GB 4789.40-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验 GB4789.40-2016 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国国家标准
GB4789.40—2016
食品安全国家标准
食品微生物学检验
克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局
GB4789.40—2016
本标准代替GB4789.402010《食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验》、
SN/T1632.1—2013《出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法第1部分：分离与计数》。
本标准与GB4789.40—2010相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准菌)检验”；
一修改了可疑菌落的挑取数量。食品微生物学检验
克罗诺杆菌属（阪崎肠杆
1范围
食品安全国家标准
食品微生物学检验
克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验本标准规定了食品中克罗诺杆菌属（Cronobacter）的检验方法。本标准适用于婴幼儿配方食品、乳和乳制品及其原料中克罗诺杆菌属的检验设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱：25℃±1℃36℃±1℃，44℃±0.5℃。2.1
冰箱：2℃～5℃。
恒温水浴箱：44℃土0.5℃。
天平：感量0.1g。
均质器。
振荡器。
GB4789.40—2016
无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头无菌锥形瓶：容量100mL、200mL、2000mL。无菌培养Ⅲl：直径90mm。
pH计或pH比色管或精密pH试纸
全自动微生物生化鉴定系统。
培养基和试剂
缓冲蛋白陈水（bufferpeptonewater，BPW）：见A.1。3.1
改良月桂基硫酸盐胰蛋白陈肉汤-万古霉素（modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycin3.2
medium,mLST-Vm)：见A.2。
阪崎肠杆菌显色培养基。
胰蛋白陈大豆琼脂（trypticasesoyagar，TSA）：见A.3。3.4
生化鉴定试剂盒。
氧化酶试剂：见A.4。
3.7L-赖氨酸脱羧酶培养基：见A.5。3.8L-鸟氨酸脱羧酶培养基：见A.6。3.9L-精氨酸双水解酶培养基：见A.7。糖类发酵培养基：见A.8。
西蒙氏柠檬酸盐培养基：见A.9。1
4检验程序
第一法克罗诺杆菌属定性检验
克罗诺杆菌属检验程序见图1。
检栏100g：mL：
BPW 移科液 900 mL
2 1 ,18F12h
1m萨液-msr-vmul
44 ±0. 5 ：24±2
酸橙酱杆菌显色庐养坚
36 (11 . 24h 2h
姚股频似菌游
25 c ±1 T:: 48 h±4 h
挑取黄茵落
牛花鉴元
图1克罗诺杆菌属检验程序
5操作步骤
前增菌和增菌
GB4789.40—2016
取检样100g（mL）置灭菌锥形瓶中，加人900mL已预热至44℃的缓冲蛋白陈水，用手缓缓地摇动至充分溶解.36℃1℃培养18h士2h。移取1mL转种于10mLmLST-Vm肉汤，44℃士0.5℃培养24h士2h。
5.2分离
5.2.1轻轻混匀mLST-Vm肉汤培养物，各取增菌培养物1环，分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色培养基平板，显色培养基须符合GB4789.28的要求，36℃土1℃培养24h土2h，或按培养基要求条件2
培养。
GB 4789.40—2016
5.2.2挑取至少5个可疑菌落，不足5个时挑取全部可疑菌落，划线接种于TSA平板。25℃土1℃培养48h士4h
5.3鉴定
自TSA平板上直接挑取黄色可疑菌落，进行生化鉴定。克罗诺杆菌属的主要生化特征见表1。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。表1克罗诺杆菌属的主要生化特征生化试验
黄色素产生
氧化酶
L-赖氨酸脱羧酶
L-鸟氨酸脱羧酶
L-精氨酸双水解酶
柠檬酸水解
D-山梨醇
L-鼠李糖
D-蔗糖
D蜜二糖
苦查仁武
注：十>99%阳性；一>99%阴性：（十）90%～99%阳性；（一）90%99%阴性结果与报告
综合菌落形态和生化特征，报告每100g（mL）样品中检出或未检出克罗诺杆菌属。第二法
克罗诺杆菌属的计数
7操作步骤
样品的稀释
7.1.1固体和半固体样品：无菌称取样品100g、10g、1g各三份，分别加人900mL、90mL、9mL已预热至44℃的BPW，轻轻振摇使充分溶解，制成1：10样品匀液，置36℃土1℃培养18h土2h。分别移取1mL转种于10mLmLST-Vm肉汤，44℃±0.5℃培养24h±2h。7.1.2液体样品：以无菌吸管分别取样品100mL、10mL、1mL各三份，分别加入900mL、90mL9mL已预热至44℃的BPW，轻轻振摇使充分混匀制成1：10样品匀液，置36℃土1℃培养18h土2h。分别移取1mL转种于10mLmLST-Vm肉汤，44℃士0.5℃培养24h士2h。3
分离鉴定
同5.2和5.3。
结果与报告
GB4789.40—2016
综合菌落形态、生化特征，根据证实为克罗诺杆菌属的阳性管数，查MPN检索表，报告每100g（mL)样品中克罗诺杆菌属的MPN值（见表B.1）。4
缓冲蛋白陈水（BPW）
A.1.1成分
蛋白陈
氯化钠
磷酸氢二钠（Na2HPO4，12H,O）磷酸二氢钾
蒸馏水
2制法
附录A
培养基和试剂
加热搅拌至溶解，调节pH至7.2士0.2，121℃高压灭菌15min。10.0g
