GB 5009.82-2016
基本信息
标准号： GB 5009.82-2016
中文名称：食品安全国家标准 食品中维生素A、D、E的测定
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
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GB 5009.82-2016 食品安全国家标准 食品中维生素A、D、E的测定
GB5009.82-2016
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标准内容
中华人民共和国国家标准
GB5009.82—2016
食品安全国家标准
食品中维生素A、D、E的测定
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局
GB5009.82—2016
本标准代替GB/T5009.82—2003《食品中维生素A和维生素E的测定》、GB5413.9—2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定》、GB/T9695.26一2008《肉与肉制品维
生素A含量测定》、GB/T9695.30—2008《肉与肉制品维生素E含量测定》、NY/T1598—2008《食用植物油中维生素E组分和含量的测定高效液相色谱法》。本标准与GB/T5009.82—2003相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准食品中维生素A、D、E的测定”；增加了“食品中维生素E的测定正相高效液相色谱法”；—一增加了“食品中维生素D的测定液相色谱-串联质谱法”；一增加了“食品中维生素D的测定高效液相色谱法”；修改了“食品中维生素A和维生素E的测定反相高效液相色谱法”
修改了维生素E异构体的反相色谱分离条件，可同时分离测定4种生育酚异构体；删除了苯并芪内标定量法，改用外标法定量；一删除了“比色法”测定维生素A。I
1范围
食品安全国家标准
食品中维生素A、D、E的测定
本标准规定了食品中维生素A、维生素E和维生素D的测定方法。本标准第一法适用于食品中维生素A和维生素E的测定本标准第三法适用于食用油、坚果、豆类和辣椒粉等食物中维生素E的测定。本标准第三法适用于食品中维生素D，和维生素D的测定。本标准第四法适用于配方食品中维生素Dz或维生素D，的测定。GB5009.82—2016
反相高效液相色谱法
第一法食品中维生素A和维生素E的测定2原理
试样中的维生素A及维生素E经皂化（含淀粉先用淀粉酶酶解）、提取、净化、浓缩后，C.或PFP反相液相色谱柱分离，紫外检测器或荧光检测器检测，外标法定量。3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水3.1试剂
3.1.1无水乙醇（C,H,OH)：经检查不含醛类物质，检查方法参见A.1。3.1.2抗坏血酸（C,H.O.）。
3.1.3氢氧化钾（KOH)。
3.1.4乙醚［（CH,CH2),O]：经检查不含过氧化物.检查方法参见A.2。3.1.5石油醚（C,H20,）：沸程为30℃～60℃。3.1.6无水硫酸钠（NazSO,）)。3.1.7pH试纸(pH范围1~14)
3.1.8甲醇（CH,OH)：色谱纯。
淀粉酶：活力单位≥100U/mg。
2.6-二叔丁基对甲酚（CH24O）：简称BHT3.2试剂配制
3.2.1氢氧化钾溶液（50g/100g）：称取50g氢氧化钾，加人50mL水溶解，冷却后，储存于聚乙烯瓶中。
3.2.2石油醚-乙醚溶液（1十1）：量取200mL石油醚，加入200mL乙醚，混勺匀。1
3.2.3有机系过滤头（孔径为0.22um）。3.3标准品
3.3.1维生素A标准品
GB5009.82—2016
视黄醇（C20H3O，CAS号：68-26-8）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.3.2维生素E标准品
3.3.2.1α-生育（C2.H，Oz.CAS号：10191-41-0）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质，
3.3.2.2β-生育酚（C28H48O2，CAS号：148-03-8）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.2.3-生育酚（C2sH4O2，CAS号：54-28-4）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.2.4-生育酚（C2H4,O2，CAS号：119-13-1)：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.4标准溶液配制
