SC/T 7220-2015
基本信息
标准号： SC/T 7220-2015
中文名称：中华绒螯蟹螺原体PCR检测方法
标准类别：水产行业标准(SC)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
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标准简介
SC/T 7220-2015 中华绒螯蟹螺原体PCR检测方法
SC/T7220-2015
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标准内容
ICS 65.020.30
中华人民共和国水产行业标准
SC/T7220—2015
中华绒螯蟹螺原体PCR检测方法
PCR detection method of Spiroplasma eriocheiris2015-02-09发布
2015-05-01实施
中华人民共和国农业部
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由农业部渔业渔政管理局提出，本标准由全国水产标准化技术委员会SAC/TC156)归日1。本标淮起草单位：南京师范大学。本标准主要起草人：王文、孟庆国、顾伟、吴霆、李文杰、仟乾、丁正峰SC/T 7220—2015
SC/T 72202015
本文件的发布机构提消注意如1下事实，市明符合本义件时，可能涉及7.2中华绒螯螺原体PCR检测与《螺原体病原微生物的PCR快速检测技术》（专利号：ZL200510041005X)等相关的专利的使用。
本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范用无任仰文场：该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任仰中请人在合理且无歧视的条款利条件下，就专利授权许川进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案，相关信息以通过以下联系力武获得：
专利持有人：南京师范大学
地址：江苏省南京市文苑路丨号南京师范大学生命科学学院请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
1范围
中华绒整蟹螺原体PCR检测方法
本标准规定了对中华绒螯蟹爆原体病原分离、纯化以及PCR检测的方法。SC/T 7220--2015
本标准适用于中华绒螯蟹等水生P壳动物（包括中华绒整蟹Eriocheirzinzensis、凡纳滨对邮虾Litopenaeuswunnumei，克氏原整虾Procanbaruxctarkii罗沼虾Macrobrachiunrusenhergii，下文均是以中华绒擎为对象)中华绒整蟹螺原体感染的流行病学调查、检疫和监测。2规范性引用文件
下列文件对丁本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引文件，仪注日期的版本适用本文件。凡是不注口期的引刃文件，其最新版本（包括所有的修改单）适川丁本文件。SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范SC/T7202.2—2007斑节对虾杆状病壶（MBV)病诊断规程第2部分：PCR检测方法3术语和定义
下列术语和定义适用丁术文作。3.1
中华绒鳌蟹螺原体spiroplasma eriocheiris具有体利小（可以滤过0.22um孔径滤膜）、会运动、有螺旋结构、没有细胞壁，可以用人上培养基培养等特征。该病原侵染中华绒螯蟹血淋凹细跑后在其内大量繁殖形战包涵体，该病原还广泛侵染中华绒整蟹机体内所有器官（包括鳃、心脏、肝胰腺、肌肉、神经、消化道等）的结缔组织。螺原休侵染神经时、可以引起宿主附肢颤抖，最终导效被感染宿主死亡。4试剂和材料
