SC/T 7218.3-2015
基本信息
标准号： SC/T 7218.3-2015
中文名称：指环虫病诊断规程 第3部分：鳙指环虫病
标准类别：水产行业标准(SC)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准简介
SC/T 7218.3-2015 指环虫病诊断规程 第3部分：鳙指环虫病
SC/T7218.3-2015
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标准内容
ICS65.020.30
中华人民共和国水产行业标准
SC/T 7218.3—2015
指环虫病诊断规程wwW.bzxz.Net
第3部分：指环虫病
Protocols for diagnosis of Dactylogyriasis-Part 3 : Infection with Dactylogyrus aristichthy2015-02-09发布
2015-05-01实施
中华人民共和国农业部发布
SC/T7218《指坏出病诊断规程》为系列标准：一第1部分：小鞘指坏虫病；
—第2部分·页形指坏虫病：
一·第3部分：指坏出病；
第4部分：坏鳃指环出病
本部分是《指环虫病诊断规程》的第3部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起节。SC/T7218.3—2015
请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承扣识别这些专利的责任，本部分由农业部渔业渔管理局提山。本部分由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156>H口，本部分起草单位：河北省水产养殖病害防治监测总站本部分主要起草人：曹杰、张志华、刘文青、李全振、李凤超、康现江.赵宝华、中红旗、侯金良，1范围
指环虫病诊断规程
第3部分;鳙指环虫病
SC/T 7218. 3-2015
本部分规定了指坏虫病的流行情况与临床症状.以及購指坏虫（Dactytagyrusaristichthy）采集与固定、形态学鉴定和分检测的方法，本部分适用于購等淡水鱼类患指坏出病的流行病学调查、诊断、监测利1检疫，2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注期的引用文件，仪注片期的版本适用士本文件。凡是不注月期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范3试剂和材料
3.1水：配置试剂用水应符合GB/T6682中级的规定。3.2乙醇：分析纯。
3.3Taq酶：一20℃保荐，不得反复冻融或温度剧烈变化，3.4dNTP：含dATP，dTTP、dGTP，dCTP各10tutuol/L的混合物，3.5 上游引物 F:5 TTATGIGGACCTCIGT-3'3. 6下游引物 R: 5'- AGCCGAGTGATCCACCA - 3 3.7DNAMarker:2000bp.1000bp.750bp.500bp、250bp.100bp:3.8其他试剂见附录A。
4仪器和设备
4.1体视显微镜和生物显微镜。
4.2台微尺、目微尺、显微摄影设备。4.3PCR扩增仪。
4.4紫外透射仪或凝胶成像仪。
4.5电泳仪。
4.6普通冰箱和超低温冰箱。
4.7离心机和离心管。
4.8电了天平。
4.9恒温水浴箱和微波炉。
4.10微量移液器及吸头。
解剂盘、剪刀、镊广、解剖针、4.12
载玻片、盖玻片、橡皮泥、培养皿和吸管，1
SC/T 7218.3-2015
5流行情况与临床症状
5.1流行情况
指环虫能感染螨（Aristirhttysnoiti.）等，全国各地均可发生，发病高峰水温为20%~25%。5.2临床症状
鋪指环虫主要寄生于鱼的鳃部。病鱼鳃组损伤.鳃丝肿胀、贫血，有斑点欺淤血·鳃上有大量黏液。垂度感染时，鳃丝显著肿胀，鳃盖张卉，病鱼极度不安，窜动狂游-或游动缓慢，呼吸困难，上浮水面而死。
6指环虫采集与固定
6.1病鱼采集
捞取具有典型症状的鱼。如果现场无病源分离条件，将采集的病色80%乙醇固定。样品封存和运输应符合SC/T7103的规定。
