、中红旗、侯金良。1范围
指环虫病诊断规程
第2部分：页形指环虫病
SC/T 7218. 2—2015
本部分规定了页形指环止病的流行情况与临床症状以及形指环虫（Dactytogyrulamellutus）采集与固定、形态学鉴定和分了检測的方法。本部分适川丁草色等淡水色类页形指环虫病的流行病学调查、诊断、监测和检疫2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SC/T7103永生动物产地检疫采样技术规范3试剂和材料
3.1水：配置试剂用水应符合GB/T6682中一级的规定。3.2乙醇：分析纯。
3.3Tau酶：-20℃保存.不得反复冻融或温度刷烈变化。3.4dNIPs:含dAIPdITP.dGTPdCTP各10mmol/L的混合物。3.5L游引物 F:5'-TTATGTGGACCI(TGT-3'。3. 6F游引物 R: 5'-AGCCGAGTGATCCACCA - 3'。3.7DNA Markcr:2000 bp.1 000 bp、75c bp,500 bp.250 hp.100 bp:3. 8其他试剂见附录 A.
仪器和设备
体视显微镜和生物显微镜。
台微尺、微尺、显微摄影设备
PCR 扩增仪
4.4紫外透射仪或凝胶成像仪。
4.5电泳仪。
普通冰箱和超低温冰
离心机和离心管
电了天平。
恒温水浴箱和微波炉。
微量移液器及吸头，
解剖盘、剪刀、镊子、解剖针
载玻片，盖玻片、橡皮泥、培养Ⅲ和吸管。SC/T 7218.2—2015
5流行情况与临床症状
5.1流行情况
页形指坏山能感染草鱼（Cenupiaryngudonideltus）等，全国各地均可发生，发病高峰水温为20'℃-~25℃
5.2临床症状
页形指环虫主要寄生于鱼的鳃部。病鱼懿红织损伤，鳃丝肿胀、贫血，有斑点状溃血，鳃上有大量黏液，重度感染时，鳃丝显著肿胀，鳃盖张开病鱼极度不安、中动、狂游，或游动缓慢，呼吸困炸、上浮水面而死。6指环虫采集与固定
6.1病鱼采集
捞取具有典型症状的色。如果现场无病惊分离条件，将采集的病鱼用80%乙醇固定。样品封存和运输应符合SC/T7103的规定。
6.2指环虫样品的采集
用针刺鱼脑.将鱼杀死。完整的取下全鳃.用小剪刀将鳃片分离：取一片鳃置于培养皿中，洒水少许，用解剖针将虫体从鳃丝上剥离：用吸管吸出：放在载片。在盖玻片的四带涂少最朦皮泥避免盖玻片将虫体直接压碎,用子轻压盖玻片，显微镜下观察。6.3指环虫样品的固定与保存
加一滴清水到载玻片上用吸管吸取，-个出体置十水滴中.轻轻地盖上盖玻片，用-张滤纸在盖玻片边缘缓慢吸水，直到水基本吸十为止。上一滴APG济液(见A.1)到盖玻片边缘，直到浸满盖玻片与载被片之间的空隙。用于形态学鉴定的虫体样品用70为乙醇保存,用于分子检测的出体样品用95%乙醇保存。
7页形指环虫的鉴定
7.1页形指环虫的形态学鉴定
显微镜下指环虫前端有2对头器、2对黑色眼点，呈方形排列.此为判断指环虫的简易特征。微调焦距即可观察到指环业后吸器的中央人钩，联结乃和边缘小钩，指环虫带近头部端可观察到交接器，后吸器与交接器是指环虫鉴定的重要特征。根据要而镊广轻压盖玻片以凸显几丁质结构进行拍照。贞形指环虫虫休扁平,体长 0. 192 mm-0. 529 mm.宽 0. 072 mm~0. 136 mm。中央,大钩有较长的内突，内突端部各有，略旱三角形的附加片，钩炎有明显的纵纹，其有成对的腱带。后吸器具有两联结片·联结片长乃状，两端和中部凹起·副联结片短小高倍镜下观察旱W形。边缘小钩可区分柄、柄轴及馋尖基龚三部分。交接器结构较复杂。交接管长度略超出支持器一半，基部膨大：支持器的坚部与管的膨大部分相接,先形成一并！环,围绕交接管,然后}近交接管的末端再形成-一环，管即由此环通出。由坏上着山一几」质厚片，其端部连成一扩人成状的构造，其间似有一孔,此厚片巾其孔间穿人。内状结构的端部通出一-片突起.与整个交接器约成15°角，此突起末端终于平交接管端部的线上。400倍显微镜下对页形指坏虫进行形态学鉴楚·其中央人钩、联结片、交接器的形态特征参见图1.1、图B.2、图5.3、图B4，页形指环虫的形态学测量特征指标见表1。表1页形指环虫形态学测量特征指标单位为微术