3.4.1维生素A标准储备溶液（0.500mg/mL）：准确称取25.0mg维生素A标准品，用无水乙醇溶解后，转移人50mL容量瓶中，定容至刻度，此溶液浓度约为0.500mg/mL。将溶液转移至棕色试剂瓶中，密封后，在一20℃下避光保存，有效期1个月。临用前将溶液回温至20℃，并进行浓度校正（校正方法参见附录B)。
3.4.2维生素E标准储备溶液（1.00mg/mL）：分别准确称取α-生育酚、β-生育酚、y-生育酚和-生育酚各50.0mg，用无水乙醇溶解后，转移人50mL容量瓶中，定容至刻度，此溶液浓度约为1.00mg/mL。将溶液转移至棕色试剂瓶中，密封后，在一20℃下避光保存，有效期6个月。临用前将溶液回温至20℃，并进行浓度校正（校正方法参见附录B）。3.4.3维生素A和维生素E混合标准溶液中间液：准确吸取维生素A标准储备溶液1.00mL和维生素E标准储备溶液各5.00mL于同一50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，此溶液中维生素A浓度为10.0μg/mL，维生素E各生育酚浓度为100μg/mL。在一20℃下避光保存，有效期半个月。3.4.4维生素A和维生素E标准系列工作溶液：分别准确吸取维生素A和维生素E混合标准溶液中间液0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL.6.00mL于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，该标准系列中维生素A浓度为0.20ug/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00uμg/mL、4.00μg/mL、6.00μg/mL，维生素E浓度为2.00μg/mL、5.00μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、60.0μg/mL。临用前配制。4仪器和设备
分析天平：感量为0.01mg。
恒温水浴振荡器。
旋转蒸发仪。
氮吹仪。
紫外分光光度计。
分液漏斗萃取净化振荡器。
4.7高效液相色谱仪：带紫外检测器或二极管阵列检测器或荧光检测器。5分析步骤
5.1试样制备
GB5009.822016
将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎均质后，储存于样品瓶中，避光冷藏，尽快测定。5.2试样处理
警示：使用的所有器血不得含有氧化性物质；分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油；处理过程应避免紫外光照，尽可能避光操作；提取过程应在通风柜中操作。5.2.1皂化
5.2.1.1不含淀粉样品
称取2g～5g（精确至0.01g）经均质处理的固体试样或50g（精确至0.01g）液体试样于150mL平底烧瓶中，固体试样需加人约20mL温水，混匀，再加人1.0g抗坏血酸和0.1gBHT，混匀，加入30mL无水乙醇，加人10mL～20mL氢氧化钾溶液，边加边振摇，混勾后于80℃恒温水浴震荡皂化30min，皂化后立即用冷水冷却至室温。注：皂化时间一般为30min，如皂化液冷却后，液面有浮油，需要加人适量氢氧化钾溶液，并适当延长皂化时间。5.2.1.2含淀粉样品
称取2g~5g（精确至0.01g）经均质处理的固体试样或50g（精确至0.01g）液体样品于150mL平底烧瓶中，固体试样需用约20mL温水混匀.加人0.5g～1g淀粉酶，放人60℃水浴避光恒温振荡30min后，取出，向酶解液中加入1.0g抗坏血酸和0.1gBHT，混匀，加人30mL无水乙醇，10mL～20mL氢氧化钾溶液，边加边振摇，混匀后于80℃恒温水浴振荡皂化30min，皂化后立即用冷水冷却至室温。
5.2.2提取
将皂化液用30mL水转入250mL的分液漏斗中，加50mL石油醚-乙醚混合液，振荡萃取5min，将下层溶液转移至另一250mL的分液漏斗中，加人50mL的混合醚液再次萃取，合并醚层。注：如只测维生素A与α-生育酚，可用石油醛作提取剂5.2.3洗涤
用约100mL水洗涤醚层，约需重复3次，直至将醚层洗至中性（可用pH试纸检测下层溶液pH值），去除下层水相。
5.2.4浓缩
将洗涤后的醚层经无水硫酸钠（约3g）滤入250mL旋转蒸发瓶或氮气浓缩管中，用约15mL石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次，并入蒸发瓶内，并将其接在旋转蒸发仪或气体浓缩仪上，于40℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩，待瓶中醚液剩下约2mL时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹至近干。用甲醇分次将蒸发瓶中残留物溶解并转移至10mL容量瓶中，定容至刻度。溶液过0.22μm有机系滤膜后供高效液相色谱测定。