6.2指环虫样品的采集
用针刺鱼脑,将鱼杀死。完整的取下全鳃,用小剪刀将片分离,取-片鳃置于培养Ⅲ中,洒水少许。用解剖针将虫体从鳃丝上剥离，用吸管吸出，放在载玻片上。在盖玻片的四角涂少量橡皮泥避免盖玻片将虫体直接压碎，用镊子轻压盖玻片，显微镜下察。6.3指环虫样品的固定与保存
加·一滴清水到载玻片上，用吸臂吸取一个虫体置丁水滴巾，轻轻地盖上盖玻片，用一张滤纸在盖坡片边缘缓慢吸水，直到水基本吸「为止。加上滴APG溶液（见A.1)到盖玻片边缘，直到浸满盖玻片与载玻片之间的空隙。用于形态学鉴定的虫体样品用70%乙醇保存，用丁分子检测的虫体样品用9.兆之醇保存
7指环虫的鉴定
7.1指环虫的形态学鉴定
显微镜下指环出前端有2对头器，2对黑色眼点.呈方形排列，此为判断指环虫的简易特征，微调焦即可观察到指环虫后吸器的中央大钩、联结片和边缘小钩，指环虫靠近头部端可观察剑交接器，扇吸器与交接器是指环虫鉴定的重要特征，根据需要用镊了轻正盖玻片以凸显儿「质结构进行拍照。舖指环虫体小型，体长c.34mm~~0.48mm，宽0,08mm~0.10nm中央大钩的内突、外突均极发达，基部宽区很宽，但随即转成较长的狭窄区，钩尖较短。联结片发达，略呈倒\山”字形，中部弯向后方.两端亦问后仲山二略尖的突起，副联结片颇长：做波浪状弯折数次，旱矮w形。边缘小钩可明显区分山橘、柄轴及饲尖基突三部分。交接管为驰形尖管·基部旱半圆形膨人。支持器端部似贝壳状.覆盖丁交接管：猜部咯呈三角形。支持器基部由-细小的几丁质片与管基郝相接，约丁管长度1/3处形成--环，」环基部一侧着生一成半桶状的骨片此外更向前延伸成一倒三角形锥休，其底部与环相接，两侧内二薄片合成，巾间留有·-窝状空隙，交接管先穿过环孢，然后变细穿人一薄片闻空隙内·而终丁支持器端部下方。400倍显微镜下对輪指环虫进行形态学鉴定，其中央人钩、联结片、交接器的形态特参见图3. 1、图 B. 2、图 B. 3,图13. 4。指环虫的形态学测量特征指标见表 1。表1指环虫形态学测鼠特征指标
单位为微米
测的特征
中央大钩牟长
中史大钩基部长
-iiiKwcutKAca
变动范围
38.0--44.5
35,2~-10. c
测屋的特征
中央大钩外突长
中央大钩内灾长
中央人钩钩尖长
边缘小期全长
联结片长
联结片宽
副联结片长
副联结片宽
交接节长
支持器长
7.2纳指环虫的分子检测
7.2.1虫体DNA的提取
表1（续）
变动范函
4. 5 ~7. 5
8. 5~~ 10. 5
5. 0-~7. 0
28. 5~-3. 5
3. 0~-5. 5
26. 4~-30. 6
2. 0~3. 0
31.5-~40.5
26. 5 -~ 34. 5
26. 5~-37.
SC/T 7218. 3--2015
用吸管吸取乙醇固定的虫体标本1个，充分干燥以除去多余的乙醇后，转移至C.2mI.离心管中。用100μLTE缓冲液（见A.2）浸洗2h3h，离心后弃上消，加入9μL裂解液（见A3），木经乙醇固定保存的虫体则直接加裂解液。65℃水浴30min后.95℃处理10mi1.该裂解产物不需要进一步纯化就可直接作为PCR的模板。也可用尚等效用的试剂盒提取虫体DNA。7.2.2PCR扩增
反应在50μ1.体系中进行：10倍浓缩缓冲液（见A.1）5μL，dNTPs2μL，9物（10μmal/1.)2uL，DNA模板2μl,Tag1μL,双蒸水 36μL。反应程序为:91℃ 5min;94℃30 s,54℃:30s,72℃1 min共25个循坏；最后72℃:101nin。PCR反应应设置阴性对照和阳性对照，7.2.3PCR产物的电泳和测序
用1×TAE电泳缓冲液（见A.5)配成1%琼脂糖凝胶溶液，微波炉加热使琼脂糖完全溶解，待冷却至60℃左右加入核酸染料GoldView（见A.6)至终浓度为3uL/100mL~~4μL./100mL，混匀后倒入封固好的制胶板中，凝胶厚度在3mm～5mm，捕入宽度适当的梳了。待凝胶完全凝固后，小心拔出梳子拆去封条，将凝胶放人装有1×TAE电涂缓冲液的电泳槽中，使电泳缓冲液刚好没过胶面（约1Inm）。然后取5μI.PCR物与1uL的6倍上样缓冲液（见A.7)混勾，用微量加样器将混合样品加到胶孔中：以5V/rm的电压电泳，当漠酚蓝电泳至适当位置后，用紫外观察灯或凝胶成像仪观察并记录结果PCR阳性产物会山现-条与指坏虫(1133 tp)ITS1基因扩增片段一敛的目I的条带，空白对照没有该目的条带。如存在目的条带，则取PCR扩增产物测序。8综合判定
