GB 4789.6-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验 GB4789.6-2016 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国国家标准
GB4789.6—2016
食品安全国家标准
食品微生物学检验
致泻大肠埃希氏菌检验
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局
GB4789.6—2016
本标准代替GB/T4789.6—2003《食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》。
本标准与GB/T4789.6—2003相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准食品微生物学检验
增加了术语和定义、缩略语；
——增加了血清学试验中H抗原鉴定；一增加了PCR确认试验；
增加了附录A；
修改了设备和材料；
修改了培养基和试剂；
—修改了检验程序；
致泻大肠埃希氏菌检验”；
一修改了血清学试验中致泻大肠埃希氏菌所包括的○抗原群；删除了肠毒素试验。
1范围
食品安全国家标准
食品微生物学检验
致泻大肠埃希氏菌检验
GB4789.6—2016
本标准规定了食品中致泻大肠埃希氏菌（diarrheagenicEscherichiacoli）的检验方法。本标准适用于食品中致泻大肠埃希氏菌的检验。2术语和定义、缩略语
2.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。2.1.1致泻大肠埃希氏菌DiarrheagenicEscherichiacoli一类能引起人体以腹症状为主的大肠埃希氏菌，可经过污染食物引起人类发病。常见的致泻天肠埃希氏菌主要包括肠道致病性大肠埃希氏菌、肠道侵袭性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、产志贺毒素大肠埃希氏菌（包括肠道出血性大肠埃希氏菌）和肠道集聚性大肠埃希氏菌。2.1.2肠道致病性大肠埃希氏菌EnteropathogenicEscherichiacoli能够引起宿主肠黏膜上皮细胞黏附及擦拭性损伤，且不产生志贺毒素的大肠埃希氏菌。该菌是婴幼儿腹泻的主要病原菌，有高度传染性，严重者可致死。2.1.3肠道侵袭性大肠埃希氏菌EnteroinvasiveEscherichiacoli能够侵人肠道上皮细胞而引起痢疾样腹泻的大肠埃希氏菌。该菌无动力、不发生赖氨酸脱羧反应、不发酵乳糖，生化反应和抗原结构均近似疾患贺民菌。侵入上皮细胞的关键基因是侵袭性质粒上的抗原编码基因及其调控基因，如ipaH基因、ipaR基因（又称为inuE基因）。2.1.4产肠毒素大肠埃希氏菌EnterotoxigenicEscherichiacoli能够分泌热稳定性肠毒素或/和热不稳定性肠毒素的大肠埃希氏菌。该菌可引起婴幼儿和旅游者腹泻，一般呈轻度水样腹泻，也可呈严重的霍乱样症状，低热或不发热。腹泻常为自限性，一般2d～3d即自愈。
2.1.5产志贺毒素大肠埃希氏菌Shigatoxin-producingEscherichia coli（肠道出血性大肠埃希氏菌EnterohemorrhagicEscherichia coli)能够分泌志贺毒素、引起宿主肠黏膜上皮细胞黏附及擦拭性损伤的大肠埃希氏菌。有些产志贺毒素大肠埃希氏菌在临床上引起人类出血性结肠炎（HC)或血性腹泻，并可进一步发展为溶血性尿毒综合征（HUS），这类产志贺毒素大肠埃希氏菌为肠道出血性大肠埃希氏菌1
2.1.6肠道集聚性大肠埃希氏菌EnteroaggregativeEscherichiacoliGB4789.6—2016
肠道集聚性大肠埃希氏菌不侵人肠道上皮细胞，但能引起肠道液体蓄积。不产生热稳定性肠毒素或热不稳定性肠毒素，也不产生志贺毒素。唯一特征是能对Hep-2细胞形成集聚性黏附，也称Hep-2细胞黏附性大肠埃希氏菌。
2.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
2.2.1DEC:致泻大肠埃希氏菌DiarrheagenicEscherichia coli2.2.2EPEC：肠道致病性大肠埃希氏菌EnteropathogenicEscherichia coliEIEC：肠道侵袭性大肠埃希氏菌EnteroinvasiveEscherichia coli2.2.3
ETEC：产肠毒素大肠埃希氏菌EnterotoxigenicEscherichiacoli2.2.4
