SC/T 7219.1-2015 三代虫病诊断规程 第1部分 大西洋鲑三代虫病 SC/T7219.1-2015 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

1CS 65.020.30
中华人民共和国水产行业标准
SC/T7219.1-2015
三代虫病诊断规程
第1部分：大西洋鲑三代虫病
Protocols for diagnosis of Gyrodactylosis -Part l: Infection with Gyrodactylus salaris2015-02-09发布
2015-05-01实施
中华人民共和国农业部
SC/T7219《-代虫病诊断规程》为系列标准：第1部分：大西洋鲤三代出病；
第2部分：皖一代虫病；
第3部分：鲢代虫病；
第4部分：中型=代业病；
第5部分:细锚三代虫病；
-第6部分;小林三代鬼病；
.TTETT.
本部分为SC/T7219的第1部分，
本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草SC/T 7219. 1—2015
请注意本文件的荣些内容可能涉及专利。不文件的发布机构不承担认别这些专利的责任。本部分由农业部渔业渔政管埋局提出。本部分由全国水产标推化技术委员会（SAC/TC156)归口。本部分越草单位：中国科学院水生生物研究所、全国水产技术推广总站。本部分主要起草人李文祥、E桂堂、邹红、吴山功、陈爱平。1
1范围
三代虫病诊断规程
第1部分;大西洋鲑三代虫病
SC/T 7219. 1—2015
本部分规定了大西洋鲑三代虫病的感染对象与临床症状，大西洋鲤三代虫（Gurodartussalari）的采集与固定、形态学鉴定和分子检测的方法以及大西洋壁一代出病的综合判定。本部分适用于鲜、鳟色类大西洋鲑三代虫病的流行病学调查、诊断、监测和检疫：2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修收单）适用于本文件。CB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范3试剂和材料
3.1水：符合GB/T6682中一级水的规定。3.2乙醇：分析纯。
3.3Taq酶：—20℃保存，避免反复冻融，3.4dNTPs：含dATP、dTIP、dGTP和dTP各10mmal/I.3.5上游引物：5-TTTCCGTAGGIGAACCT-3'，3. 6 下游引物:5'-TCCTCGCTTAGTGATA-3'3. 7 矿物油:不含 DNA 酶和 RNA 酶。3.8DNAmarker2000:2000tbp.1000bp.750bp.500bp.250bp100hp.3.9其他试剂现附录A。
4仪器和设备
解剖盘、剪刀、镊子、解剖针和手术刀。4.2
体视显微镜利带测微标尺的光学微镜。4.3盖玻片、裁玻片和培养血。
4.4电子大半。
4.5普通台式离心机和高速冷冻离心机。4.6普通冰箱和超低温冰箱
4.7微量移液器。
4.8PCR扩增仪。
4.9离心管和PCR管。
紫外透射。
4.11水平电泳系统。
SC/T 7219.1—2015
5感染对象与临床症状
5.1感染对象
大西洋鲜一代虫能感染好生和养殖大西洋链（Sutmosular）、褐缚（Sa.lmntrutta）.还有虹尊（Omcorhyhuymgkiss）北极红点鲢（Selvelinusatpinus）溪红点鲢（SJnntnatis）、湖红点鲜（Snamuyciush)和尚角(Thymaffusthymalius)等5.2临床症状
大四洋鲜一代虫十要寄牛于体表，病鱼常出现蹭擦池壁、跃尚水面的行为；有些疯色反应巡钝，常在水流缓慢的地方出现，体表因黏液增多变成淡灰色，背鳍，尾鳍和胸鳍的边缘出现糜烂6三代虫采集与固定
6.1病鱼采集
行细观察待检色类的临床症状和行为.捞取具有典型症状的色类，采样方法、样品数量、样品封存和运输应符合C/7103的规定。
6.2三代虫样品的采集
6.2.1现场采集
剪取鳍条或刮取部分体表黏液、置于载玻片工，瀚加数滴清水，置于体视显微镜下观察，用解剖针将一代虫从鳍条或体表黏液中分离，用吸管吸出，放在盛有清水的培养血中，每尾病鱼至少采华成虫10茶。
6.2.2固定病鱼中的采集
剪取病鱼鳍条放在载玻片1：.逐滴加入自米水浸泡1Cmin，置十体视显微镜下观察。发现一代出后，川解剖针将出体分离，放在盛有清水的培养血中。同时.镜检固定病角所用察器底部的沉淀物。如发现有从鱼体脱落的一代出.用吸管吸出，放在盛有清水的培养Ⅲ中。6.3三代虫样品的固定与保存
加滴清水到载玻片上，用吸管吸取一个业体置于水滴中，轻轻地盖上盖玻片。用一张滤纸在羞坡片边缘缓慢吸水，直到水基本吸于为止。加上一滴APG溶液（见附录A.1）到盖玻片缘，直到浸满盖玻片与载玻片之间的空隙。