8.1在显微镜下观察等鱼类的鳃丝.如果观察到虫体，且符合7.1描述的指环虫特征，则判断为指环虫。如果形态鉴定不能完全确定指环种类，可进一步用PCR方法扩增其ITSI序列，经测序后与缔指环虫的参考序列(参见附录C)进行对比,序列相似性在99%以上者，则判断为指环虫，8.2等鱼类感染指坏出，且病鱼临床症状符合5.2的描述，则判定为指环虫病。3
SC/T7218.3—2015
A.1APG 溶液
附录A
【规范性附录】
试剂及其配制
将饱和的皆床酸铵溶液和甘油按照1：1的比例混合即成，A. 2TE 缓冲液 pH 9. 0
Tris-IICl
A.3裂解液
500 mmol/L
200 nmol/1.
10 mmol/L
0.45%NP-1C,0.45%Tween-20、100tmtnol/LE)FA和1C0ug/ml.蛋白酶K。蛋白酶K用50mmol/L Tris-HC)(pH 8.o)和1.5mmal/L CaAel置。A.410倍浓缩缓冲液(10×buffer)pH8.8Tris - HCl
氯化钾(KCI)
氯化镁（MgCl）
lo mnol/L
500 mnol/L
15 mol/L
A.55倍TAE电泳缓冲液（5×TAEbuffcr)Tris
加双蒸水溶解到100c.0ml.,用5.0mol/L的盐酸(HcI)调pH到8.0。A6核酸染料(Goidvicw)
用水配成10.0mg/ml.的浓缩缓冲液，用时每20.Cml.电泳液或琼脂中加1.5μLA.76倍上样缓冲液(6× huffer)溴酚监100mg，加双蒸水5mI在空温下过夜，待解后再称取蔗糖25.加双蒸水溶解后移人漠酚监溶液中，摇勾后定容至50mL，加入氢氧化钠（NaOH)溶液-滴.调至蓝色。4
-iiiKwcutKAca
附录B
【资料性附录】
指环虫的中央大钩、联结片、交接器的测量特征B.1指环虫几种几丁质结构及测量方法示意图究图 B. 1。
说明：
指环虫中央大简的几种常见形式：发有完全的边综小钩；
牲的逆续小钩：
-指环业交接器皮其齐部分：
中央大钩全长！
基部长，
外究长，
内突长：
火长：
一醛萨：
·沟发；
图B.1指环虫几种几丁质结构及测量方法示意图常见指环虫联结片形态及测量方法示意图.2
见图 B.2。
SC/T 7218. 3—2015
小钩会长；
变接节其库：
交接管基部：
交按管；
支诗器。
SC/T7218.3—2015
说明：
埃结的长；
峨结片的宽。
图H.2常见指环虫联结片形态及测量方法示意图B.3指环虫副联结片的几种形态及测量方法示意图见图B.3。
说明：
指坏虫刷穿结片的几种流观形式：联结片的长，
副联结片的宽：
图B.3指环虫副联结片的几种形态及测量方法示意图B.4编指环虫的后吸器、交接器形态特征见图B.4。
后吸端：
交接器，
图B.4指环虫的后吸器、交接器形态特征-iiiKwcutKAca
附录℃
【资料性附录”
SC/ T 7218. 3--20 15
指环虫核糖体DNA内转录间隔区(ITSI)扩增产物的参考序列鳙指坏虫核糖体DNA内转录间隔区（ITS1)扩增产物的蚕考序列（1133bp），下划线为引物。1
TTATGTGGAC CTCTGTTCAG GTACCTCTGG TGCTTGGATA GAACCACATA AGCAGTIKGAAACTTCTTAGA GIAACTGKGCG CTCGAAAAGG CGCACGAGAA AGAGCAATAA CAGGTCTGTGATGCCCTAAG ATTCCKKGGK CGCACGCGT GGTACAATGA CGATGCTACT GAGCATGAITAACTIGJCCG AAAGGATCG TGAAATGTT CAATCAICGT CGTGACTGGG ATIGGGGITTGCAATTGTCC CCCATGAACC AGGAATTCGT AGTAAGCACA AGTCATAAGC TTGTGTGACTACGICCCTG CCCITIGTAC ACACCGCCCG TCGCTACTAC CGATTGAATG GTTTAGCAAGKITCATAC TGCTTGGGTT TGAGAAGATG TCCGAACTTGGGCATTGGAT