4.1Clhelex-100悬浊液(5%):称取5.0g(Chclcx-100混于100ml.去离子水中,常温保存。4.2酒精：100%，分析纯。
4.3蛋H酶K:20 mg/mls,
4.4DL.2000DNA分子量标准。
4.5溴化乙锭(EB)：10 mg/ml.。4.6琼胎糖：电泳级，
4.7dNTP;10mmol/L，含dATP、dTIP,tCTP.dGTP各10 mmol/L的混合物，20℃保存。4.8TagDNA疑合酶:5UJ/al,—20℃保存。4.910×PCR缓冲液：-20℃保存。4.105XTBE电泳缓冲液。
4.116×上样缓冲液。
4. 12 引物 FI: 5'- GATCAATCAATTGGTTTA 3,R1:$'- GGTIAGTTCTCICAGATAGTA-AGAA~3用无菌去离了水配制成10μmoi/L，一20℃保存，用以扩增中华绒整螺原体16srRNA23rRNAx序列
4.130.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS。-iiiKwcutKAca
SC/T7220—2015
4.14R2液体培养基：2.5gH13.8g糖，加双水至84mL.121℃高压灭菌20min；15ml.胎牛血清(56℃火活0.5h）1mL酚红，100mg青霉素，0.22um滤器过滤灭菌；高ltK菌部分冷却至50℃以下与过滤火菌部分混匀即得100ml.R2液体培养基4.15阳性对照为已感染+华绒整蟹螺原体且中华绒整蟹螺原体分离培养和PCR结果显示阳性的中华绒鳌肌闪组织提取的DNA，一20℃保存，4.16阴性对照为已知未感染中华绒螯蟹螺原体直中华绒整蟹螺原体分离培养和1R结果显示阴性的中华绒螯蟹肌肉组织提取的DNA，一20℃保存。5仪器设备
5. 1医用子、医用解剂刀,医用剪刀，5.21 ml. -饮性注射器。
5.3台式尚高速离心机：最高转速可达12000r/min以l5.4拉温培养箱：能满足30℃要求。5.5普通冰箱：具有冷藏箱，一18℃以下冷冻箱体。5.6微量移液器：量程0.1l~2.5uL1~10uL、2μl.~20u20μl~200gL、100l~1000μL5.7微量离心管：1.5mL.
5. 8 PCR 仪。
5.9电泳仪和水平电泳槽：输出直流电压0V~600V。5.10凝胶成像仪。
5.11水浴锅或者金属浴，
5.12薇波炉。
5. 13 PCR管:0. 2 mL
5.14滤器：0.22um
5.15涡旋振荡器。
6采样
采样数量、运输以及保存按SC/T7103的规定执行。中华绒整蟹体表月70%酒精消毒，用1ml一次性注射器抽敢第步足基部的而淋巴液，与两倍体积的PBS缓冲液混匀后用0.22um孔径滤器过滤，滤液用于中华绒整蟹螺原体的分离培养；而后用尤菌剪刀剪取中华绒整蟹一条步足，去掉外壳后，取肌肉约(.1g用于DNA提取。中华绒整蟹以外的水生甲壳动物取样方法类似。7检测方法
7.1中华绒警蟹螺原体分离、培养7.1.1待测个体体表70%酒精消毒，1mL.一次性注射器抽取血淋巴液与火菌处理后的PBS缓冲液1：2体积比混勾。
7.1.2、将」述混勾的恤淋巴液通过0.22m孔径滤器，收集滤过液。7.1.3将工述滤液50l.无菌接种至1ml.R2液体培养基，30℃恒温培养20d，7.1.4逐日观察培养基颜色变化.培养基颜色由红变黄且澄清透明，可初步判断为华绒整蟹螺原体阳性；若恒温培养1以+培养基仍无颜色变化，可判断待测样品为中华绒整蟹螺源体阴性。7.1.5分离培养物PR检测;见 7.2.2
7.2PCR检测
7.2.1DNA模板的提取
SC/T 7220--2015
