GB 5009.24-2016 食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M族的测定 GB5009.24-2016 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国国家标准
GB5009.24—2016
食品安全国家标准
食品中黄曲霉毒素M族的测定
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局
GB5009.24—2016
本标准代替GB5413.37一2010《食品安全国家标准乳和乳制品中黄曲毒素M的测定》、GB5009.24—2010《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M和B的测定》GB/T23212—2008《牛奶和奶粉中黄曲霉毒素B、Bz、Gi、G2、M、M,的测定高效液相色谱法-荧光检测法》和SN/T16642005《牛奶和奶粉中黄曲霉毒素M、BI、B2、GI、Gz含量的测定》。本标准与GB5413.37一2010相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M族的测定”；—增加了方法适用范围；
增加了对黄曲霉毒素M2的检测；修改了酶联免疫法，并修改第三法名称为酶联免疫吸附筛查法；—一修改了液相色谱-质谱联用法；一修改了液相色谱法的前处理方法；删除了免疫层析净化荧光分光度法I
1范围
食品安全国家标准
食品中黄曲霉毒素M族的测定
GB5009.24—2016
本标准规定了食品中黄曲霉毒素M和黄曲莓毒素M（以下简称AFTM和AFTM）的测定方法。
第一法为同位素稀释液相色谱-串联质谱法，适用于乳、乳制品和含乳特殊膳食用食品中AFTM和AFTM的测定。
第二法为高效液相色谱法，适用范围同第一法。第三法为酶联免疫吸附筛查法，适用于乳、乳制品和含乳特殊膳食用食品中AFTM的筛查测定。同位素稀释液相色谱-串联质谱法第一法
2原理
试样中的黄曲霉毒素M,和黄曲霉毒素M,用甲醇-水溶液提取，上清液用水或磷酸盐缓冲液稀释后，经免疫亲和柱净化和富集，净化液浓缩、定容和过滤后经液相色谱分离，串联质谱检测，同位素内标法定量。
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水3.1试剂
3.1.1乙睛(CH,CN)：色谱纯。
3.1.2甲醇（CH:OH)：色谱纯
3.1.3乙酸铵（CH,COONH）。
氯化钠(NaCI)。
磷酸氢二钠（NaHPO,）。
磷酸二氢钾（KH,PO）。
氯化钾(KCI)。
盐酸（HCD)。
石油醚（C,H2+2）：沸程为30℃～60℃。试剂配制
乙酸铵溶液（5mmol/L）：称取0.39g乙酸铵，溶于1000mL水中，混匀。乙-水溶液（25+75）：量取250mL乙腈加人750mL水中，混匀。乙腈-甲醇溶液（50十50）：量取500mL乙腈加人500mL甲醇中，混匀。1
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3.2.4磷酸盐缓冲溶液（以下简称PBS)：称取8.00g氯化钠、1.20g磷酸氢二钠（或2.92g十二水磷酸氢二钠）、0.20g磷酸二氢钾、0.20.g氯化钾，用900mL水溶解后，用盐酸调节pH至7.4，再加水至1000mL。
3.3标准品
3.3.1AFTM标准品（C1H12O，CAS：6795-23-9）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.2AFTM,标准品（CiH4O,，CAS：6885-57-0）纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.313C1-AFTM.同位素溶液（Ci,H4O,）：0.5μg/mL。3.4标准溶液配制
3.4.1标准储备溶液（10μg/mL）：分别称取AFTMi和AFTM21mg（精确至0.01mg），分别用乙睛溶解并定容至100mL。将溶液转移至棕色试剂瓶中，在一20℃下避光密封保存。临用前进行浓度校准（校准方法参见附录A)。
3.4.2混合标准储备溶液（1.0μg/mL）：分别准确吸取10uμg/mLAFTM和AFTM标准储备液1.00mL于同一10mL容量瓶中，加乙睛稀释至刻度，得到1.0μg/mL的混合标准液。此溶液密封后避光4℃保存，有效期3个月。