STEC：产志贺毒素大肠埃希氏菌Shigatoxin-producingEscherichia coli2.2.5
EHEC：肠道出血性大肠埃希氏菌EnterohemorrhagicEscherichia coliEAEC：肠道集聚性大肠埃希氏菌EnteroaggregativeEscherichiacoliescV：蛋白分泌物调节基因，geneencodingLEE-encodedtypeIlsecretionsystemfactoneae：紧密素基因.gene encoding intimin forEscherichia coliattachingand effacingbfpB：束状菌毛B基因，bundle-formingpilusB；2.2.10
stal：志贺毒素I基因，Shigatoxinonestr2：志贺毒素Ⅱ基因，Shigatoxintwolt：热不稳定性肠毒素基因，heat-labileenterotoxinst：热稳定性肠毒素基因，heat-stableenterotoxinstp（stIa）：猪源热稳定性肠毒素基因，heat-stableenterotoxinsinitiallydiscoveredintheisolates from pigs
sth（stIb）：人源热稳定性肠毒素基因，heat-stableenterotoxins initiallydiscoveredintheisolates from human
invE：侵袭性质粒调节基因，invasiveplasmidregulatoripaH：侵袭性质粒抗原H基因，invasiveplasmidantigenH-geneaggR：集聚黏附菌毛调节基因，aggregativeadhesivefimbriaeregulator2.2.19
uidA：β-葡萄糖苷酶基因.β-glucuronidasegene2.2.20
astA：集聚热稳定性毒素A基因，enteroaggregativeheat-stableenterotoxinA2.2.21
pic：肠定植因子基因，proteininvolved inintestinal colonizationLEE：肠细胞损伤基因座，Locus ofenterocyteeffacementEAF：EPEC黏附因子，EPECadhesivefactor2.2.24
3设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱：36℃±1℃，42℃土1℃。3.1
冰箱:2℃~5℃。
恒温水浴箱：50℃士1℃，100℃或适配1.5mL或2.0mL金属浴（95℃~100℃）。电子天平：感量为0.1g和0.01g。3.4
显微镜：10×~100×。
均质器。
振荡器。
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无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）.10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。无菌均质杯或无菌均质袋：容量500mL。3.10
无菌培养皿：直径90mm。
pH计或精密pH试纸。
微量离心管：1.5mL或2.0mL。
接种环：1μL。
低温高速离心机：转速≥13000r/min，控温4℃～8℃。微生物鉴定系统
PCR仪。
微量移液器及吸头：0.5uL~2μL，2μL~20μL，20μL~200μL.200μL~1000μL。水平电泳仪：包括电源、电泳槽、制胶槽（长度>10cm）和梳子。8联排管和8联排盖（平盖/凸盖）。凝胶成像仪
培养基和试剂
营养肉汤：见A.1。
肠道菌增菌肉汤：见A.2。
麦康凯琼脂（MAC）：见A.3。
伊红美蓝琼脂（EMB)：见A.4。
三糖铁（TSI)琼脂：见A.5。
蛋白陈水、靛基质试剂：见A.6。半固体琼脂：见A.7。
尿素琼脂（pH7.2）：见A.8。
氰化钾(KCN)培养基：见A.9。
氧化酶试剂：见A.10。
革兰氏染色液：见A.11。
BHI肉汤：见A.12。
福尔马林（含38%～40%甲醛）。鉴定试剂盒。
大肠埃希氏菌诊断血清。
灭菌去离子水。
0.85%灭菌生理盐水。
TE(pH8.0).见A.13。
10XPCR反应缓冲液：见A.14。
25mmol/LMgCl2
dNTPs：dATP，dTTP.dGTP.dCTP每种浓度为2.5mmol/L。5 U/L Taq酶。
引物。
50XTAE电泳缓冲液：见A.15。
琼脂糖。
溴化乙锭（EB)或其他核酸染料
6×上样缓冲液：见A.16。