7.2.1.1取所检测动物肌肉组织一小块（约0.1g）切谛转移到火菌的1.5mT.微量离心管中（分离培养物PCR检测时，取分离培养物1mL.100001/nin离心10min取样）。7.2.1.2用200ul.5%的chclcx-100悬浊液重悬，加人5L（20mg/mL）的蛋白酶K溶液，涡旋振荡器混合均勾后56℃水浴锅孵育，期问不断颠倒混勺。如1.5h后仍见落液浑浊，可再补加相同浓度蛋凹酶K溶液2混台均勾后继续孵育，2h时观察溶液的游浊程度。如果澄清，则取出进行下一步的实验；若仍然显示浑浊状态，延长孵育时间到2.5h。7.2.1.3颠倒混匀，转移至98℃水浴锅内孵育8min，7.2.1.4颠倒混匀4℃，12000r/min离心30min，7.2.1.5离心后的上清液转移到新的1.5mL火菌Eppendorf管巾中.此上消液即需要迹行IPCR鉴定的IDNA的溶液。
7.2.2PCK反应体系的准备
7.2.2.1PCR反应休系的准备必须在洁净的区域完成。7.2. 2.2PCR反应体系中使用引物 F1和 R1,模板为提取的样品 DNA.其反应预混物见表1。表1100份PCR反应预混物所需试剂组成试剂
10×PCR缓冲液（无Mg／）
MgCl, (25 mmol/L)
NIP(10mmol/L)
10 μmcl/ L[物 F]
10 μmal/1.引物 RI
灭菌双蒸水
TagINA合酶（5U/L）
25μl.体系
250μl
50 m体系
300μL
500叫
Ioul.体系
200 μL
I o uL
试剂终激度
1. 5 mmoi/ L
0. 2 mmal/L
1 prtnol/1
1 yumol/1.Www.bzxZ.net
注：23体系模板量2μl./反应管：50μL体系模板量4/反应管：10μL体系模板量5μL/反应管，7.2.2.3检测前在洁净区按比例分别加入PCR试剂，同时带人样品区待用。7.2. 3FCR操作
7.2.3.1对每份样品用单独的枪头定量吸取待测模板，待测模板除抽提的样品DNA外同时设阳性对照，阴性对照和以无菌双蒸水为模板的空白对照。分别将各模板溶液加创各支PCR反应预混物中，盖严管盖（样品区成）。
7.2.3.2将PCR管带入扩增区,PCR管在手掌型离心机上离心1s~2s，放人PCR仪中，盖上PCR议仪。首先行预热反应90℃2min，再按以下程序逊行扩增反应：94℃1min.52℃1min，72%1.5min.35个循环，72℃延伸10min。4℃保温（扩增区完成）。7. 2. 4 PCR 产物的分析
按照SC/17202.2—2007中7.1.5～7.1.8的规定执行，7.2.5PCR产物序列测定
ICR产物可以用引物F1和R1过行序列测定，以判断该列的正确性。中华绒整蟹螺原体R检测产物序列参见附录人。
7. 2. 6结果判定
7.2.6.1阳性对照在246bp处会有一条特定条带山现（参见图8.1lane2);阴性对照在246bp处不出3
-iiiKwcutKAca
SC/T 7220—2015
现条悼（象见图B.llane3~5），以无菌水为模极设立的空白对照不出现任例条带（参见图B.11aic6），阳性对照在246bp处无特定条带出现或阴性对照在216bp处有条传出现都表明PCR失败，应在排除故障利清除污染后重新取样检测。7.2.6.2样品的电泳结果参照阳性对照和阴性对照进行判读：在246hp处有条带出现，衣示样品检测FCR结果为阳性；在246bp处无条带出现，表示样品检测结果PCR为阴性。7.2.6.3阳性结渠经过测序验证其正确性后，表明被检测样品中存在中华绒整螺原体的DNA，附录
(资料性附录)
螺原体PCRF1/R1扩增的产物序列螺原体PCRF1/R1扩增的产物序列如下：SC/T7220—2015
GATCAATCAATTGGTTTAAATAACCAAAGGTTTTTTTGTTTTGAGAATCATTTACAAAIAAATAACTGTGAAATTTCAGTTTTAAAAGTTAATTTTAAAAATAACAGAAATTTGAITGTTAATTTGTTATATAAATAAATTTATATAACTAGATGTCTATTAICCAGTTTTCAAAGAACAATTCATAGTAATTTAAAAATACTGTTTGACGAGTATTGATTTTCTTACTATCTGAGAGAACTAACC-iiiKwcutKAca
SC/T7220—2015
附录B
（资料性附录）