色谱参考条件
色谱参考条件列出如下：
色谱柱：C.柱（柱长250mm：内径4.6mm，粒径3m）.或相当者：柱温：20℃；
流动相：A：水；B：甲醇，洗脱梯度见表1；流速：0.8mL/min；
紫外检测波长：维生素A为325nm；维生素E为294nm；进样量：10μL；
标准色谱图和样品色谱图见C.1。GB5009.82—2016
注1：如难以将柱温控制在20℃土2℃，可改用PFP柱分离异构体，流动相为水和甲醇梯度洗脱。注2：如样品中只含α-生育酚.不需分离生育酚和-生育酚，可选用C1柱，流动相为甲醇，注3：如有荧光检测器，可选用荧光检测器检测，对生育酚的检测有更高的灵敏度和选择性，可按以下检测波长检测：维生素A激发波长328nm，发射波长440nm；维生素E激发波长294nm，发射波长328nm。表1C3色谱柱-反相高效液相色谱法洗脱梯度参考条件时间
标准曲线的制作
流动相A
流动相B
mL/min
本法采用外标法定量。将维生素A和维生素E标准系列工作溶液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以峰面积为纵坐标，以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线，计算直线回归方程。5.5bZxz.net
5样品测定
试样液经高效液相色谱仪分析，测得峰面积，采用外标法通过上述标准曲线计算其浓度。在测定过程中，建议每测定10个样品用同一份标准溶液或标准物质检查仪器的稳定性。6分析结果的表述
试样中维生素A或维生素E的含量按式(1)计算：X=pxVxfx100
式中：
..（1)
试样中维生素A或维生素E的含量，维生素A单位为微克每百克（μg/100g），维生素E单位为毫克每百克（mg/100g）；根据标准曲线计算得到的试样中维生素A或维生素E的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)；4
V定容体积，单位为毫升（mL）；f——换算因子（维生素A：f=1;维生素E：f=0.001)；100-试样中量以每100克计算的换算系数；m
一试样的称样量，单位为克（g）。计算结果保留三位有效数字。
GB5009.82—2016
注：如维生素E的测定结果要用α-生育酚当量（α-TE）表示，可按下式计算：维生素E（mgα-TE/100g）=α-生育酚（mg/100g）+β-生育酚（mg/100g）×0.5+十-生育酚（mg/100g）×0.1+8-生育酚（mg/100g）×0.017精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。8其他
当取样量为5g定容10mL时，维生素A的紫外检出限为10μg/100g，定量限为30μg/100g生育酚的紫外检出限为40μg/100.g，定量限为120μg/100g。第二法
食品中维生素E的测定
正相高效液相色谱法
9原理
试样中的维生素E经有机溶剂提取、浓缩后，用高效液相色谱酰氨基柱或硅胶柱分离，经荧光检测器检测，外标法定量
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯。水为GB/T6682规定的一级水。10.1
无水乙醇（C,H.OH)：色谱纯，经检验不含醛类物质，检查方法参见A.1。乙醚（CH,CH），O：分析纯，经检验不含氧化物，检查方法参见A.2。石油醚（CH20）：沸程为30℃～60℃。无水硫酸钠（NazSO）。
正已烷（n-C,H14）：色谱纯。
异丙醇［（CH，）,CHOHI:色谱纯叔丁基甲基醚LCH，OC（CH）：色谱纯。甲醇（CH,OH)：色谱纯。
四氢峡哺（C,H.O)：色谱纯
1,4-二氧六环（C,H.O2)：色谱纯2.6-二叔丁基对甲酚（C15H2O）：简称BHT有机系过滤头（孔径为0.22μm）。5
10.2试剂配制
GB5009.82—2016
10.2.1石油醚-乙醚溶液（1十1）：量取200mL石油醚，加人200mL乙醚，混匀，临用前配制10.2.2流动相：正已烷+［叔丁基甲基醚-四氢呋喃-甲醇混合液（20+1十0.1)］=90+10，临用前配制。10.3标准品
10.3.1α-生育酚（C2,Hs。O2CAS号：10191-41-0）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质；