CAGCCTTTG
GGAAGTAAAATCGIAACAAGKITTTCCGTA GGTGAACCTGCGGAAGGAICATCATTIAGA
ATTATCAAGT TCCTATTAAA ATGCACGGTT CAGTGGTTGT GTCGGCAGAG TGTATTGTGTGCAAAGCCIT ATGGCTGGTC GKGAGCGCGGATTGCCTGITTAGATACAAGGCTCGACGCG
CCCTCCTGGG CTGCTGTGTT AGATCCTACC GAGGKGGTGC (CCCTCATGT GGATCATTGTGGTACAGAAA
TACAFCCGCC
CACGTAGAGT
CAAACCTTCT
ATGGCCGCTG
GGGCGTGCGT
GKGTATACGC
GGACGGTCTA
TGTGCGTAGC
AGGGACGKITT CTAACACTCT TACTOCGGCT ACTAGCTACGTAGCTCTAAC
TGGAGCGTCT GAATGGCIGC: GTGCGKGGTGKI TAATGTGTCGCGTATGTTCT TAAACCGCCA GTTATTGTGAAGGTACATTATIAGTCGCAA
CCCTICGGGT
GAGTCCTGTT TGTGCTTIGA AAACTTAAAA AITGGTCATTTCTCCTCGGCACGATCGCGC GTTCGCTGGT GTGAACTGGTAGITGCCTGG
GIGICTAAIG TCGGGGGGTG
TGGCCAGGIG
ACGAGGTGAE TATCTAGACC
CCGCTCAATG
CGTGTATCAA
GCTCGGIGTT
TGCGCTTAAC
CGTGCGGACATTGGACTTT
GGATCACICGGCT
CCTATACAAC
TGCAAGTGGT
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中华人民共和国水产行业标准
SC/T 7218.3—2015
指环虫病诊断规程wwW.bzxz.Net
第3部分：指环虫病
Protocols for diagnosis of Dactylogyriasis-Part 3 : Infection with Dactylogyrus aristichthy2015-02-09发布
2015-05-01实施
中华人民共和国农业部发布
SC/T7218《指坏出病诊断规程》为系列标准：一第1部分：小鞘指坏虫病；
—第2部分·页形指坏虫病：
一·第3部分：指坏出病；
第4部分：坏鳃指环出病
本部分是《指环虫病诊断规程》的第3部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起节。SC/T7218.3—2015
请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承扣识别这些专利的责任，本部分由农业部渔业渔管理局提山。本部分由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156>H口，本部分起草单位：河北省水产养殖病害防治监测总站本部分主要起草人：曹杰、张志华、刘文青、李全振、李凤超、康现江.赵宝华、中红旗、侯金良，1范围
指环虫病诊断规程
第3部分;鳙指环虫病
SC/T 7218. 3-2015
本部分规定了指坏虫病的流行情况与临床症状.以及購指坏虫（Dactytagyrusaristichthy）采集与固定、形态学鉴定和分检测的方法，本部分适用于購等淡水鱼类患指坏出病的流行病学调查、诊断、监测利1检疫，2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注期的引用文件，仪注片期的版本适用士本文件。凡是不注月期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范3试剂和材料
3.1水：配置试剂用水应符合GB/T6682中级的规定。3.2乙醇：分析纯。