中华绒螯蟹螺原体特异性PCR琼脂糖电泳图中华绒整蟹螺原体特性PCR琼脂糖电泳图见图B.12.000
说明：
阳性结果；
阴性结果；
空白对照：
DNAMark
中华绒螯蟹螺原体特异性PCR琼脂糖电泳图
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中华人民共和国水产行业标准
SC/T7220—2015
中华绒螯蟹螺原体PCR检测方法
PCR detection method of Spiroplasma eriocheiris2015-02-09发布
2015-05-01实施
中华人民共和国农业部
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由农业部渔业渔政管理局提出，本标准由全国水产标准化技术委员会SAC/TC156)归日1。本标淮起草单位：南京师范大学。本标准主要起草人：王文、孟庆国、顾伟、吴霆、李文杰、仟乾、丁正峰SC/T 7220—2015
SC/T 72202015
本文件的发布机构提消注意如1下事实，市明符合本义件时，可能涉及7.2中华绒螯螺原体PCR检测与《螺原体病原微生物的PCR快速检测技术》（专利号：ZL200510041005X)等相关的专利的使用。
本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范用无任仰文场：该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任仰中请人在合理且无歧视的条款利条件下，就专利授权许川进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案，相关信息以通过以下联系力武获得：
专利持有人：南京师范大学
地址：江苏省南京市文苑路丨号南京师范大学生命科学学院请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
1范围
中华绒整蟹螺原体PCR检测方法
本标准规定了对中华绒螯蟹爆原体病原分离、纯化以及PCR检测的方法。SC/T 7220--2015
本标准适用于中华绒螯蟹等水生P壳动物（包括中华绒整蟹Eriocheirzinzensis、凡纳滨对邮虾Litopenaeuswunnumei，克氏原整虾Procanbaruxctarkii罗沼虾Macrobrachiunrusenhergii，下文均是以中华绒擎为对象)中华绒整蟹螺原体感染的流行病学调查、检疫和监测。2规范性引用文件
下列文件对丁本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引文件，仪注日期的版本适用本文件。凡是不注口期的引刃文件，其最新版本（包括所有的修改单）适川丁本文件。SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范SC/T7202.2—2007斑节对虾杆状病壶（MBV)病诊断规程第2部分：PCR检测方法3术语和定义
下列术语和定义适用丁术文作。3.1
中华绒鳌蟹螺原体spiroplasma eriocheiris具有体利小（可以滤过0.22um孔径滤膜）、会运动、有螺旋结构、没有细胞壁，可以用人上培养基培养等特征。该病原侵染中华绒螯蟹血淋凹细跑后在其内大量繁殖形战包涵体，该病原还广泛侵染中华绒整蟹机体内所有器官（包括鳃、心脏、肝胰腺、肌肉、神经、消化道等）的结缔组织。螺原休侵染神经时、可以引起宿主附肢颤抖，最终导效被感染宿主死亡。4试剂和材料
4.1Clhelex-100悬浊液(5%):称取5.0g(Chclcx-100混于100ml.去离子水中,常温保存。4.2酒精：100%，分析纯。
4.3蛋H酶K:20 mg/mls,
4.4DL.2000DNA分子量标准。
4.5溴化乙锭(EB)：10 mg/ml.。4.6琼胎糖：电泳级，