3.4.3混合标准工作液（100ng/mL）：准确吸取混合标准储备溶液（1.0μg/mL）1.00mL至10mL容量瓶中，乙腊定容。此溶液密封后避光4℃下保存，有效期3个月。3.4.450ng/mL同位素内标工作液1（l3C1-AFTM）：取AFTM同位素内标（0.5μg/mL)1mL.用乙睛稀释至10mL。在一20℃下保存，供测定液体样品时使用。有效期3个月。3.4.55ngmL同位素内标工作液2(1\Ciz-AFTM）：取AFTM,同位素内标（0.5μg/mL）100μL，用乙稀释至10mL。在一20℃下保存，供测定固体样品时使用。有效期3个月。3.4.6标准系列工作溶液：分别准确吸取标准工作液5uL、10uL、50uL、100μL、200uL、500μL至10mL容量瓶中，加人100μL50ng/mL的同位素内标工作液，用初始流动相定容至刻度，配制AFTM和AFTMz的浓度均为0.05ng/mL0.1ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL的系列标准溶液。
4仪器和设备
天平：感量0.01g、0.001g和0.00001g。4.1
水浴锅：温控50℃土2℃。
涡旋混合器。
超声波清洗器。
离心机：≥6000r/min。
旋转蒸发仪。
固相萃取装置（带真空泵）。
氮吹仪。
液相色谱-串联质谱仪：带电喷雾离子源。圆孔筛：1mm~2mm孔径。
玻璃纤维滤纸：快速，高载量，液体中颗粒保留1.6um。4.11
一次性微孔滤头：带0.22um微孔滤膜（所选用滤膜应采用标准溶液检验确认无吸附现象，方可4.12
使用）。
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4.13免疫亲和柱：柱容量≥100ng（柱容量、回收率、柱回收率验证方法参见附录B)。注：对于每个批次的亲和柱在使用前需进行质量验证。5分析步骤
使用不同厂商的免疫亲和柱，在样品的上样、淋洗和洗脱的操作方面可能略有不同，应该按照供应商所提供的操作说明书要求进行操作。警示：整个分析操作过程应在指定区域内进行。该区域应避光（直射阳光），具备相对独立的操作台和废弃物存放装置。在整个实验过程中，操作者应按照接触剧毒物的要求采取相应的保护措施5.1样品提取
5.1.1液态乳、酸奶
称取4g混合均匀的试样（精确到0.001g）于50mL离心管中，加人100μLC?-AFTM内标溶液（5ng/mL）振荡混匀后静置30min，加入10mL甲醇，涡旋3min。置于4℃6000r/min下离心10min或经玻璃纤维滤纸过滤，将适量上清液或滤液转移至烧杯中，加40mL水或PBS稀释，备用。5.1.2乳粉、特殊膳食用食品
称取1g样品（精确到0.001g）于50mL离心管中，加人100μLCl-AFTM内标溶液（5ng/mL)振荡混匀后静置30min，加人4mL50℃热水，涡旋混勾。如果乳粉不能完全溶解，将离心管置于50℃的水浴中，将乳粉完全溶解后取出。待样液冷却至20℃后，加人10mL甲醇.涡旋3min。置于4℃、6000r/min下离心10min或经玻璃纤维滤纸过滤，将适量上清液或滤液转移至烧杯中，加40ml水或PBS稀释，备用。
5.1.3奶油
称取1g样品（精确到0.001g）于50mL离心管中，加人100μL13C17-AFTM内标溶液（5ng）mL）振荡混勺后静置30min：加入8mL石油，待奶油溶解，再加9mL水和11mL甲醇，振荡30min.将全部液体移至分液漏斗中。加人0.3g氯化钠充分摇动溶解，静置分层后将下层移到圆底烧瓶中，旋转蒸发至10mL以下，用PBS稀释至30mL。5.1.4奶酪
称取1g已切细、过孔径1mm2mm圆孔筛混勾样品（精确到0.001g）于50mL离心管中，加100μL13C17-AFTM内标溶液（5ng/mL）振荡混勾后静置30min，加人1mL水和18mL甲醇.振荡30min，置于4℃、6000r/min下离心10min或经玻璃纤维滤纸过滤，将适量上清液或滤液转移至圆底烧瓶中，旋转蒸发至2mL以下，用PBS稀释至30mL5.2净化
5.2.1免疫亲和柱的准备
将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温。5.2.2净化
免疫亲和柱内的液体放弃后，将上述样液移至50mL注射器筒中，调节下滴流速为1mL/min～3
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3mL/min。待样液滴完后，往注射器筒内加人10mL水，以稳定流速淋洗免疫亲和柱。待水滴完后，用真空泵抽干亲和柱。脱离真空系统，在亲和柱下放置10mL刻度试管，取下50mL的注射器筒，加入2X×2mL乙睛（或甲醇）洗脱亲和柱，控制1mL/min～3mL/min下滴速度，用真空泵抽干亲和柱，收集全部洗脱液至刻度试管中。在50℃下氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，用初始流动相定容至1.0mL，涡旋30s溶解残留物，0.22um滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。注：全自动（在线）或半自动（离线）的固相萃取仪器可优化操作参数后使用。为防止黄曲霉毒素M破坏，相关操作在避光（直射阳光）条件下进行。5.3
