SC/T 7219.6-2015
基本信息
标准号:
SC/T 7219.6-2015
中文名称:三代虫病诊断规程 第6部分:小林三代虫病
标准类别:水产行业标准(SC)
标准状态:现行
出版语种:简体中文
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相关标签:
虫病
诊断
规程
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标准简介
SC/T 7219.6-2015 三代虫病诊断规程 第6部分:小林三代虫病
SC/T7219.6-2015
标准压缩包解压密码:www.bzxz.net
标准内容
ICS 65.020.30
中华人民共和国水产行业标准
SC/T 7219.6-2015
三代虫病诊断规程
第6部分:小林三代虫病
Protocols for diagnosis of Gyrodactylosis-Part 6: Infection with Gyrodactylus kobayashit2015-02-09 发布
2015-05-01实施
中华人民共和国农业部发布
SC/T7219《三代虫病诊断规程》为系列标准:第1部分:人西洋鲜二代虫病;
第2 部分:鲩一代虫病;
第3部分:鲢三代虫病;
第1部分:中型三代虫病:
第5部分:细锚三代虫病;
一第6部分:小林二代虫病;
本部分为SC/T7219的第6部分。
本部分按照(GB/T1.12009给出的规则起草SC/T 7219. 6—20 15
请注意木文件的某毕内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本部分由农业部渔业渔政管理局提出。本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口本部分起草单位:中国科学院水生生物研究所、全国水产技术推广总站。本部分主要起草人:李文祥、王柱堂、邹红、吴山功、陈爱平。1范围
三代虫病诊断规程
第6部分:小林三代虫病
SC/T7219.6—2015
本部分规定广小林一代虫病的感染对象与临床症状,小林三代虫(Gyrodacrytukobavashii)的采集与固定、形态学鉴定和分子检测的方法以及小林一代出病的综合判定。本部分适用丁鲫的小林三代虫病的流行病学调查、诊断、监测和检疫。2规范性引用文件
下列文件对丁本文件的应用是必不可少的,凡是注日期的引用文件,仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注口期的引而文件.其最新版本(包括所有的修改单)适用于本义件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SC/T7103水牛动物产地检疫来样技术规范3试剂和材料
3.1水:符合CB/T6682中一级水的规定。3.2乙停:分析纯。
3.3Tag酶:-20℃保存,避免反复冻融。3.4dNIPs:含dATP、dTTP、dGTP和dCTP各10mmol/L3.5上游引物:5'TTTGTAGGTGAACT-3。3.6下游引物:5'-TCCTCCGCTTAGTGATA-3'3.7矿物油:不含DNA酶和RNA酶。3.8DNAmarker2000:2000bp.1000hp.750bp.500bp.250bp.100bp.3.9其他试剂见附录A。
4收器和设备
4.1解剖盘、剪刀、子、解剖针、手术刀。4.2体视显微镜和带测微标尺的光学显微镜。4.3盖玻片、载玻片培养皿。
4.4电子天平。
4.5谱通台式离心机和高速冷冻离心机。4.6普通冰箱和超低温冰箱。
4.7微量移液器。
4.8PCR扩增仪,
4.9离心管和PCR管。
4.10紫外透射仪
4.11水卡电泳系统,
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5感染对象与临床症状
5.1感染对豪