母的特江
中央大钩全长
中央大钩华部
-iiiKwcutKAca
变动范围
32. n~30.3
26. 2~-27. 5
测量的特征
央大斜外突长
中火大匈内窦长
中火大钩钩尖长
中央大钩附加片长
中央大钩附加片宽
边缘小钩全长
联结片长
联结片宽
副联结片长
副联结片宽
交接管长
支持器长
7.2页形指环虫的分子检测
7. 2.1虫体 DNA的提取
表1(续）
变动范围
2.5~-3.73
1:. 5--13. 8
12. 5 --18. 7
5. 0-~7. 5
2. 5 -~ 3. 75
26. 3~35. 0
2. 5~-5. 8
25. 5 ~ 28, 0
2. 0 ~ 3. 0
23.0~25.0
201. 0-- 26. 4
36.0~-48.4
SC/T 7218. 2—2015
用吸管吸取乙醇固定的虫体标本1个，充分十燥以除去多余的乙醇后，转移至0.2mL离心管中。用100LIE缓冲液（见A2）浸洗2h3h，离心后弃上清.加入9ul.裂解液（见A.3）.未经乙醇固定保存的虫体则直接加裂解液。65℃水30min后，95℃处理10min，该裂解产物不需要进步纯化就可直接作为PCR的模板。也可用同等效用的试剂盒提取虫体DNA。7.2.2PCR扩增
反应在50μI体系中进行：10倍浓缩缓冲液（见A.4）5μl.，dNTPs2uL，引物（1Outno1/1)各2，DNA模板2uL.Tau酶1μl,双蒸水36L，反应程序为：94℃5min94℃30s.54℃30s，72℃1min，其25个循环；最后72℃10min。PCR反应应设置阴性对照和阳性对照。7.2.3PCR产物的电泳和测序
用1×TAE电泳缓冲液（见A.5)配成1%琼脂糖凝胶游液，微波炉加热使琼脂糖完全溶解，待冷却至60℃左右加入核酸染料GoldView（见A.6）至终浓度为3uL/100mL~~4l./100mL，混勺后倒人封固好的制胶板中，凝胶厚度在3mm～5mm，插人宽度适当的梳子。待概胶完全凝固后，小心拔出梳了，拆去封条，将凝胶放人装有1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，使电泳缓冲液刚好没过胶面（约1mm）。然后取5LFCR产物与1u.的6倍上样缓冲液（见A.7)混勾.用微量加样器将混合样品加到胶孔中，以5V/cm的电压电泳。当溴骼蓝电泳至适当位置后.用紫外观察灯或凝胶成像仪观察并记录缩果。PCR阳性产物会出现-一条与负形指环虫（1105bp)TTS1基因扩增片段一致的目的条带，空凹对照没有该目的条带。如疗在的条带，测取PCR扩增产物测序。8综合判定
8.1在显微镜下观察草色等类的鳃丝.如果观察到虫体，且符合7.1描述的页形指环虫特征，则判断为页形指环虫。如果形态鉴定不能完全确定指环出种类，可进一步用PCR方法护增其ITS1序列，经测序后与页形指环虫的参考序列（参见附录C）进行对比，序列相似性在99%以上者，则判断为页形指环虫。
2草鱼等鱼类感染风形指环虫，且病色临床症状符个5.2的描述，则判定为形指环虫病。8.2
SC/T 7218.2—2015
A.1 APG 溶液bzxZ.net
附录A
【规范性附录】
试剂及其配制
将饱和的节味酸铵溶液和H洲按照1：1的比例混合即成。A.2TE缓冲液 pH 9.0
Tris-HCl
A.3裂解液
500 mmol/1.