3.3Taq酶：一20℃保荐，不得反复冻融或温度剧烈变化，3.4dNTP：含dATP，dTTP、dGTP，dCTP各10tutuol/L的混合物，3.5 上游引物 F:5 TTATGIGGACCTCIGT-3'3. 6下游引物 R: 5'- AGCCGAGTGATCCACCA - 3 3.7DNAMarker:2000bp.1000bp.750bp.500bp、250bp.100bp:3.8其他试剂见附录A。
4仪器和设备
4.1体视显微镜和生物显微镜。
4.2台微尺、目微尺、显微摄影设备。4.3PCR扩增仪。
4.4紫外透射仪或凝胶成像仪。
4.5电泳仪。
4.6普通冰箱和超低温冰箱。
4.7离心机和离心管。
4.8电了天平。
4.9恒温水浴箱和微波炉。
4.10微量移液器及吸头。
解剂盘、剪刀、镊广、解剖针、4.12
载玻片、盖玻片、橡皮泥、培养皿和吸管，1
SC/T 7218.3-2015
5流行情况与临床症状
5.1流行情况
指环虫能感染螨（Aristirhttysnoiti.）等，全国各地均可发生，发病高峰水温为20%~25%。5.2临床症状
鋪指环虫主要寄生于鱼的鳃部。病鱼鳃组损伤.鳃丝肿胀、贫血，有斑点欺淤血·鳃上有大量黏液。垂度感染时，鳃丝显著肿胀，鳃盖张卉，病鱼极度不安，窜动狂游-或游动缓慢，呼吸困难，上浮水面而死。
6指环虫采集与固定
6.1病鱼采集
捞取具有典型症状的鱼。如果现场无病源分离条件，将采集的病色80%乙醇固定。样品封存和运输应符合SC/T7103的规定。
6.2指环虫样品的采集
用针刺鱼脑,将鱼杀死。完整的取下全鳃,用小剪刀将片分离,取-片鳃置于培养Ⅲ中,洒水少许。用解剖针将虫体从鳃丝上剥离，用吸管吸出，放在载玻片上。在盖玻片的四角涂少量橡皮泥避免盖玻片将虫体直接压碎，用镊子轻压盖玻片，显微镜下察。6.3指环虫样品的固定与保存
加·一滴清水到载玻片上，用吸臂吸取一个虫体置丁水滴巾，轻轻地盖上盖玻片，用一张滤纸在盖坡片边缘缓慢吸水，直到水基本吸「为止。加上滴APG溶液（见A.1)到盖玻片边缘，直到浸满盖玻片与载玻片之间的空隙。用于形态学鉴定的虫体样品用70%乙醇保存，用丁分子检测的虫体样品用9.兆之醇保存
7指环虫的鉴定
7.1指环虫的形态学鉴定
显微镜下指环出前端有2对头器，2对黑色眼点.呈方形排列，此为判断指环虫的简易特征，微调焦即可观察到指环虫后吸器的中央大钩、联结片和边缘小钩，指环虫靠近头部端可观察剑交接器，扇吸器与交接器是指环虫鉴定的重要特征，根据需要用镊了轻正盖玻片以凸显儿「质结构进行拍照。舖指环虫体小型，体长c.34mm~~0.48mm，宽0,08mm~0.10nm中央大钩的内突、外突均极发达，基部宽区很宽，但随即转成较长的狭窄区，钩尖较短。联结片发达，略呈倒\山”字形，中部弯向后方.两端亦问后仲山二略尖的突起，副联结片颇长：做波浪状弯折数次，旱矮w形。边缘小钩可明显区分山橘、柄轴及饲尖基突三部分。交接管为驰形尖管·基部旱半圆形膨人。支持器端部似贝壳状.覆盖丁交接管：猜部咯呈三角形。支持器基部由-细小的几丁质片与管基郝相接，约丁管长度1/3处形成--环，」环基部一侧着生一成半桶状的骨片此外更向前延伸成一倒三角形锥休，其底部与环相接，两侧内二薄片合成，巾间留有·-窝状空隙，交接管先穿过环孢，然后变细穿人一薄片闻空隙内·而终丁支持器端部下方。400倍显微镜下对輪指环虫进行形态学鉴定，其中央人钩、联结片、交接器的形态特参见图3. 1、图 B. 2、图 B. 3,图13. 4。指环虫的形态学测量特征指标见表 1。表1指环虫形态学测鼠特征指标
单位为微米
测的特征
中央大钩牟长
中史大钩基部长
-iiiKwcutKAca
变动范围
38.0--44.5
35,2~-10. c
测屋的特征
中央大钩外突长
中央大钩内灾长
中央人钩钩尖长
边缘小期全长
联结片长
联结片宽
副联结片长
副联结片宽
交接节长
支持器长
7.2纳指环虫的分子检测
7.2.1虫体DNA的提取
表1（续）
变动范函
4. 5 ~7. 5
8. 5~~ 10. 5
5. 0-~7. 0
28. 5~-3. 5
3. 0~-5. 5
26. 4~-30. 6
2. 0~3. 0
31.5-~40.5
26. 5 -~ 34. 5
26. 5~-37.