液相色谱参考条件
液相色谱参考条件列出如下：
液相色谱柱：C柱（柱长100mm，柱内径2.1mm，填料粒径1.7um），或相当者。色谱柱柱温：40℃。
流动相：A相，5mmol/L乙酸铵水溶液；B相，乙腈-甲醇（50+50）。梯度洗脱：参见表1。流速：0.3mL/min。
进样体积：10μL。
质谱参考条件
质谱参考条件列出如下：
检测方式：多离子反应监测（MRM）；离子源控制条件：参见表2；
离子选择参数：见表3；
液相色谱-质谱图和子离子扫描图：见附录C。表1
液相色谱梯度洗脱条件
时间/min
流动相A/%
流动相B/%
2离子源控制条件
电离方式
毛细管电压/kV
锥孔电压/V
射频透镜1电压/V
射频透镜2电压/V
梯度变化曲线
化合物名称
13C-AFTM
定性测定
离子源温度/℃
锥孔反吹气流量/(L/h）
脱溶剂气温度/℃
脱溶剂气流量/(L/h)）
电子倍增电压/V
母离子
表2（续）
表3质谱条件参数
定量子离子
碰撞能量
定性子离子
(m/z）
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碰撞能量
离子化方式
试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在士2.5%之内。
每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其充许偏差不超过表4规定的范围。
表4定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%
允许相对偏差/%
标准曲线的制作
在5.3、5.4液相色谱-串联质谱仪分析条件下，将标准系列溶液由低到高浓度进样检测，以AFTM和AFTM,色谱峰与内标色谱峰13C1?-AFTM,的峰面积比值-浓度作图，得到标准曲线回归方程，其线性相关系数应大于0.99。
5.7试样溶液的测定
取5.2下处理得到的待测溶液进样，内标法计算待测液中目标物质的质量浓度，按第6章计算样品中待测物的含量。
5.8空自试验
不称取试样，按5.1和5.2的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。5
6分析结果的表述
试样中AFTM,或AFTM,的残留量按式1)计算：X=p×V×/×1000
m×1000
式中：
一试样中AFTM或AFTMz的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；GB5009.24—2016
进样溶液中AFTM或AFTM,按照内标法在标准曲线中对应的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)：
样品经免疫亲和柱净化洗脱后的最终定容体积，单位为毫升（mL）；样液稀释因子；
1000——换算系数；
试样的称样量，单位为克（g）。计算结果保留三位有效数字。
7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。8其他
称取液态乳、酸奶4g时，本方法AFTM检出限为0.005ug/kg，AFTM,检出限为0.005μg/kgAFTM定量限为0.015μg/kgAFTM,定量限为0.015μg/kg。称取乳粉、特殊膳食用食品、奶油和奶酪1g时，本方法AFTM,检出限为0.02ug/kg，AFTMz检出限为0.02μg/kg，AFTM,定量限为0.05μg/kg.AFTM，定量限为0.05ug/kg。第二法高效液相色谱法
9原理
试样中的黄曲霉毒素M,和黄曲霉毒素M用甲醇-水溶液提取，上清液稀释后，经免疫亲和柱净化和富集，净化液浓缩、定容和过滤后经液相色谱分离，荧光检测器检测。外标法定量。试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。10.1试剂
Z晴（CHCN）：色谱纯
甲醇(CHOH)：色谱纯。
氯化钠(NaCI)。
磷酸氢二钠（Naz2HPO,）。
磷酸二氢钾（KH,PO,）。
氯化钾(KCI)。
盐酸（HCI）
石油醚（C,Hza+2）：沸程为30℃~60℃。10.2试剂配制
乙睛-水溶液（25+75）：量取250mL乙睛加入750mL水中，混勾。10.2.1
乙睛-甲醇溶液（50十50）：量取500mL乙睛加人500mL甲醇中，混匀GB5009.24—2016
10.2.3有
磷酸盐缓冲溶液（以下简称PBS）：称取8.00g氯化钠、1.20g磷酸氢二钠（或2.92g十二水磷酸氢二钠）、0.20g磷酸二氢钾、0.20g氯化钾，用900mL水溶解后，用盐酸调节pH至7.4，再加水至1000mL.