2c0 mmol/1.
10 mmol/L.
0. 45% NP-10.0.45%Tween-20、100mmo1/1.EDrA和100μg/ml.蛋H酶K。蛋自酶K用50mmol/1.Tris-HCl (pH8.o)和 1.5mmol/1. aAc配置。A. 410 倍浓缩缓冲液(10 × buffer)pH 8. 8TrisHCI
氯化钾（KC1）
100 ol/L
500nol/L
氯化镁（MgCl）15mnul/L
A,55倍TAE电泳缓冲液(5×TAEbuffer)Tris
加双蒸水溶解到1000.0mL用5.0mol/1.的盐酸（HCl)调pH到8.0。A.6核酸染料(Goldview)
用水配成10.0I1g/tmL的浓缩缓冲液。用时每20.0mL电泳液或琼脂中加1.5μL，A.76倍上样缓冲液（6×buffcr）澳酚蓝100g，加双蒸水5ml,在宝温下过夜，待溶解后再称取点糖25g.加双蒸水游解后移入酚蓝溶液中，播勾后定容至ml.加人氢氧化钠(NaOH)济液·滴.调至蓝色。4
-iiiKwcutKAca
附录B
【资料性附录】
指环虫的中央大钩、联结片、交接器的测量特征B.1指环虫几种几丁质结构及测量方法示意见图B.1。
说明：
指环求中央大御的凡种常见形式；发育完全的边缘小钩：
能形的边缘小钧：
指环虫交接器及其各部分：
中央人钩企长，
基部长；
外突民：
一内充长：
一钩尖长；
一钩尖：
一钩被：
图B.1指环虫几种几丁质结构及测量方法示意图B.2
常见指环虫联结片形态及测量方法示意图见图 B. 2。
SC/T 7218. 2—2015
小钩全长+
交接管基座：
交按管基部；
交接管；
支持器。
SC/T7218.2-2015
说测：
联结片的长：
联结片的密。
图B.2常见指环虫联结片形态及测量方法示意图B.3指环虫副联结片的几种形态及测量方法示意图见图B.3，
XX宝学
说明：
指环业副联结的儿种常见形式：副联结片的长：
副慌结片的
图B.3指环虫副联结片的几种形态及测量方法示意图B.4页形指环虫的后吸器，交接器形态特征见图B.4。
说谢：
后吸器：
2一-交接器。
图B.4页形指环虫的后吸器、交接器形态特征5
-iiiKwcutKAca
附录C
（资料性附录】
SC/T 7218. 220 15
页形指环虫核糖体DNA内转录间隔区IFSI)扩增产物的参考序列负形指环虫核糖体DNA内转录问隔区(ITS1)扩增产物的参考序列（1105bp），下划线为引物。TTATGIGGAC CTCTGTTCAG GTGCCTCTGG TACTTGGATA GAACCACATA AGCAGGTGAAACTTCTIAGA GGAACTGGCG CTCAAAAAGG CGCACGAGAA AGAGCAATAA CAKITTGTG121
ATGTOCGGGG CCGCACGCGT GCTACAATGACGAIGCTACT GAGCATGATTATGCCCTAAG
AACTTGTCCG AAAGGATCGG TGAAACTGTT CAATCATCGT CGTGACTGGKI ATTGKIGGTTTAGTAAGCACAAGTCATAAGC:TTGTGCTGATGCAATTGTCC CCCAIGAACC AGGAATTCCTTACGICCCTG CCCTTTGIAC ACACCGCCCG ICGCTACTACCATTGAATG GTTTA(CAAG
GACATTGGAT
ATCATTTAGA
ATTATCAAGT
CTCTGTCTCT
CGAGCCTTTG
CGGTTCACAC
?ITGAGAAGATGTCCGAACTTG
TGCTTGGGTT
GGAAGTAAAA
GTCGTAACAA
GGTTICCGTA
TTCCTAACTC AAACGKTTGG CGTCIAGIGICGGAAGGATC
GGTGAACCTG