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Marker:分子量包含100bp.200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1500bp条带
致泻大肠埃希氏菌PCR试剂盒。
检验程序
致泻大肠埃希氏菌检验程序见图1。检样
25g(或25 ml)样品一养闪渐225 ml.36 ℃+1℃, 6 h
肠道菌塔菌肉汤
42 ±[ t, 18
MAC和EM玩股
36 C±1 , 18b~24 b
挑取乳挞发酵和不发的菌落10个以.上TNl,髋基质，尿素(p.2)，kN
TST底层1，S，能质，尿，KCN
PCR确认试验
血清学试验
致泻大肠埃希氏菌检验程序
6操作步骤
6.1样品制备
6.1.1固态或半固态样品
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固体或半固态样品，以无菌操作称取检样25g，加入装有225mL营养肉汤的均质杯中，用旋转刀片式均质器以8000r/min10000r/min均质1min～2min；或加人装有225mL营养肉汤的均质袋中，用拍击式均质器均质1min~2min。6.1.2液态样品
以无菌操作量取检样25mL，加入装有225mL营养肉汤的无菌锥形瓶（瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠），振荡混匀。
6.2增菌
将6.1制备的样品匀液于36℃土1℃培养6h。取10μL，接种于30mL肠道菌增菌肉汤管内，于42℃±1℃培养18h。
6.3分离
将增菌液划线接种MAC和EMB琼脂平板，于36℃土1℃培养18h～24h，观察菌落特征。在MAC琼脂平板上，分解乳糖的典型菌落为砖红色至桃红色，不分解乳糖的菌落为无色或淡粉色；在EMB琼脂平板上，分解乳糖的典型菌落为中心紫黑色带或不带金属光泽，不分解乳糖的菌落为无色或淡粉色。
6.4生化试验
6.4.1选取平板上可疑菌落10个~20个（10个以下全选），应挑取乳糖发酵，以及乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落，分别接种TSI斜面。同时将这些培养物分别接种蛋白陈水、尿素琼脂（pH7.2和KCN肉汤。于36℃±1℃培养18h～24h。6.4.2TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，靛基质阳性，H,S阴性和尿素酶阴性的培养物为大肠埃希氏菌。TSI斜面底层不产酸，或H,S、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。必要时做革兰氏染色和氧化酶试验。大肠埃希氏菌为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阴性。6.4.3如选择生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统，可从营养琼脂平板上挑取经纯化的可疑菌落用无菌稀释液制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统进行鉴定6.5PCR确认试验
6.5.1取生化反应符合大肠埃希氏菌特征的菌落进行PCR确认试验。注：PCR实验室区域设计、工作基本原则及注意事项应参照《疾病预防控制中心建设标准》（建标127—2009)和国家卫生和计划生育委员会（原卫生部）（2010)《医疗机构临床基因扩增管理办法》附录（医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则）
6.5.2使用1uL接种环刮取营养琼脂平板或斜面上培养18h24h的菌落，悬浮在200μL0.85%灭菌生理盐水中，充分打散制成菌悬液，于13000r/min离心3min，弃掉上清液。加人1mL灭菌去离子水充分混勾菌体，于100℃水浴或者金属浴维持10min；冰浴冷却后，13000r/min离心3min，收集上清液；按1：10的比例用灭菌去离子水稀释上清液，取2μL作为PCR检测的模板；所有处理后的DNA5
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模板直接用于PCR反应或暂存于4℃并当天进行PCR反应：否则·应在一20℃以下保存备用（1周内）。也可用细菌基因组提取试剂盒提取细菌DNA，操作方法按照细菌基因组提取试剂盒说明书进行。6.5.3每次PCR反应使用EPEC、EIEC、ETEC、STEC/EHEC、EAEC标准菌株作为阳性对照。同时，使用大肠埃希氏菌ATCC25922或等效标准菌株作为阴性对照，以灭菌去离子水作为空白对照，控制PCR体系污染。致泻大肠埃希氏菌特征性基因见表1。表1五种致泻大肠埃希氏菌特征基因致泻大肠埃希氏菌类别