用十形态学鉴定的虫体样木可用70%酒精保存，用于PCR整定的虫体样品可用95坏酒精保存：7大西洋鲑三代虫的鉴定
7.1大西洋鲑三代虫的形态学鉴定人西洋三代出运动如尺嬉；虫体呈长叶形，体长0.5mm～1.0mm，体前有2个头器，无黑色眼点；虫体后端其儿丁质的伞状后吸器.其上有1对锚钩，16个边缘小钩和1根腹联结片：腹联结片上端中部叫陷明显，突起问长度稍短于联结片长；与寄生于链，鳟鱼类的其他2种一代虫的主要区别在于，Cyrodacrytustethis边缘小钩的镰部平几少要更长且弯.thymulli的镰部趾尖与柄部的角度更小可依此进行鉴定。
大西洋鲑·三代出后吸器的铺钩、边缘小钩和腹联结片的形态特征、测量部位及其人小见附录B。如果虫体后吸幕的形态特征和测量大小与附录B符，则可判定为疑似大西洋三代虫。7.2大西洋鲑三代虫的分子检测
7. 2. 1虫体 IXA 的提取
将80%乙醇固定的三代虫（1个出体作为1个样品）充分千燥去除乙醇，置人1.5mL的离心管中，加人500u.DNA抽提缓冲液1（见附录A.4）55℃消化3h，冷却至室漏后加人30)u1NA抽提缀2
-iiiKwcutKAca
SC/T 7219. 1—2015
冲液Ⅱ（见附录A.5），操勺.11000g离心10min，收集上清液，然后，加人2倍上清体积的一20℃预冷无水乙醇，1℃下5000g离心10min弃1清液，70%乙醇洗涤沉淀2次，弃上清液·空气十燥后溶于10L.TE缓冲液（见附录A.2)，一20℃保存备用。7.2.2TDNA-ITS的FCR扩增
PCR反应体系(25 μI)中,加人 20 rmol/1.的上游引物和下游引物各 1 μL,dNTPs 2μL,MgCl,2. 5μI.,Taq酶缓冲液2. 5 μL,0.5 UTaq酶以及模板基因组 DNA 1L,最后用无菌离子水定容到25 μl. 无热盖加的PCR仪应加矿物油25uL在PCR扩增仪中,91℃预变性4min,再 94℃:30 s*50℃30 s*72℃1min-洪35个循环,最后72℃延伸10min
PCR 扩增时,应设置阴性对照和阳性对照7.2.3PCR产物电泳与测序
取 5L PCR产物,加人 1 uI 漠酚蓝指示剂溶被(见附录 A.),混勾:用 1. 0为 琼脂糖（含(.5μg/ImLEB)于TAE缓冲溶液(见附录A.7)中电泳分离，同时设置DVA分了量标准作参照，紫外透射仪下检查是否存在大约130bp的目的条带。如存在目的条带,则取P(R扩增产物测序，其序列参见附录C，序列相似性在99%以上者，判定虫体为人西洋鲜三代虫。8综合判定
8.1大西洋鲑三代虫的判定
如果在显徽镜下观察到鲑、鱼类的鳍条或体表虫体符合7.1的形态特征和测量数据，则判断为疑似大西洋一代出；并根据7.2的方法对PCR扩增产物测序,与附录C给出的序列进行比对分析，序列相似性在99%以上者，判定虫体为大西洋鲢一代虫。8.2大西洋鲑三代虫病的判定
鲢、鳟鱼类感染大两洋一代出·且病鱼临床症状符合5.2描述，则判定为大西洋鲢三代虫病。3
SC/T 7219. 1—2015
附录A
(规范性附录）
试剂及其配制
本附录所有试剂,除特别注明外,均采用分析纯的试剂。A.1AIG溶液
将饱和的萨味酸铵溶液和油照1：1的比例混合，A.2TE缓冲液
1 mL 1ris HCl(limol/L-pH8. 0)和 0.2ml. EDTA(0. 5 mol/L,pH8.0)混合,加无菌去离子水穿至100mL，高火菌后4℃保存。A.310%SDS溶液
10gSDS溶于90mL蒸馏水中，68℃助溶用盐酸调pH至7.2.最后加熊馏水定容至100mL.室温保荐，
A4DNA抽提缓冲液I
400μLTE缀冲液.16μL蛋海K(5mg/ml)和20μL10%SLS的混合溶液A5DNA抽提缓冲液IbZxz.net
按TrisHC1溶液饱和过的亚蒸酚、氯伤、片必醇以25：24：1的比例混合，密闭避光1保存。A6Tag酶缓冲液（10倍PCRbuffer)0.5 mol/ L pH 8. 8 的 Tris -HCl、0. 5 mol/L 的氯化钾(KCl)和 1%的 TritonX-10c 的混合溶液A.7TAE电泳缓冲液(50倍)
242.0gTris碱.37.2\Na：上TTA·2H()混台·然后加80)mI.的去离子水充分搅拌溶解：再加入 57.1ml.的冰乙酸，充分混勾.加去离予水定容至1L室温保存。A.8核酸染色剂(ethidium bromide,EB)用水配制放10.0mg/mI.的浓缩液。使用时.每30.0ml.电泳液或琼脂中加1.0uL的EB，A.9溴酚蓝指示剂溶液
漠酚蓝100mg·加双蒸水5ml.在室温下过夜。待溶解后再称取熊糖25g加双蒸水溶解后移入漠酚监溶液中，摇勺后.加双蒸水定容至50mI加人氧氧化钠（NaOH)落液「滴，调至蓝色。-iiiKwcutKAca