10.3.2β-生育酚（C28H4s02，CAS号：148-03-8）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质；
10.3.3-生育酚（C28H402.CAS号：54-28-4）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质：
10.3.4.-生育酚（C2,H4602，CAS号：119-13-1）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.4标准溶液配制
10.4.1维生素E标准储备溶液（1.00mg/mL）：分别称取4种生育酚异构体标准品各50.0mg（准确至0.1mg），用无水乙醇溶解于50mL容量瓶中，定容至刻度，此溶液浓度约为1.00mg/mL。将溶液转移至棕色试剂瓶中，密封后，在一20℃下避光保存，有效期6个月。临用前将溶液回温至20℃，并进行浓度校正（校正方法参见附录B）。10.4.2维生素E标准溶液中间液：准确吸取维生素E标准储备溶液各1.00mL于同一100mL容量瓶中.用氮气吹除乙醇后，用流动相定容至刻度，此溶液中维生素E各生育酚浓度为10.00μg/mL。密封后，在一20℃下避光保存，有效期半个月。10.4.3维生素E标准系列工作溶液：分别准确吸取维生素E混合标准溶液中间液0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL于10mL棕色容量瓶中，用流动相定容至刻度，该标准系列中4种生育酚浓度分别为0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL、4.00μg/mL、6.00μg/mL。11
仪器和设备
分析天平；感量为0.1mg。
恒温水浴振荡器。
旋转蒸发仪。
11.4氮吹仪。
11.5紫外分光光度计。
11.6索氏脂肪抽提仪或加速溶剂萃取仪。11.7
高效液相色谱仪，带荧光检测器或紫外检测器。12
分析步骤
12.1试样制备
将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎、均质后，储存于样品瓶中，避光冷藏，尽快测定。6
12.2试样处理
GB5009.82—2016
警示：使用的所有器血不得含有氧化性物质；分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油；处理过程应避免紫外光照，尽可能避光操作。
12.2.1植物油脂
称取0.5g～2g油样（准确至0.01g）于25mL的棕色容量瓶中，加人0.1gBHT，加入10mL流动相超声或涡旋振荡溶解后，用流动相定容至刻度，摇匀。过孔径为0.22um有机系滤头于棕色进样瓶中，待进样。
12.2.2奶油、黄油
称取2g~5g样品（准确至0.01g）于50mL的离心管中，加人0.1gBHT，45℃水浴融化加人5g无水硫酸钠，涡旋1min，混匀，加人25mL流动相超声或涡旋振荡提取，离心，将上清液转移至浓缩瓶中，再用20mL流动相重复提取1次，合并上清液至浓缩瓶，在旋转蒸发器或气体浓缩仪上，于45℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩，待瓶中醚剩下约2mL时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹干。用流动相将浓缩瓶中残留物溶解并转移至10mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀。溶液过0.22um有机系滤膜后供高效液相色谱测定。
12.2.3坚果、豆类、辣椒粉等干基植物样品称取2g～5g样品（准确至0.01g）.用索氏提取仪或加速溶剂萃取仪提取其中的植物油脂，将含油脂的提取溶剂转移至250mL蒸发瓶内，于40℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩至干，取下蒸发瓶，用10mL流动相将油脂转移至25mL容量瓶中，加人0.1gBHT，超声或涡旋振荡溶解后，用流动相定容至刻度，摇匀。过孔径为0.22um有机系滤头于棕色进样瓶中，待进样。12.3色谱参考条件
色谱参考条件列出如下：
色谱柱：酰氨基柱（柱长150mm，内径3.0mm，粒径1.7um）或相当者：a)
柱温：30℃；
流动相：正已烷十［叔丁基甲基醚-四氢呋喃-甲醇混合液（20十1十0.1)=90十10；c）馆
流速：0.8mL/min；
荧光检测波长：激发波长294nm，发射波长328nm；e)
f）进样量：10μL。
注：可用Si60硅胶柱（柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm）分离4种生育酚异构体，推荐流动相为正已烷与1.4二氧六环按（95十5）的比例混合。12.4标准曲线的制作