4.7dNTP;10mmol/L，含dATP、dTIP,tCTP.dGTP各10 mmol/L的混合物，20℃保存。4.8TagDNA疑合酶:5UJ/al,—20℃保存。4.910×PCR缓冲液：-20℃保存。4.105XTBE电泳缓冲液。
4.116×上样缓冲液。
4. 12 引物 FI: 5'- GATCAATCAATTGGTTTA 3,R1:$'- GGTIAGTTCTCICAGATAGTA-AGAA~3用无菌去离了水配制成10μmoi/L，一20℃保存，用以扩增中华绒整螺原体16srRNA23rRNAx序列
4.130.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS。-iiiKwcutKAca
SC/T7220—2015
4.14R2液体培养基：2.5gH13.8g糖，加双水至84mL.121℃高压灭菌20min；15ml.胎牛血清(56℃火活0.5h）1mL酚红，100mg青霉素，0.22um滤器过滤灭菌；高ltK菌部分冷却至50℃以下与过滤火菌部分混匀即得100ml.R2液体培养基4.15阳性对照为已感染+华绒整蟹螺原体且中华绒整蟹螺原体分离培养和PCR结果显示阳性的中华绒鳌肌闪组织提取的DNA，一20℃保存，4.16阴性对照为已知未感染中华绒螯蟹螺原体直中华绒整蟹螺原体分离培养和1R结果显示阴性的中华绒螯蟹肌肉组织提取的DNA，一20℃保存。5仪器设备
5. 1医用子、医用解剂刀,医用剪刀，5.21 ml. -饮性注射器。
5.3台式尚高速离心机：最高转速可达12000r/min以l5.4拉温培养箱：能满足30℃要求。5.5普通冰箱：具有冷藏箱，一18℃以下冷冻箱体。5.6微量移液器：量程0.1l~2.5uL1~10uL、2μl.~20u20μl~200gL、100l~1000μL5.7微量离心管：1.5mL.
5. 8 PCR 仪。
5.9电泳仪和水平电泳槽：输出直流电压0V~600V。5.10凝胶成像仪。
5.11水浴锅或者金属浴，
5.12薇波炉。
5. 13 PCR管:0. 2 mL
5.14滤器：0.22um
5.15涡旋振荡器。
6采样
采样数量、运输以及保存按SC/T7103的规定执行。中华绒整蟹体表月70%酒精消毒，用1ml一次性注射器抽敢第步足基部的而淋巴液，与两倍体积的PBS缓冲液混匀后用0.22um孔径滤器过滤，滤液用于中华绒整蟹螺原体的分离培养；而后用尤菌剪刀剪取中华绒整蟹一条步足，去掉外壳后，取肌肉约(.1g用于DNA提取。中华绒整蟹以外的水生甲壳动物取样方法类似。7检测方法
7.1中华绒警蟹螺原体分离、培养7.1.1待测个体体表70%酒精消毒，1mL.一次性注射器抽取血淋巴液与火菌处理后的PBS缓冲液1：2体积比混勾。
7.1.2、将」述混勾的恤淋巴液通过0.22m孔径滤器，收集滤过液。7.1.3将工述滤液50l.无菌接种至1ml.R2液体培养基，30℃恒温培养20d，7.1.4逐日观察培养基颜色变化.培养基颜色由红变黄且澄清透明，可初步判断为华绒整蟹螺原体阳性；若恒温培养1以+培养基仍无颜色变化，可判断待测样品为中华绒整蟹螺源体阴性。7.1.5分离培养物PR检测;见 7.2.2
7.2PCR检测
7.2.1DNA模板的提取
SC/T 7220--2015
7.2.1.1取所检测动物肌肉组织一小块（约0.1g）切谛转移到火菌的1.5mT.微量离心管中（分离培养物PCR检测时，取分离培养物1mL.100001/nin离心10min取样）。7.2.1.2用200ul.5%的chclcx-100悬浊液重悬，加人5L（20mg/mL）的蛋白酶K溶液，涡旋振荡器混合均勾后56℃水浴锅孵育，期问不断颠倒混勺。如1.5h后仍见落液浑浊，可再补加相同浓度蛋凹酶K溶液2混台均勾后继续孵育，2h时观察溶液的游浊程度。如果澄清，则取出进行下一步的实验；若仍然显示浑浊状态，延长孵育时间到2.5h。7.2.1.3颠倒混匀，转移至98℃水浴锅内孵育8min，7.2.1.4颠倒混匀4℃，12000r/min离心30min，7.2.1.5离心后的上清液转移到新的1.5mL火菌Eppendorf管巾中.此上消液即需要迹行IPCR鉴定的IDNA的溶液。