附录B
（规范性附录】
大西洋鲑三代虫后吸器的形态测量B.1大西洋鲑三代虫锚钩的测量部位及大小见图B.110μm
说明：
全长(58.0m85.cm)
钩柄长(42. S rm~-63.9 mm);
c——衔尖长(27.8 μm1~-44. 2 μm);t基部长（15.0μm~32.1μm）。图B.1锚钩的测量部位及大小
B.2大西洋鲢一代虫边缘小钩的测量部位及大小见图B.2。um
说明：
全长（33.0m~15.6m），
部长（.ngm9.um）
柄部长(26.0μm-~38.5 jμm)。图B.2边缘小钩的测量部位及大小SC/ T 7219. 1—2015
SC/T 7219. 1—2015
B.3大西洋三代虫腹联结片的测量部位及大小见图B.3m
说明：
—联结片长（19.5m~31.0gr)
定起间长18.5m;
其部宽度(2.1 pn1--18. 7 um):d-
中间宽度(. 0 μm--15. 5 m);
膜长(12. 5 μm23. μn
—中间总宽度门7. c: un~-35. ,m);g—基总宽魔(2.H Jzm3t.ijm)。3腹联结片的测量部位及大小
-iiiKwcutKAca
附录C
【资料性附录”
SC/T 7219. 1—20 15
大西洋鲑三代虫核糖体DNA 内转录间隔区(ITS)扩增产物的参考序列人西洋鲜一代虫核糖体IVA内转录间隔区（ITS)扩增产物的参考序列如下，下划线为引物1
tttccgtagg
tagtggtgtc
tcgtttgtta
ggt.ggcgcac
tggggcaaaa
attccgaacg
etgccetata
attaaaargc
tcggtaaggt
gaaacataca
gaacagtccg
ccalgtggtg
taacctgcggaaggatcat.taaacatcgt.ttecltacut
attgcctaaaatcaaaggattttaaagaattaaaagcagtt.t.gcat.ggtt.
ctattctara
taaatccagc
agattctttt
aaattggaga
lcaltggagt
ctgactatcg
ctacagtggt
tagtgcttag
gatcactcgg
atgtgaaacg
caaactgctt
lgctcttagc
cggattggga
glattacacg
tacggtttgc
cttlacggll
agaalgagaa
ttatggtctg
agagatagal
gaatacccgc
cacgttcgat.
agtalaccat
gcctttacgg
tagatgaagt
1gctcgaag
atagctctaa
c.etgcacag
ttgigcatga
tgaacttaag
acggtataatgatat.acctt
gaagataa
agcagaactggttaataaga
tcgattccga
ttggggaactggttaaccatHgcattatacaacatagcat tgaacacacg
ctgtttcatg
gtgattagat
gaactggtag
tgeleaccca ccglcgtlta
teliccgagc
gttcggctacggccagctca
tegatagagt
cgccccgtca
ctcacgtgac
tccacaclca
gat.gaagagl
taaaatggta
atgtagtalc
ctgcctctgc
agctttggtt
gcagcaaact
cgatcatcgg tctctcgaargcaaarggcgcgagtgtcggcttttacctatcgtaacgctggclalgcgattaacttgttgttgaaagtttttgccetgt ggtgttetgatictggtatttcacattcgatgagtatgcg
gettctgagt
ttaaagacca
tggttct.tcc
ggt.gegtggo
tatacccagt
catatcacta
ttctttcata
ttaattgett
ttagttegct.
gaaaataagt
cacggccutt
gggtagtatt
ttgtaacgl
cctgaccicg
tgtggtgact
Laalggtgat
gaataagggt
gigacgatcg
gagcaagatg
cgcaaccaat
gatggttgac
atggctagtc
cgctattacc
acct.t.cgggt
tattacaact
gtgtlaacca
gctaagggct
taatlagtla
gaaacacgeg
aeacggactt
attacacgga
acggtttgat
gutglglacl
gtactgaagt
attegagegl
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。