本法采用外标法定量。将维生素E标准系列工作溶液从低浓度到高浓度分别注人高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积。以峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，计算直线回归方程。
12.5样品测定
试样液经高效液相色谱仪分析.测得峰面积，采用外标法通过上述标准曲线计算其浓度。在测定过程中，建议每测定10个样品用同一份标准溶液或标准物质检查仪器的稳定性。7
3分析结果的表述
试样中α-生育酚、β-生育酚、-生育酚或-生育酚的含量按式(2)计算：X=pxV×/×100
式中：
GB5009.82—2016
.（2)
—试样中α-生育酚、β-生育酚、-生育酚或α-生育酚的含量，单位为毫克每百克（mg/100g)；根据标准曲线计算得到的试样中α-生育酚、β生育酚、-生育酚或3-生育酚的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
定容体积，单位为毫升（mL）：换算因子（=0.001)；
试样中量以每百克计算的换算系数；试样的称样量，单位为克（g）。计算结果保留三位有效数字。
注：如维生素E的测定结果要用α-生育酚当量（α-TE)表示，可按下式计算：维生素E(mgα-TE/100g）=α-生育酚（mg/100g）+β-生育酚（mg/100g）X0.5+-生育酚（mg/100g）×0.1+8-生育酚（mg/100g）×0.01。4精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。5其他
当取样量为2g，定容25mL时，各生育酚的检出限为50μg/100g.定量限为150μg/100g。第三法
食品中维生素D的测定
液相色谱-串联质谱法
5原理
试样中加人维生素D和维生素D：的同位素内标后，经氢氧化钾乙醇溶液皂化（含淀粉试样先用淀粉酶酶解）、提取、硅胶固相萃取柱净化、浓缩后，反相高效液相色谱Cls柱分离，串联质谱法检测，内标法定量。
7试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯。水为GB/T6682规定的一级水。17.1试剂
17.1.1无水乙醇（CHOH)：色谱纯，经检验不含醛类物质，检查方法参见A.1。2抗坏血酸（C,H,O,）。
32,6-二叔丁基对甲酚（C15H2/O)：简称BHT17.1.3
淀粉酶：活力单位≥100U/mg：
氢氧化钟（KOH）。
乙酸乙酯（C.H.O）：色谱纯。
正已烷（n-C,H）：色谱纯。
无水硫酸钠（Na2SO,）。
pH试纸（pH范围114）。
固相萃取柱（硅胶）：6mL，500mg。甲醇（CH,OH)：色谱纯。
甲酸（HCOOH）：色谱纯
甲酸铵（HCOONH）：色谱纯。
17.2试剂配制
GB5009.822016
氢氧化钾溶液（50g/100g）：50g氢氧化钾，加人50mL水溶解，冷却后储存于聚乙烯瓶中。乙酸乙酯-正已烷溶液（5+95）：量取5ml乙酸乙酯加人到95mL正已烷中，混匀。乙酸乙酯-正已烷溶液（15+85）：量取15mL乙酸乙酯加入到85mL正已烧中，混匀17.2.40.05%甲酸-5mmol/L甲酸铵溶液：称取0.315g甲酸铵，加人0.5mL甲酸、1000mL水溶解，超声混匀。
17.2.50.05%甲酸-5mmol/L甲酸铵甲醇溶液：称取0.315g甲酸铵，加人0.5mL甲酸、1000mL甲醇溶解，超声混勾。
17.3标准品
17.3.1维生素D，标准品：钙化醇（C28HOCAS号：50-14-6），纯度>98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
17.3.2维生素D：标准品：胆钙化醇（C2H4O.CAS号：511-28-4)，纯度>98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质，
17.3.3维生素Dz-d内标溶液（CzH4O-dg）：100μg/mL。17.3.4维生素D-d，内标溶液（C2H44O-d，）：100μg/mL。17.4标准溶液配制