10.3标准品
10.3.1AFTM标准品（CiHiz2O，CAS6795-23-9）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.3.2AFTM.标准品（Ci,H4O，，CAS：6885-57-0）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.4标准溶液配制
10.4.1标准储备溶液（10ug/mL）：分别称取AFTM,和AFTMz1mg（精确至0.01mg）.分别用乙睛溶解并定容至100mL。将溶液转移至棕色试剂瓶中，在一20℃下避光密封保存。临用前进行浓度校准（校准方法参见附录A）。
10.4.2混合标准储备溶液（1.0μg/mL）)：分别准确吸取10μg/mLAFTM和AFTM,标准储备液1.00mL于同一10mL容量瓶中，加乙睛稀释至刻度，得到1.0μg/mL的混合标准液。此溶液密封后避光4℃保存，有效期3个月。
10.4.3100ng/mL混合标准工作液（AFTM,和AFTMz）：准确移取混合标准储备溶液（1.0μg/mL）1.0mL至10mL容量瓶中，加乙睛稀释至刻度。此溶液密封后避光4℃下保存，有效期3个月。10.4.4标准系列工作溶液：分别准确移取标准工作液5μL、10μL、50μL、100μL、200μL、500μL至10mL容量瓶中，用初始流动相定容至刻度，AFTM,和AFTM，的浓度均为0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL的系列标准溶液11
仪器和设备
天平：感量0.01g、0.001g和0.00001g。水浴锅：温控50℃土2℃。
涡旋混合器。
超声波清洗器。
离心机：转速≥6000r/min。
旋转蒸发仪
固相萃取装置（带真空泵）。
氮吹仪。
圆孔筛：1mm~2mm孔径。
液相色谱仪（带荧光检测器）。7
1玻璃纤维滤纸：快速、高载量、液体中颗粒保留1.6μm。11.11
2一次性微孔滤头：带0.22um微孔滤膜。11.12
GB5009.24—2016
11.13免疫亲和柱：柱容量≥100ng。（柱容量、回收率、柱回收率验证方法参见附录B)。注：对于不同批次的亲和柱在使用前需进行质量验证。2分析步骤bzxz.net
使用不同厂商的免疫亲和柱，在样品的上样、淋洗和洗脱的操作方面可能略有不同，应该按照供应商所提供的操作说明书要求进行操作。警示：整个分析操作过程应在指定区域内进行。该区域应避光（直射阳光），具备相对独立的操作台和废弃物存放装置。在整个实验过程中，操作者应按照接触剧毒物的要求采取相应的保护措施，12.1试液提取
除不加同位素内标溶液，方法同5.1。12.2净化
方法同5.2。
液相色谱参考条件
液相色谱参考条件列出如下：
液相色谱柱：Cls柱（柱长150mm，柱内径4.6mm；填料粒径5um），或相当者。a
柱温：40℃。
流动相：A相，水；B相.乙腈-甲醇（50+50）。等梯度洗脱条件：A，70%；B，30%。d)
流速；1.0mL/min。
荧光检测波长：发射波长360nm；激发波长430nm。进样量：50μL。
液相色谱图见附录D。
12.4测定
标准曲线的制作
将系列标准溶液由低到高浓度依次进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。12.4.2
试样溶液的测定
待测样液中的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围的则应稀释后重新进样分析。12.4.3
空白试验
不称取试样，按12.1和12.2的步骤做空白实验。确认不含有干扰待测组分的物质。13分析结果的表述
试样中AFTM或AFTM2的残留量按式（2)计算：X=p×V××1000
mX1000
.（2)
式中：