小林三代出能感染卸(Carassiusauratusauruus)和东北雅罗鱼(Lrucisruxulerk)等5.2临床症状
小林一代虫主要寄牛于体衣,病鱼常出现蹭擦池壁,跌山水面的行为;有些病色反应退饨,常在水流缓慢的地方山现休表因黏液增多变成淡灰色,背鳍,尾鳍和胸鳍的边缘出现糜烂。6三代虫采集与固定
6.1病鱼采集
仔纫观察待检鱼类的临床症状和行为,捞取具有典型症状的色类。采样方法、样品数量、样品封存和运输应符食SC/1了103的规定。6.2三代虫样品的收集
6.2.1现场采集
剪取鳍条、鳃丝或刮取部分体表黏液,置丁载玻片上。滴加数滴清水,置于体视显微镜下观察。开解剖计将一代虫从鳍条或鳃丝或体表黏液中分离,用吸管啵出·放在盛有清水的培养Ⅲ中,每尾病鱼至少采集成出10条。
6.2.2固定病鱼中的采集
剪取病鱼筛条或鳃丝放在裁玻片上,逐滴加人白来水浸泡10tin,置于体视显微镜下观察。发现一代出后,用解剖针将出体分离,放在盛有清水的培养血中;同时,镜检固定病色所用容器底部的沉淀物。如发现有从鱼体脱落的一代更,用吸管吸出·放在盛有清水的培养血巾。6.3三代虫样品的固定与保存
加一滴清水到载玻片工,用吸管吸取-个虫体置于水滴中,轻轻地益上盖玻片。用一张滤纸在盖玻片边缘缓慢吸水,直到水基本吸卡为止。加上-滴APG溶液(见附录A.1)到盖玻片边缘,直到漫满盖玻片与载玻片之间的空隙,
用丁形态学鉴定的虫体样本可用70%酒精保存,用于PCR鉴定的虫体样品可用95%酒精保存。7小林三代虫的鉴定
7.1小林三代虫的形态学鉴定
小林一代虫运动如尺;虫体星长叶形,体长0.3mm0.7mm,体前有2个头器,无黑色眼点;虫体后端具几丁质的伞状后吸器.其「:有1对锚钩、16个边缘小钩和1根腹联结片:锚钩钩尖较长,长于基部.腹联结片的耳状突起知而钝,突起间长小丁联结片长,边缘小钩的钩尖较平直,可依次进行定。
小林一代虫后吸器的锚钩、边缘小钩和腹联结片的形态特征、测量部位及其人小见附录乃。如果虫体后吸器的彤态特征和测量大小与附录B相符,则可判定为小林一代虫。7.2小林三代虫的分子检测
7.2.1虫体IDNA的提取
将80%乙醇固定的三代虫(1个虫体作为1个样品)充分卜燥太除7,置人1.5ml.的离心管中:加入5C0μLDNA抽提缓冲液1(见附录A.4)+55℃消化h.冷卸至室温后加入50GμLDNA抽提缓冲液Ⅱ(见附录A.5),摇勾110C0g离心10min,收集「清液。然后,加人2倍F清液体积的20℃预冷儿水乙醇,4℃下5000离心10Imi充1清液.70%乙醇洗涤沉淀2次·弃1清液,空气T燥底溶丁40uLTE缀冲液(见附录A.2),一20℃保存备用。2
-iiiKwcutKAca
7.2.2rDNA-ITS的PCR扩增
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PCR反应体系(25μl.)中,加人20)μmol/T.的上游引物和下游引物各1uL,dNTPs2叫lMgCl2.5μL,Tag酶缓冲液2.5l.,0.5UTag酶以及模板H因组DNA1μL.最后用无菌去离子水定容例25叫L.无热盖加的PCR仪成加矿物汕25uI.。PCR扩增时,证设置阴性对照和阳性对照。在PCR扩增仪中,94℃预变性4min,再91℃30s→50℃30s→72℃1min,共35个循环;最房72℃延伸10min。
7.2.3PCR产物电泳与测序
取5μI.PCR产物,加人1μ.溴酚蓝指示剂溶液(见附录A.9),混句-用1.0%琼脂糖(含0.5μg/ml.FB)于TAE缓冲溶液(见附录A.7)中电泳分离,同时设置DNA分子量标准作参照,紫外透射仪下检查是否存在大约1300bp的片的条带。如存在目的条带,则取PCR扩增产物测序,其序列参见附录(,序列相似性在99%以上者,判定虫体为小林一代出。8综合判定
8.1小林三代虫的判定
如果在显微镜下观察到鲤、鲫的鳍条或鳃丝或体表的一代虫符合7.1的形态结构和测量数据,或根据7.2的方法对PCR扩增产物测序,与附录C给出的序列迹行比对分析,序列相似性在99%以上者均可判定虫体为小林三代虫。