CTTGGTGATC CTGTGCCTTG
CGACAGCTTA GAACTGTATT
CTCCTATGCGGCAAAGCTTT
AAGGTTGGTC
GTGAGGGTGC
ATTCTCTAAT GCTGCTCFGT GGGGGCATTG CTCHTITACAGTGTTGCCT
TGCTGCTIAG
GCGTCATGTGTIAGATCCGGTCGAGKKGACTATGCCCTCATGCTGGATCGT
AAATGTACGT TGIGGTGCTG GCTGTAACACTCITACGGICTGTGGTACAG
TGTCATICKK:
AGCCCGGCTCGACIGGAGCT
TCCGACAGGC
TTCGTACATC
TGCGTGCAGG
TGGTAAIGTG
TTGCACGTAG TCTCCGGTTGCACCCTGTIA CTGTICTATT CAGTCGICIG CCCKKITACATTACAAACCT
CCTCCCTTCG
GGTGAGTTCT
TGTCTGTGTT
CCAAAAGCCT
TAAACACTGG
CCGGTTCOGG CTGCTTTTGC TTCGTGGITA ACCCTGCGTG GCATGGCAGCAGTTCGCAGG
CCCGGTATGC
GCCCACTCAGTGCTAACCCG
CTGAGAGGTA
AACGI'GTATC
AAACTTTACA
ACTGCAAGIG GTGGATCACT CGGCT
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中华人民共和国水产行业标准
SC/T7218.2-2015
指环虫病诊断规程
第2部分：页形指环虫病
Protocols for diagnosis of Dactylogyriasis-Part 2:Infection with Dactytogyrus lamellatus2015-02-09发布
2015-05~01实施
中华人民共和国农业部
SC/T7218“指坏出病诊断规程》为系列标准：-第1部分小鞘指环虫病；
-第2部分页形指坏虫病
第3部分：鳙指坏出病；
-第4部分;坏鳃指坏业病；
本部分是《指环出病诊断规程》的第2部分。本部分按照CB/T1.1一2009给出的规则起草。SC/T 7218. 2--2015
请注意本文件的桌些内容可能涉皮专利，本文件的发希机构不承担识别这些专利的责任。本部分由农业部渔业渔政臂理局提出，本部分出全国水产标准化技术委员会（SAC/T156)财口。本部分起草单位：河北省水产养殖病害防治监测总站。本部分主要起草人：曹杰英、张志华、刘文青、李全振、李凤超、康现江、赵宝华、中红旗、侯金良。1范围
指环虫病诊断规程
第2部分：页形指环虫病
SC/T 7218. 2—2015
本部分规定了页形指环止病的流行情况与临床症状以及形指环虫（Dactytogyrulamellutus）采集与固定、形态学鉴定和分了检測的方法。本部分适川丁草色等淡水色类页形指环虫病的流行病学调查、诊断、监测和检疫2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SC/T7103永生动物产地检疫采样技术规范3试剂和材料
3.1水：配置试剂用水应符合GB/T6682中一级的规定。3.2乙醇：分析纯。
3.3Tau酶：-20℃保存.不得反复冻融或温度刷烈变化。3.4dNIPs:含dAIPdITP.dGTPdCTP各10mmol/L的混合物。3.5L游引物 F:5'-TTATGTGGACCI(TGT-3'。3. 6F游引物 R: 5'-AGCCGAGTGATCCACCA - 3'。3.7DNA Markcr:2000 bp.1 000 bp、75c bp,500 bp.250 hp.100 bp:3. 8其他试剂见附录 A.