1000mL
GB 4789.40—2016
改良月桂基硫酸盐胰蛋白陈肉汤-万古需素（Modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycinmediummLST-Vm）A.2
改良月桂基硫酸盐胰蛋白陈（mLST)肉汤成分
氯化钠
胰蛋白陈
磷酸二氢钾
磷酸氢二钾
十二烷基硫酸钠
蒸馏水
1000mL
加热搅拌至溶解，调节pH至6.8士0.2。分装每管10mL，121℃高压灭菌15min。A.2.2
万古霉素溶液
万古霉素
蒸馏水
A.2.2.2制法
10.0mg万古霉素溶解于10.0mL蒸馏水，过滤除菌。万古霉素溶液可以在0℃~5℃保存15d。5
GB4789.40—2016
3改良月桂基硫酸盐胰蛋白陈肉汤-万古霉素（Modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycinA.2.3
medium,mLST-Vm)
每10mLmLST加入万古霉素溶液0.1mL，混合液中万古霉素的终浓度为10μg/mL注：mLST-Vm必须在24h之内使用。A.3
胰蛋白陈大豆琼脂（TSA）
A.3.1成分
胰蛋白陈
植物蛋白陈
氯化钠
蒸馏水
1000mL
加热搅拌至溶解，煮沸1min，调节pH至7.3士0.2.121℃高压15min。A.4
氧化酶试剂
N.N,N',N'-四甲基对苯二胺盐酸盐蒸馏水
2制法
少量新鲜配制，于冰箱内避光保存，在7d之内使用。A.4.3
试验方法
用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落，涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上。如果滤纸在10s中之内未变为紫红色、紫色或深蓝色，则为氧化酶试验阴性，否则即为氧化酶实验阳性。注：实验中切勿使用镍/铬材料。A.5L-赖氨酸脱羧酶培养基
L-赖氨酸盐酸盐（L-lysinemonohydrochloride）酵母浸膏
葡萄糖
溴甲酚紫
蒸馏水
1000mL
将各成分加热溶解，必要时调节pH至6.8士0.2。每管分装5mL，121℃高压15min。6
实验方法
GB4789.40—2016
挑取培养物接种于L-赖氨酸脱羧酶培养基刚好在液体培养基的液面下。30℃士1℃培养24h土2h，观察结果。L-赖氨酸脱羧酶试验阳性者,培养基呈紫色,阴性者为黄色，空白对照管为紫色。A.6L-鸟氨酸脱羧酶培养基
A.6.1成分
L-鸟氨酸盐酸盐（L-ornithinemonohydrochloride）酵母浸膏
葡萄糖
溴甲酚紫
蒸馏水
2制法
1000mL
将各成分加热溶解，必要时调节pH至6.8士0.2。每管分装5mL。121C高压15minA.6.3
实验方法
挑取培养物接种于L-鸟氨酸脱羧酶培养基.刚好在液体培养基的液面下。30℃士1℃培养24h土2h，观察结果。L-鸟氨酸脱羧酶试验阳性者,培养基呈紫色,阴性者为黄色A.7L-精氨酸双水解酶培养基
A.7.1成分
L-精氨酸盐酸盐（L-argininemonohydrochloride）酵母浸膏
葡萄糖
溴甲酚紫
蒸馏水
2制法
1000mL
将各成分加热溶解，必要时调节pH至6.8士0.2。每管分装5mL。121℃高压15minA.7.3
实验方法
挑取培养物接种于L-精氨酸脱羧酶培养基.刚好在液体培养基的液面下。30℃土1℃培养24h土2h,观察结果。L-精氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色,阴性者为黄色A.8糖类发酵培养基
基础培养基
A.8.1.1成分
酪蛋白(酶消化)
氯化钠
蒸馏水
A.8.1.2制法
1000mL
GB4789.40—2016
将各成分加热溶解，必要时调节pH至6.8士0.2。每管分装5mL。121℃高压15min。A.8.2
糖类溶液（D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦香仁武）A.8.2.1成分
蒸馏水
A.8.2.2制法
分别称取D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁武等糖类成分各8g，溶于100mL蒸馏水中，过滤除菌，制成80mg/mL的糖类溶液。A.8.3
完全培养基
A.8.3.1成分
基础培养基
糖类溶液
A.8.3.2制法
无菌操作，将每种糖类溶液加人基础培养基，混匀；分装到无菌试管中，每管10mL。A.8.4
实验方法
挑取培养物接种于各种糖类发酵培养基，刚好在液体培养基的液面下。30℃土1℃培养24h土2h，观察结果。糖类发酵试验阳性者，培养基呈黄色，阴性者为红色A.9
西蒙氏柠檬酸盐培养基
柠檬酸钠
氯化钠
磷酸氢二钾
磷酸二氢铵
硫酸镁
溴麝香草酚蓝
蒸馏水
8.0g18.0g
1000mL
将各成分加热溶解，必要时调节pH至6.8士0.2。每管分装10mL121℃高压15min，制成斜面。8
实验方法
GB 4789.40—2016
挑取培养物接种于整个培养基斜面.36℃土1℃培养24h土2h，观察结果。阳性者培养基变为蓝色。
附录B
克罗诺杆菌属最可能数（MPN)检索表每100g（mL)检样中克罗诺杆菌属最可能数（MPN)的检索见表B.1。表B.1
克罗诺杆菌属最可能数（MPN)检索表阳性管数
95%可信限
阳性管数
注1：本表采用3个检样量[100g（mL）、10g（mL）和1gg(mL)].每个检样量接种3管www.bzxz.net
GB4789.40—2016
95%可信限
注2：表内所列检样量如改用1000ggmL）、100g（mL）和10g（mL）时，表内数字应相应降低10倍；如改用10g（mL）、1g(mL)和0.1g(mL）时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推10
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