8.2小林三代虫病的判定bzxz.net
鲫(包括金)感染小林一代虫,数量多于其他三代虫种类的,且病鱼临床症状符合5.2描述,则判定为小林三代虫病。
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附录A
(规范性附录)
试剂及其配制
本附录所有试剂-除特别注明外。全部采用分析纯的试剂。A.1APG 溶液
将饱和的味被铵溶液利书油按照1:1的比例溉合,A.2TE缓冲液
1 ml. T'ris HCl(1 mol/L,pH 8. 0)和 (,2 InL EDTA(.5 mol/I.,pH 8.0)混合·加无菌去离了水定容至100 ml..高压炎菌后1℃保存。A.310%SIS溶液
10g SIS十9 mI蒸馏水中,68℃助溶,用盐酸调pH至7.2.最后加蒸馏水定容至100 mL,室温保存。
A. 4 DNA 抽提缓冲液 I
100 l.TF缓冲液、16mL蛋酶K(5mg/mL)和20μl.10% SDS的混合溶液。A5DNA抽提缓冲液Ⅱ
按TrisHCI游液饱和过的热酚、氯仿、异戊醇以25:24:1的比例混台,密闭避光1℃保存。A. 6Tay 酶缓冲液(10 倍 PCR buffer)C.5mul/LμH8.8的TrisHCl、0.5mol/T.的氯化钾(KCl)和1%的TritonX-100的混介溶液。A.7TAE电泳缓冲液50倍)
212.0我Tris碱、37.2gNzEDTA·2H.)混合,然后人800mL的去离子水充分搅拌济解,再加人57.1 mI.的冰乙酸.充分混句.加去离子水定容至1L,室温保存。A. 8核酸染色剂 (ethidium brumide,EB)用水配制成10.Cmg/mL的浓缩液:使用时.每10.0tmL电泳液或琼脂中加1.CuL的EB.A.9滤酚蓝指示剂溶液
溴酚蓝100m,加双蒸水5mI在室温下过夜。待溶解后冉称取蔗糖25g,加双蒸水溶解后移入漠酚蓝溶液中。据分后,加双蒸水定至50)ml.加入氢氧化钠(Na(H)溶液1滴,调至蓝色4
-iiiKwcutKAca
附录B
【规范性附录】
小林三代虫后吸器的形态测显
B.1小林三代虫后吸器锚钩的测量部位及人小见图B.110
说明,
全长(55.2m~65.7m):
钩柄长(453prm-48.2r);
-钠炎长(25. 2 μm--29. 9 μm):d—基部长(15.5μm~22.5μm)。锚钩的测量部位及大小
B.2小林-代虫后吸器边缘小钩的测量部位及大小见图B.2。10
说明:
全长:24. 3 μm~-28.7 μm);
部长(5.」~6.2m)
柄部长(,9. 1 μm---23. 5 Jrin)。2边缘小钩的测量部位及大小
图 B 2
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SC/T7219.6—2015
小林一代虫后吸器暖联结片的测量部位及大小见图B.3。B.3
说明,
-联结片长(21. f pm~-25. 2 ptl);1..
宽起长(17.3mm-21.8m);
某部宽度(6. 6 μm-10. 2 m):
ch中凌(5. 1 pn-~7.3 μm)
—膜长(11. 1 μm-6. 3 μm)
[—中间总宽度(13.2m--23.6m;基部总宽度:21.1gm--37.3am)
3腹联结片的测量部位及大小
-iiiKwcutKAca
附录C
(资料性附录)
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小林三代虫核糖体DNA内转录间隔区(ITS)扩增产物的参考序列小林一代出核糖体LNA内转录间隔区(ITS)扩增产物的参考序列如下,下划线为引物。ttteegtagg
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