仪器和设备
体视显微镜和生物显微镜。
台微尺、微尺、显微摄影设备
PCR 扩增仪
4.4紫外透射仪或凝胶成像仪。
4.5电泳仪。
普通冰箱和超低温冰
离心机和离心管
电了天平。
恒温水浴箱和微波炉。
微量移液器及吸头，
解剖盘、剪刀、镊子、解剖针
载玻片，盖玻片、橡皮泥、培养Ⅲ和吸管。SC/T 7218.2—2015
5流行情况与临床症状
5.1流行情况
页形指坏山能感染草鱼（Cenupiaryngudonideltus）等，全国各地均可发生，发病高峰水温为20'℃-~25℃
5.2临床症状
页形指环虫主要寄生于鱼的鳃部。病鱼懿红织损伤，鳃丝肿胀、贫血，有斑点状溃血，鳃上有大量黏液，重度感染时，鳃丝显著肿胀，鳃盖张开病鱼极度不安、中动、狂游，或游动缓慢，呼吸困炸、上浮水面而死。6指环虫采集与固定
6.1病鱼采集
捞取具有典型症状的色。如果现场无病惊分离条件，将采集的病鱼用80%乙醇固定。样品封存和运输应符合SC/T7103的规定。
6.2指环虫样品的采集
用针刺鱼脑.将鱼杀死。完整的取下全鳃.用小剪刀将鳃片分离：取一片鳃置于培养皿中，洒水少许，用解剖针将虫体从鳃丝上剥离：用吸管吸出：放在载片。在盖玻片的四带涂少最朦皮泥避免盖玻片将虫体直接压碎,用子轻压盖玻片，显微镜下观察。6.3指环虫样品的固定与保存
加一滴清水到载玻片上用吸管吸取，-个出体置十水滴中.轻轻地盖上盖玻片，用-张滤纸在盖玻片边缘缓慢吸水，直到水基本吸十为止。上一滴APG济液(见A.1)到盖玻片边缘，直到浸满盖玻片与载被片之间的空隙。用于形态学鉴定的虫体样品用70为乙醇保存,用于分子检测的出体样品用95%乙醇保存。
7页形指环虫的鉴定
7.1页形指环虫的形态学鉴定
显微镜下指环虫前端有2对头器、2对黑色眼点，呈方形排列.此为判断指环虫的简易特征。微调焦距即可观察到指环业后吸器的中央人钩，联结乃和边缘小钩，指环虫带近头部端可观察到交接器，后吸器与交接器是指环虫鉴定的重要特征。根据要而镊广轻压盖玻片以凸显几丁质结构进行拍照。贞形指环虫虫休扁平,体长 0. 192 mm-0. 529 mm.宽 0. 072 mm~0. 136 mm。中央,大钩有较长的内突，内突端部各有，略旱三角形的附加片，钩炎有明显的纵纹，其有成对的腱带。后吸器具有两联结片·联结片长乃状，两端和中部凹起·副联结片短小高倍镜下观察旱W形。边缘小钩可区分柄、柄轴及馋尖基龚三部分。交接器结构较复杂。交接管长度略超出支持器一半，基部膨大：支持器的坚部与管的膨大部分相接,先形成一并！环,围绕交接管,然后}近交接管的末端再形成-一环，管即由此环通出。由坏上着山一几」质厚片，其端部连成一扩人成状的构造，其间似有一孔,此厚片巾其孔间穿人。内状结构的端部通出一-片突起.与整个交接器约成15°角，此突起末端终于平交接管端部的线上。400倍显微镜下对页形指坏虫进行形态学鉴楚·其中央人钩、联结片、交接器的形态特征参见图1.1、图B.2、图5.3、图B4，页形指环虫的形态学测量特征指标见表1。表1页形指环虫形态学测量特征指标单位为微术
母的特江
中央大钩全长
中央大钩华部
-iiiKwcutKAca
变动范围
32. n~30.3
26. 2~-27. 5
测量的特征
央大斜外突长
中火大匈内窦长