STEC/EHEC
特征性基因
escV或eae,bfpB
escV或eaesstrl,str2
invE或ipaH
lt、stp、sth
astA.aggR.pic
6.5.4PCR反应体系配制。每个样品初筛需配置12个PCR扩增反应体系，对应检测12个目标基因，具体操作如下：使用TE溶液（pH8.0）将合成的引物干粉稀释成100umol/L储存液。根据表2中每种目标基因对应PCR体系内引物的终浓度，使用灭菌去离子水配制12种目标基因扩增所需的10X引物工作液（以uidA基因为例，如表3）。将10X引物工作液、10XPCR反应缓冲液、25mmol/LMgCl.2.5mmol/LdNTPs、灭菌去离子水从一20℃冰箱中取出，融化并平衡至室温，使用前混匀；5U/uLTag酶在加样前从一20℃冰箱中取出。每个样品按照表4的加液量配制12个25μL反应体系，分别使用12种目标基因对应的10×引物工作液。表2五种致泻大肠埃希氏菌目标基因引物序列及每个PCR体系内的终浓度引物
uidA-F
uidA-R
esev-F
escV-R
eae-Ra
bfpB-F
引物序列
5'-ATG CCA GTC CAG CGT
TTTTGC-3'
5'-AAA GTG TGG GTC AAT
AAT CAG GAA GTG-3'
5'-ATT CTG GCT CTC TTC
TTCTTTATGGCTG-3'
5-CGTCCCCTT TTACAA
ACT TCA TCG C-3'
5-ATTACCATCCACACA
GAC GGT-3'
5ACAGCGTGGTTGGAT
CAA CCT-3'
5'GAC ACC TCA TTG CTG
AAGTCG3
菌株编号及对应
Genbank编码
Escherichia coli
DH1Ec169 (accession no.
CP012127.1)
Escherichia coli
E2348/69(accession no.
FM180568.1)
EHEC (accession no.
Z11541.1)
Escherichia coli
E2348/69(accession
no.FM180569.1)
引物所在位置
1673870-1673890
1675356-1675330
4122765-4122738
4122222-4122246
2651-2671
3047-3027
3796-3816
终浓度n
(μmol/L)
PCR产物
长度（bp）
bfpB-R
str1-F
sta1-R
star2-F
str2-R
inoE-F
ipaH-F
引物序列
5'-CCA GAA CAC CTC CGT
TATGC-3
5'-CGA TGT TAC GGT TTG
TTA CTG TGA CAG C-3'
5'-AAT GCC ACG CTT CCC
AGAATTG3”
5'-GTT TTG ACC ATC TTC
GTC TGA TTA TTG AG-3
5'-AGC GTA AGGCTTCTG
CTG TGA C-3*
5'-GAA CAG GAG GTT TCT
GCG TTA GGT G-3
5'-CTT TCA ATGGCT TTT
TTT TGG GAG TC-3'
5'-CCT CTT TTA GYC AGA
CAR CTG AAT CAS TTG-3'
5'-CAG GCA GGA TTA CAA
CAA AGT TCA CAG-3\
5'-TGT CTT TTT CAC CTT
TCGCTC-3'
5-CGG TAC AAG CAG GAT
TAC AACAC-3'
5'-CGA TAG ATG GCG AGA
AATTATATCCCG3'
5°-CGA TCAAGAATC CCT
AAC AGA AGA ATC AC-3'
5-TTGACCGCCTTTCCG
ATACC-3'
表2（续）
菌株编号及对应
Genbank编码
Escherichia coli
EDL933 (accession no.
AE005174.2)
Escherichia coli
EDL933 (accession no.
AE005174.2)
Escherichia coli
E24377A (accession no.
CP000795.1)
Escherichia coli EC2173
(accessionno.