17.4.1维生素D，标准储备溶液：准确称取维生素D，标准品10.0mg，用色谱纯无水乙醇溶解并定容至100mL.使其浓度约为100μg/mL.转移至棕色试剂瓶中，于一20℃冰箱中密封保存，有效期3个月。临用前用紫外分光光度法校正其浓度（校正方法见附录B）。17.4.2维生素D标准储备溶液：准确称取维生素D，标准品10.0mg，用色谱纯无水乙醇溶解并定容至10mL，使其浓度约为100μg/mL，转移至100mL的棕色试剂瓶中，于-20℃冰箱中密封保存，有效期3个月。临用前用紫外分光光度法校正其浓度（校正方法见附录B）。17.4.3维生素D，标准中间使用液：准确吸取维生素D2标准储备溶液10.00mL，用流动相稀释并定容至100mL，浓度约为10.0ug/mL，有效期1个月。准确浓度接校正后的浓度折算。17.4.4维生素D，标准中间使用液：准确吸取维生素D，标准储备溶液10.00mL,用流动相稀释并定容至100mL棕色容量瓶中，浓度约为10.0μg/mL，有效期1个月。准确浓度按校正后的浓度折算。17.4.5维生素D，和维生素D，混合标准使用液：准确吸取维生素Dz和维生素D，标准中间使用液各10.00mL，用流动相稀释并定容至100mL，浓度为1.00μg/mL：有效期1个月。17.4.6维生素D，-d，和维生素D-d内标混合溶液：分别量取100uL浓度为100ug/mL的维生系Dz-d，和维生素D-ds标准储备液加入10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1μg/mL混合内标。有效9
期1个月。
17.5标准系列溶液的配制
GB5009.82—2016
分别准确吸取维生素D,和D,混合标准使用液0.10mL、0.20mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL于10mL棕色容量瓶中，各加人维生素Dz-d，和维生素D-d，内标混合溶液1.00mL，用甲醇定容至刻度，混匀。此标准系列工作液浓度分别为10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100ug/L、150μg/L200μg/L
仪器和设备
注：使用的所有器Ⅲ不得含有氧化性物质。分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油。分析天平：感量为0.1mg。
磁力搅拌器或恒温振荡水浴：带加热和控温功能旋转蒸发仪。
氮吹仪。
紫外分光光度计。
萃取净化振荡器。
多功能涡旋振荡器。
高速冷冻离心机：转速≥6000r/min。高效液相色谱-串联质谱仪：带电喷雾离子源。分析步骤
19.1试样制备
将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎、均质后，储存于样品瓶中，避光冷藏，尽快测定19.2试样处理
注：处理过程应避免紫外光照，尽可能避光操作。19.2.1皂化
19.2.1.1不含淀粉样品
称取2g（准确至0.01g）经均质处理的试样于50mL具塞离心管中，加人100μL维生素Dz-d和维生素D;-d，混合内标溶液和0.4g抗坏血酸，加入6mL约40℃温水，涡旋1min，加人12ml乙醇，涡旋30s，再加入6mL氢氧化钾溶液，涡旋30s后放人恒温振荡器中，80℃避光恒温水浴振荡30min（如样品组织较为紧密，可每隔5min～10min取出涡旋0.5min），取出放入冷水浴降温。注：一股皂化时间为30min，如皂化液冷却后，液面有浮油.需要加人适量氢氧化钾溶液，并适当延长皂化时间。19.2.1.2含淀粉样品
称取2g（准确至0.01g）经均质处理的试样于50mL具塞离心管中，加人100μL维生素Dz-d，和维生素D-d，混合内标溶液和0.4g淀粉酶，加入10mL约40℃温水，放入恒温振荡器中，60℃避光恒温振荡30min后，取出放入冷水浴降温，向冷却后的酶解液中加入0.4g抗坏血酸、12mL乙醇，涡旋30s.再加人6mL氢氧化钾溶液，涡旋30s后放入恒温振荡器中，同19.2.1.1皂化30min。10
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GB5009.82—2016
食品安全国家标准
食品中维生素A、D、E的测定
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局
GB5009.82—2016
本标准代替GB/T5009.82—2003《食品中维生素A和维生素E的测定》、GB5413.9—2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定》、GB/T9695.26一2008《肉与肉制品维
生素A含量测定》、GB/T9695.30—2008《肉与肉制品维生素E含量测定》、NY/T1598—2008《食用植物油中维生素E组分和含量的测定高效液相色谱法》。本标准与GB/T5009.82—2003相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准食品中维生素A、D、E的测定”；增加了“食品中维生素E的测定正相高效液相色谱法”；—一增加了“食品中维生素D的测定液相色谱-串联质谱法”；一增加了“食品中维生素D的测定高效液相色谱法”；修改了“食品中维生素A和维生素E的测定反相高效液相色谱法”