中火大钩钩尖长
中央大钩附加片长
中央大钩附加片宽
边缘小钩全长
联结片长
联结片宽
副联结片长
副联结片宽
交接管长
支持器长
7.2页形指环虫的分子检测
7. 2.1虫体 DNA的提取
表1(续）
变动范围
2.5~-3.73
1:. 5--13. 8
12. 5 --18. 7
5. 0-~7. 5
2. 5 -~ 3. 75
26. 3~35. 0
2. 5~-5. 8
25. 5 ~ 28, 0
2. 0 ~ 3. 0
23.0~25.0
201. 0-- 26. 4
36.0~-48.4
SC/T 7218. 2—2015
用吸管吸取乙醇固定的虫体标本1个，充分十燥以除去多余的乙醇后，转移至0.2mL离心管中。用100LIE缓冲液（见A2）浸洗2h3h，离心后弃上清.加入9ul.裂解液（见A.3）.未经乙醇固定保存的虫体则直接加裂解液。65℃水30min后，95℃处理10min，该裂解产物不需要进步纯化就可直接作为PCR的模板。也可用同等效用的试剂盒提取虫体DNA。7.2.2PCR扩增
反应在50μI体系中进行：10倍浓缩缓冲液（见A.4）5μl.，dNTPs2uL，引物（1Outno1/1)各2，DNA模板2uL.Tau酶1μl,双蒸水36L，反应程序为：94℃5min94℃30s.54℃30s，72℃1min，其25个循环；最后72℃10min。PCR反应应设置阴性对照和阳性对照。7.2.3PCR产物的电泳和测序
用1×TAE电泳缓冲液（见A.5)配成1%琼脂糖凝胶游液，微波炉加热使琼脂糖完全溶解，待冷却至60℃左右加入核酸染料GoldView（见A.6）至终浓度为3uL/100mL~~4l./100mL，混勺后倒人封固好的制胶板中，凝胶厚度在3mm～5mm，插人宽度适当的梳子。待概胶完全凝固后，小心拔出梳了，拆去封条，将凝胶放人装有1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，使电泳缓冲液刚好没过胶面（约1mm）。然后取5LFCR产物与1u.的6倍上样缓冲液（见A.7)混勾.用微量加样器将混合样品加到胶孔中，以5V/cm的电压电泳。当溴骼蓝电泳至适当位置后.用紫外观察灯或凝胶成像仪观察并记录缩果。PCR阳性产物会出现-一条与负形指环虫（1105bp)TTS1基因扩增片段一致的目的条带，空凹对照没有该目的条带。如疗在的条带，测取PCR扩增产物测序。8综合判定
8.1在显微镜下观察草色等类的鳃丝.如果观察到虫体，且符合7.1描述的页形指环虫特征，则判断为页形指环虫。如果形态鉴定不能完全确定指环出种类，可进一步用PCR方法护增其ITS1序列，经测序后与页形指环虫的参考序列（参见附录C）进行对比，序列相似性在99%以上者，则判断为页形指环虫。
2草鱼等鱼类感染风形指环虫，且病色临床症状符个5.2的描述，则判定为形指环虫病。8.2
SC/T 7218.2—2015
A.1 APG 溶液bzxZ.net
附录A
【规范性附录】
试剂及其配制
将饱和的节味酸铵溶液和H洲按照1：1的比例混合即成。A.2TE缓冲液 pH 9.0
Tris-HCl
A.3裂解液
500 mmol/1.
2c0 mmol/1.
10 mmol/L.