AJ555214.1)//
Escherichia coli F7682
Caccession no.
AY342057.1)
Escherichia coli
E24377A(accession
no.CP000795.1)
Escherichia coli
serotypeO164
(accessionno.
AF283289.1)
Escherichia coli 53638
(accession no.
CP001064.1)
引物所在位置
4702-4683
2996445-2996418
2996202-2996223
1352543-1352571
1352866-1352845
17030-17054
17684-17659
1979-1950///14-43
1823-1849///170-144
11389-11409
11559-11537
921-895
156-184
11471-11490
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终浓度n
(μmol/L)
PCR产物
长度(bp）
ipaH-R
aggR-F
aggR-R
astA-F
astA-R
rDNA-F
引物序列：
5'-ATCCGCATCACCGCT
CAGAC-3\
5'-ACG CAG AGT TGC CTG
ATAAAG-3
5'-AAT ACA GAA TCG TCA
GCA TCA GC-3*
5'-AGC CGT TTC CGC AGA
AGCC-3*
5'-AAA TGTCAG TGAACC
GAC GAT TGG-3'
5'-TGC CAT CAA CAC AGT
ATATCCG-3
5'-ACG GCT TTG TAG TCC
TTCCAT-3*
5°'-GGA GGC AGC AGT GGG
AATA-3?
5'-TGA CGG GCG GTG TGT
ACAAG-3*
*escV和eae基因选作其中一个；binvE和ipaH基因选作其中一个；表2（续）
菌株编号及对应
Genbank编码
Escherichia coli
enteroaggregative17-2
(accessionno,Z18751.1)
Escherichia coli 042
(accessionno.
AF097644.1)
Escherichia coli
ECOR 33 (accession
no.AF161001.1)
Escherichia coli strain
ST2747 (accession no.
CP007394.1)
表中不同基因的引物序列可采用可靠性验证的其他序列代替表3
引物名称
引物所在位置
12117-12098
458-436
3700-3682
2590-2613
103-83
149585-149603
150645-150626
每种目标基因扩增所需10×引物工作液配制表体积/μL
100μmol/LuidA-F
100 μmol/LuidA-R
灭菌去离子水
总体积
注：n
每条引物在反应体系内的终浓度（详见表2)。10Xn
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终浓度n
(μmol/L）
1002X（10Xn）
PCR产物
长度(bp)）
表4五种致泻大肠埃希氏菌目标基因扩增体系配制表试剂名称
灭菌去离子水
10×PCR反应缓冲液
25mmol/LMgCl2
2.5mmol/LdNTPs
10×引物工作液
5U/μLTag酶
DNA模板
总体积
加样体积/L
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6.5.5PCR循环条件。预变性94℃5min；变性94℃30s，复性63℃30s，延伸72℃1.5min，30个循环；72℃C延伸5min。将配制完成的PCR反应管放人PCR仪中，核查PCR反应条件正确后，启动反应程序。
6.5.6称量4.0g琼脂糖粉，加入至200mL的1XTAE电泳缓冲液中，充分混匀。使用微波炉反复加热至沸腾，直到琼脂糖粉完全融化形成清亮透明的溶液。待琼脂糖溶液冷却至60℃左右时，加人溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5μg/mL，充分混匀后，轻轻倒入已放置好梳子的模具中，凝胶长度要大于10cm.厚度宜为3mm~5mm。