7.2.2PCK反应体系的准备
7.2.2.1PCR反应休系的准备必须在洁净的区域完成。7.2. 2.2PCR反应体系中使用引物 F1和 R1,模板为提取的样品 DNA.其反应预混物见表1。表1100份PCR反应预混物所需试剂组成试剂
10×PCR缓冲液（无Mg／）
MgCl, (25 mmol/L)
NIP(10mmol/L)
10 μmcl/ L[物 F]
10 μmal/1.引物 RI
灭菌双蒸水
TagINA合酶（5U/L）
25μl.体系
250μl
50 m体系
300μL
500叫
Ioul.体系
200 μL
I o uL
试剂终激度
1. 5 mmoi/ L
0. 2 mmal/L
1 prtnol/1
1 yumol/1.Www.bzxZ.net
注：23体系模板量2μl./反应管：50μL体系模板量4/反应管：10μL体系模板量5μL/反应管，7.2.2.3检测前在洁净区按比例分别加入PCR试剂，同时带人样品区待用。7.2. 3FCR操作
7.2.3.1对每份样品用单独的枪头定量吸取待测模板，待测模板除抽提的样品DNA外同时设阳性对照，阴性对照和以无菌双蒸水为模板的空白对照。分别将各模板溶液加创各支PCR反应预混物中，盖严管盖（样品区成）。
7.2.3.2将PCR管带入扩增区,PCR管在手掌型离心机上离心1s~2s，放人PCR仪中，盖上PCR议仪。首先行预热反应90℃2min，再按以下程序逊行扩增反应：94℃1min.52℃1min，72%1.5min.35个循环，72℃延伸10min。4℃保温（扩增区完成）。7. 2. 4 PCR 产物的分析
按照SC/17202.2—2007中7.1.5～7.1.8的规定执行，7.2.5PCR产物序列测定
ICR产物可以用引物F1和R1过行序列测定，以判断该列的正确性。中华绒整蟹螺原体R检测产物序列参见附录人。
7. 2. 6结果判定
7.2.6.1阳性对照在246bp处会有一条特定条带山现（参见图8.1lane2);阴性对照在246bp处不出3
-iiiKwcutKAca
SC/T 7220—2015
现条悼（象见图B.llane3~5），以无菌水为模极设立的空白对照不出现任例条带（参见图B.11aic6），阳性对照在246bp处无特定条带出现或阴性对照在216bp处有条传出现都表明PCR失败，应在排除故障利清除污染后重新取样检测。7.2.6.2样品的电泳结果参照阳性对照和阴性对照进行判读：在246hp处有条带出现，衣示样品检测FCR结果为阳性；在246bp处无条带出现，表示样品检测结果PCR为阴性。7.2.6.3阳性结渠经过测序验证其正确性后，表明被检测样品中存在中华绒整螺原体的DNA，附录
(资料性附录)
螺原体PCRF1/R1扩增的产物序列螺原体PCRF1/R1扩增的产物序列如下：SC/T7220—2015
GATCAATCAATTGGTTTAAATAACCAAAGGTTTTTTTGTTTTGAGAATCATTTACAAAIAAATAACTGTGAAATTTCAGTTTTAAAAGTTAATTTTAAAAATAACAGAAATTTGAITGTTAATTTGTTATATAAATAAATTTATATAACTAGATGTCTATTAICCAGTTTTCAAAGAACAATTCATAGTAATTTAAAAATACTGTTTGACGAGTATTGATTTTCTTACTATCTGAGAGAACTAACC-iiiKwcutKAca
SC/T7220—2015
附录B
（资料性附录）
中华绒螯蟹螺原体特异性PCR琼脂糖电泳图中华绒整蟹螺原体特性PCR琼脂糖电泳图见图B.12.000
说明：
阳性结果；
阴性结果；
空白对照：
DNAMark
中华绒螯蟹螺原体特异性PCR琼脂糖电泳图
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