0. 45% NP-10.0.45%Tween-20、100mmo1/1.EDrA和100μg/ml.蛋H酶K。蛋自酶K用50mmol/1.Tris-HCl (pH8.o)和 1.5mmol/1. aAc配置。A. 410 倍浓缩缓冲液(10 × buffer)pH 8. 8TrisHCI
氯化钾（KC1）
100 ol/L
500nol/L
氯化镁（MgCl）15mnul/L
A,55倍TAE电泳缓冲液(5×TAEbuffer)Tris
加双蒸水溶解到1000.0mL用5.0mol/1.的盐酸（HCl)调pH到8.0。A.6核酸染料(Goldview)
用水配成10.0I1g/tmL的浓缩缓冲液。用时每20.0mL电泳液或琼脂中加1.5μL，A.76倍上样缓冲液（6×buffcr）澳酚蓝100g，加双蒸水5ml,在宝温下过夜，待溶解后再称取点糖25g.加双蒸水游解后移入酚蓝溶液中，播勾后定容至ml.加人氢氧化钠(NaOH)济液·滴.调至蓝色。4
-iiiKwcutKAca
附录B
【资料性附录】
指环虫的中央大钩、联结片、交接器的测量特征B.1指环虫几种几丁质结构及测量方法示意见图B.1。
说明：
指环求中央大御的凡种常见形式；发育完全的边缘小钩：
能形的边缘小钧：
指环虫交接器及其各部分：
中央人钩企长，
基部长；
外突民：
一内充长：
一钩尖长；
一钩尖：
一钩被：
图B.1指环虫几种几丁质结构及测量方法示意图B.2
常见指环虫联结片形态及测量方法示意图见图 B. 2。
SC/T 7218. 2—2015
小钩全长+
交接管基座：
交按管基部；
交接管；
支持器。
SC/T7218.2-2015
说测：
联结片的长：
联结片的密。
图B.2常见指环虫联结片形态及测量方法示意图B.3指环虫副联结片的几种形态及测量方法示意图见图B.3，
XX宝学
说明：
指环业副联结的儿种常见形式：副联结片的长：
副慌结片的
图B.3指环虫副联结片的几种形态及测量方法示意图B.4页形指环虫的后吸器，交接器形态特征见图B.4。
说谢：
后吸器：
2一-交接器。
图B.4页形指环虫的后吸器、交接器形态特征5
-iiiKwcutKAca
附录C
（资料性附录】
SC/T 7218. 220 15
页形指环虫核糖体DNA内转录间隔区IFSI)扩增产物的参考序列负形指环虫核糖体DNA内转录问隔区(ITS1)扩增产物的参考序列（1105bp），下划线为引物。TTATGIGGAC CTCTGTTCAG GTGCCTCTGG TACTTGGATA GAACCACATA AGCAGGTGAAACTTCTIAGA GGAACTGGCG CTCAAAAAGG CGCACGAGAA AGAGCAATAA CAKITTGTG121
ATGTOCGGGG CCGCACGCGT GCTACAATGACGAIGCTACT GAGCATGATTATGCCCTAAG
AACTTGTCCG AAAGGATCGG TGAAACTGTT CAATCATCGT CGTGACTGGKI ATTGKIGGTTTAGTAAGCACAAGTCATAAGC:TTGTGCTGATGCAATTGTCC CCCAIGAACC AGGAATTCCTTACGICCCTG CCCTTTGIAC ACACCGCCCG ICGCTACTACCATTGAATG GTTTA(CAAG
GACATTGGAT
ATCATTTAGA
ATTATCAAGT
CTCTGTCTCT
CGAGCCTTTG
CGGTTCACAC
?ITGAGAAGATGTCCGAACTTG
TGCTTGGGTT
GGAAGTAAAA
GTCGTAACAA
GGTTICCGTA
TTCCTAACTC AAACGKTTGG CGTCIAGIGICGGAAGGATC
GGTGAACCTG
CTTGGTGATC CTGTGCCTTG
CGACAGCTTA GAACTGTATT
CTCCTATGCGGCAAAGCTTT
AAGGTTGGTC
GTGAGGGTGC
ATTCTCTAAT GCTGCTCFGT GGGGGCATTG CTCHTITACAGTGTTGCCT
TGCTGCTIAG
GCGTCATGTGTIAGATCCGGTCGAGKKGACTATGCCCTCATGCTGGATCGT
AAATGTACGT TGIGGTGCTG GCTGTAACACTCITACGGICTGTGGTACAG
TGTCATICKK:
AGCCCGGCTCGACIGGAGCT
TCCGACAGGC
TTCGTACATC
TGCGTGCAGG
TGGTAAIGTG
TTGCACGTAG TCTCCGGTTGCACCCTGTIA CTGTICTATT CAGTCGICIG CCCKKITACATTACAAACCT
CCTCCCTTCG
GGTGAGTTCT
TGTCTGTGTT
CCAAAAGCCT
TAAACACTGG
CCGGTTCOGG CTGCTTTTGC TTCGTGGITA ACCCTGCGTG GCATGGCAGCAGTTCGCAGG
CCCGGTATGC
GCCCACTCAGTGCTAACCCG
CTGAGAGGTA
AACGI'GTATC
AAACTTTACA
ACTGCAAGIG GTGGATCACT CGGCT
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