检查梳齿下或梳齿间有无气泡用一次性吸头小心排掉琼脂糖凝胶中的气泡。当琼脂糖凝胶完全凝结硬化后，轻轻拨出梳子，小心将胶块和胶床放入电泳槽中，样品孔放置在阴极端。向电泳槽中加人1XTAE电泳缓冲液，液面高于胶面1mm~2mm。将5μLPCR产物与1L6×上样缓冲液混匀后，用微量移液器吸取混合液垂直伸人液面下胶孔，小心上样于孔中；阳性对照的PCR反应产物加人到最后一个泳道；第一个泳道中加入2μL分子量Marker。接通电泳仪电源，根据公式：电压=电泳槽正负极间的距离（cm）X5V/cm计算并设定电泳仪电压数值：启动电压开关：电泳开始以正负极铂金丝出现气泡为准。电泳30min～45min后，切断电源。取出凝胶放人凝胶成像仪中观察结果，拍照并记录数据。6.5.7结果判定。电泳结果中空白对照应无条带出现，阴性对照仅有uidA条带扩增，阳性对照中出现所有目标条带，PCR试验结果成立。根据电泳图中目标条带大小，判断目标条带的种类，记录每个泳道中目标条带的种类，在表5中查找不同目标条带种类及组合所对应的致泻大肠埃希氏菌类别。5五种致泻大肠埃希氏菌目标条带与型别对照表表5
致泻大肠埃希氏菌类别
STEC/EHEC
目标条带的种类组合
aggR，astA，pic中一条或一条以上阳性bfpB(+/-).escV(+).str1—),str2(-)eseV(+/-),str1(+),str2(—).bfpB(-)escV(+/—).strl().str2(+),bfpB(-)escV(+/-).str1(+).str2(+).bfpB(-)lt,stp,sth中一条或一条以上阳性invE(+)
★在判定EPEC或SETC/EHEC时，escV与eae基因等效；在判定EIEC时，inE与ipaH基因等效。97%以上大肠埃希氏菌为uidA阳性。uidA(+/-)
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6.5.8如用商品化PCR试剂盒或多重聚合酶链反应（MPCR)试剂盒，应按照试剂盒说明书进行操作和结果判定。
血清学试验（选做项目）
6.6.1取PCR试验确认为致泻大肠埃希氏菌的菌株进行血清学试验。注：应按照生产商提供的使用说明进行O抗原和H抗原的鉴定。当生产商的使用说明与下面的描述可能有偏差时，按生产商提供的使用说明进行。6.6.20抗原鉴定
6.6.2.1假定试验：挑取经生化试验和PCR试验证实为致泻大肠埃希氏菌的营养琼脂平板上的菌落根据致泻大肠埃希氏菌的类别，选用大肠埃希氏菌单价或多价OK血清做玻片凝集试验。当与某一种多价OK血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价OK血清做凝集试验。致泻大肠埃希氏菌所包括的O抗原群见表6。如与某一单价OK血清呈现凝集反应，即为假定试验阳性6.6.2.2证实试验：用0.85%灭菌生理盐水制备O抗原悬液，稀释至与MacFarland3号比浊管相当的浓度。原效价为1：160~1：320的0血清，用0.5%盐水稀释至1：40。将稀释血清与抗原悬液于10mm×75mm试管内等量混合，做单管凝集试验。混勾后放于50℃士1℃水浴箱内，经16h后观察结果。如出现凝集，可证实为该〇抗原表6致泻大肠埃希氏菌主要的0抗原DEC类别
STEC/EHEC
6.6.3H抗原鉴定
DEC主要的O抗原bzxz.net
026O55086011labO11401190125acO127O128ab01420158等040260450910103010401110113012101280157等028ac0290112ac011501240135013601430144015201640167等06011015020025026027063078085011401150128ac01480149015901660167等
0906207301010134等
6.6.3.1取菌株穿刺接种半固体琼脂管，36℃土1℃培养18h24h，取顶部培养物1环接种至BH1液体培养基中，于36℃士1℃培养18h～24h。加人福尔马林至终浓度为0.5%，做玻片凝集或试管凝集试验。
6.6.3.2若待测抗原与血清均无明显凝集，应从首次穿刺培养管中挑取培养物，再进行2次～3次半固体管穿刺培养.按照6.6.3.1进行试验7结果报告
7.1根据生化试验、PCR确认试验的结果，报告25g（或25mL)样品中检出或未检出某类致泻大肠埃希氏菌。
7.2如果进行血清学试验，根据血清学试验的结果，报告25g（或25mL)样品中检出的某类致泻大肠埃希氏菌血清型别。
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