一试样中AFTM或AFTMz的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；GB5009.24—2016
一进样溶液中AFTM,或AFTM的色谱峰由标准曲线所获得AFTM或AFTM,的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；一样品经免疫亲和柱净化洗脱后的最终定容体积，单位为毫升（mL）；—样液稀释因子；
换算系数：
试样的称样量，单位为克（g）。计算结果保留三位有效数字。
14精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。15其他
称取液态乳、酸奶4g时，本方法AFTM检出限为0.005μg/kg，AFTM检出限为0.0025μg/kgAFTM定量限为0.015μg/kg，AFTM，定量限为0.0075ug/kg。称取乳粉、特殊膳食用食品、奶油和奶酪1g时，本方法AFTM,检出限为0.02uμg/kg，AFTM,检出限为0.01ug/kg，AFTM,定量限为0.05μg/kg，AFTM，定量限为0.025μg/kg。第三法酶联免疫吸附筛查法
16原理
试样中的黄曲霉毒素M经均质、冷冻离心、脱脂或有机溶剂萃取等处理获得上清液。利用被辣根过氧化物酶标记或固定在反应孔中的黄曲霉毒素M,与样品或标准品中的黄曲霉毒素M,竞争性结合特异性抗体。在洗涤后加人相应显色剂显色，经无机酸终止反应，于450nm或630nm波长下检测。样品中的黄曲霉毒素M,与吸光度在一定浓度范围内呈反比。17
试剂和溶剂
配制溶液所需试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。按照试剂盒说明书所述，配制所需溶液。所用商品化的试剂盒需按照附录E所述方法验证合格后方可使用18
仪器和设备
18.1微孔板酶标仪：带450nm与630nm（可选）滤光片。18.2天平：最小感量0.01g。
18.3离心机：转速≥6000r/min。18.4旋涡混合器
19分析步骤
19.1样品前处理
19.1.1液态样品
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取约100g待测样品摇勾，将其中10g样品用离心机在6000r/min或更高转速下离心10min取下层液体约1g于另一试管内，该溶液可直接测定，或者利用试剂盒提供的方法稀释后测定（待测液）。
乳粉、特殊膳食用食品
称取10g待测样品（精确到0.1g）到小烧杯中，加水溶解，转移到100mL容量瓶中，用水定容至刻度。以下步骤同19.1.1。
19.1.3奶酪
称取50g待测样品（精确到0.1g），去除表面非食用部分，硬质奶酪可用粉碎机直接粉碎；软质奶酪需先在一20℃冷冻过夜，然后立即用粉碎机进行粉碎。称取5g混合均匀的待测样品（精确到0.1g），加人试剂盒所提供的提取液，按照试剂盒说明书进行提取，提取液即为待测液19.2定量检测
按照酶联免疫试剂盒所述操作步骤对待测试样（液）进行定量检测20
分析结果的表述
20.1酶联免疫试剂盒定量检测的标准工作曲线绘制根据标准品浓度与吸光度变化关系绘制标准工作曲线20.2待测液浓度计算
将待测液吸光度代入20.1所获得公式，计算得待测液浓度p20.3结果计算
食品中黄曲霉毒素M的含量按式（3）计算：x=pxvxf
式中：
食品中黄曲霉毒素M的含量，单位为微克每于克（ug/kg）；o
待测液中黄曲霉毒素M的浓度，单位为微克每升（μg/L)；..（3)
定容体积（针对乳粉、特殊膳食用食品、液态样品）或者提取液体积（针对奶酪），单位为升（L）；f
稀释倍数；
样品取样量，单位为千克（kg）。计算结果保留小数点后两位。
注：阳性样品需用第一法或第二法进一步确认：10
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