SC/T 7218. 3--2015
用吸管吸取乙醇固定的虫体标本1个，充分干燥以除去多余的乙醇后，转移至C.2mI.离心管中。用100μLTE缓冲液（见A.2）浸洗2h3h，离心后弃上消，加入9μL裂解液（见A3），木经乙醇固定保存的虫体则直接加裂解液。65℃水浴30min后.95℃处理10mi1.该裂解产物不需要进一步纯化就可直接作为PCR的模板。也可用尚等效用的试剂盒提取虫体DNA。7.2.2PCR扩增
反应在50μ1.体系中进行：10倍浓缩缓冲液（见A.1）5μL，dNTPs2μL，9物（10μmal/1.)2uL，DNA模板2μl,Tag1μL,双蒸水 36μL。反应程序为:91℃ 5min;94℃30 s,54℃:30s,72℃1 min共25个循坏；最后72℃:101nin。PCR反应应设置阴性对照和阳性对照，7.2.3PCR产物的电泳和测序
用1×TAE电泳缓冲液（见A.5)配成1%琼脂糖凝胶溶液，微波炉加热使琼脂糖完全溶解，待冷却至60℃左右加入核酸染料GoldView（见A.6)至终浓度为3uL/100mL~~4μL./100mL，混匀后倒入封固好的制胶板中，凝胶厚度在3mm～5mm，捕入宽度适当的梳了。待凝胶完全凝固后，小心拔出梳子拆去封条，将凝胶放人装有1×TAE电涂缓冲液的电泳槽中，使电泳缓冲液刚好没过胶面（约1Inm）。然后取5μI.PCR物与1uL的6倍上样缓冲液（见A.7)混勾，用微量加样器将混合样品加到胶孔中：以5V/rm的电压电泳，当漠酚蓝电泳至适当位置后，用紫外观察灯或凝胶成像仪观察并记录结果PCR阳性产物会山现-条与指坏虫(1133 tp)ITS1基因扩增片段一敛的目I的条带，空白对照没有该目的条带。如存在目的条带，则取PCR扩增产物测序。8综合判定
8.1在显微镜下观察等鱼类的鳃丝.如果观察到虫体，且符合7.1描述的指环虫特征，则判断为指环虫。如果形态鉴定不能完全确定指环种类，可进一步用PCR方法扩增其ITSI序列，经测序后与缔指环虫的参考序列(参见附录C)进行对比,序列相似性在99%以上者，则判断为指环虫，8.2等鱼类感染指坏出，且病鱼临床症状符合5.2的描述，则判定为指环虫病。3
SC/T7218.3—2015
A.1APG 溶液
附录A
【规范性附录】
试剂及其配制
将饱和的皆床酸铵溶液和甘油按照1：1的比例混合即成，A. 2TE 缓冲液 pH 9. 0
Tris-IICl
A.3裂解液
500 mmol/L
200 nmol/1.
10 mmol/L
0.45%NP-1C,0.45%Tween-20、100tmtnol/LE)FA和1C0ug/ml.蛋白酶K。蛋白酶K用50mmol/L Tris-HC)(pH 8.o)和1.5mmal/L CaAel置。A.410倍浓缩缓冲液(10×buffer)pH8.8Tris - HCl
氯化钾(KCI)
氯化镁（MgCl）
lo mnol/L
500 mnol/L
15 mol/L
A.55倍TAE电泳缓冲液（5×TAEbuffcr)Tris
加双蒸水溶解到100c.0ml.,用5.0mol/L的盐酸(HcI)调pH到8.0。A6核酸染料(Goidvicw)
用水配成10.0mg/ml.的浓缩缓冲液，用时每20.Cml.电泳液或琼脂中加1.5μLA.76倍上样缓冲液(6× huffer)溴酚监100mg，加双蒸水5mI在空温下过夜，待解后再称取蔗糖25.加双蒸水溶解后移人漠酚监溶液中，摇勾后定容至50mL，加入氢氧化钠（NaOH)溶液-滴.调至蓝色。4
-iiiKwcutKAca
附录B
【资料性附录】
指环虫的中央大钩、联结片、交接器的测量特征B.1指环虫几种几丁质结构及测量方法示意图究图 B. 1。
说明：
指环虫中央大简的几种常见形式：发有完全的边综小钩；
牲的逆续小钩：
-指环业交接器皮其齐部分：
中央大钩全长！
基部长，
外究长，
内突长：
火长：
一醛萨：
·沟发；
图B.1指环虫几种几丁质结构及测量方法示意图常见指环虫联结片形态及测量方法示意图.2
见图 B.2。
SC/T 7218. 3—2015
小钩会长；
变接节其库：
交接管基部：
交按管；
支诗器。
SC/T7218.3—2015
说明：
埃结的长；
峨结片的宽。
图H.2常见指环虫联结片形态及测量方法示意图B.3指环虫副联结片的几种形态及测量方法示意图见图B.3。
说明：
指坏虫刷穿结片的几种流观形式：联结片的长，
副联结片的宽：
图B.3指环虫副联结片的几种形态及测量方法示意图B.4编指环虫的后吸器、交接器形态特征见图B.4。
后吸端：
交接器，
图B.4指环虫的后吸器、交接器形态特征-iiiKwcutKAca
附录℃
【资料性附录”
SC/ T 7218. 3--20 15
指环虫核糖体DNA内转录间隔区(ITSI)扩增产物的参考序列鳙指坏虫核糖体DNA内转录间隔区（ITS1)扩增产物的蚕考序列（1133bp），下划线为引物。1
TTATGTGGAC CTCTGTTCAG GTACCTCTGG TGCTTGGATA GAACCACATA AGCAGTIKGAAACTTCTTAGA GIAACTGKGCG CTCGAAAAGG CGCACGAGAA AGAGCAATAA CAGGTCTGTGATGCCCTAAG ATTCCKKGGK CGCACGCGT GGTACAATGA CGATGCTACT GAGCATGAITAACTIGJCCG AAAGGATCG TGAAATGTT CAATCAICGT CGTGACTGGG ATIGGGGITTGCAATTGTCC CCCATGAACC AGGAATTCGT AGTAAGCACA AGTCATAAGC TTGTGTGACTACGICCCTG CCCITIGTAC ACACCGCCCG TCGCTACTAC CGATTGAATG GTTTAGCAAGKITCATAC TGCTTGGGTT TGAGAAGATG TCCGAACTTGGGCATTGGAT
CAGCCTTTG
GGAAGTAAAATCGIAACAAGKITTTCCGTA GGTGAACCTGCGGAAGGAICATCATTIAGA
ATTATCAAGT TCCTATTAAA ATGCACGGTT CAGTGGTTGT GTCGGCAGAG TGTATTGTGTGCAAAGCCIT ATGGCTGGTC GKGAGCGCGGATTGCCTGITTAGATACAAGGCTCGACGCG
CCCTCCTGGG CTGCTGTGTT AGATCCTACC GAGGKGGTGC (CCCTCATGT GGATCATTGTGGTACAGAAA
TACAFCCGCC
CACGTAGAGT
CAAACCTTCT
ATGGCCGCTG
GGGCGTGCGT
GKGTATACGC
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