修改了维生素E异构体的反相色谱分离条件，可同时分离测定4种生育酚异构体；删除了苯并芪内标定量法，改用外标法定量；一删除了“比色法”测定维生素A。I
1范围
食品安全国家标准
食品中维生素A、D、E的测定
本标准规定了食品中维生素A、维生素E和维生素D的测定方法。本标准第一法适用于食品中维生素A和维生素E的测定本标准第三法适用于食用油、坚果、豆类和辣椒粉等食物中维生素E的测定。本标准第三法适用于食品中维生素D，和维生素D的测定。本标准第四法适用于配方食品中维生素Dz或维生素D，的测定。GB5009.82—2016
反相高效液相色谱法
第一法食品中维生素A和维生素E的测定2原理
试样中的维生素A及维生素E经皂化（含淀粉先用淀粉酶酶解）、提取、净化、浓缩后，C.或PFP反相液相色谱柱分离，紫外检测器或荧光检测器检测，外标法定量。3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水3.1试剂
3.1.1无水乙醇（C,H,OH)：经检查不含醛类物质，检查方法参见A.1。3.1.2抗坏血酸（C,H.O.）。
3.1.3氢氧化钾（KOH)。
3.1.4乙醚［（CH,CH2),O]：经检查不含过氧化物.检查方法参见A.2。3.1.5石油醚（C,H20,）：沸程为30℃～60℃。3.1.6无水硫酸钠（NazSO,）)。3.1.7pH试纸(pH范围1~14)
3.1.8甲醇（CH,OH)：色谱纯。
淀粉酶：活力单位≥100U/mg。
2.6-二叔丁基对甲酚（CH24O）：简称BHT3.2试剂配制
3.2.1氢氧化钾溶液（50g/100g）：称取50g氢氧化钾，加人50mL水溶解，冷却后，储存于聚乙烯瓶中。
3.2.2石油醚-乙醚溶液（1十1）：量取200mL石油醚，加入200mL乙醚，混勺匀。1
3.2.3有机系过滤头（孔径为0.22um）。3.3标准品
3.3.1维生素A标准品
GB5009.82—2016
视黄醇（C20H3O，CAS号：68-26-8）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.3.2维生素E标准品
3.3.2.1α-生育（C2.H，Oz.CAS号：10191-41-0）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质，
3.3.2.2β-生育酚（C28H48O2，CAS号：148-03-8）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.2.3-生育酚（C2sH4O2，CAS号：54-28-4）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.2.4-生育酚（C2H4,O2，CAS号：119-13-1)：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.4标准溶液配制
3.4.1维生素A标准储备溶液（0.500mg/mL）：准确称取25.0mg维生素A标准品，用无水乙醇溶解后，转移人50mL容量瓶中，定容至刻度，此溶液浓度约为0.500mg/mL。将溶液转移至棕色试剂瓶中，密封后，在一20℃下避光保存，有效期1个月。临用前将溶液回温至20℃，并进行浓度校正（校正方法参见附录B)。
3.4.2维生素E标准储备溶液（1.00mg/mL）：分别准确称取α-生育酚、β-生育酚、y-生育酚和-生育酚各50.0mg，用无水乙醇溶解后，转移人50mL容量瓶中，定容至刻度，此溶液浓度约为1.00mg/mL。将溶液转移至棕色试剂瓶中，密封后，在一20℃下避光保存，有效期6个月。临用前将溶液回温至20℃，并进行浓度校正（校正方法参见附录B）。3.4.3维生素A和维生素E混合标准溶液中间液：准确吸取维生素A标准储备溶液1.00mL和维生素E标准储备溶液各5.00mL于同一50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，此溶液中维生素A浓度为10.0μg/mL，维生素E各生育酚浓度为100μg/mL。在一20℃下避光保存，有效期半个月。3.4.4维生素A和维生素E标准系列工作溶液：分别准确吸取维生素A和维生素E混合标准溶液中间液0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL.6.00mL于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，该标准系列中维生素A浓度为0.20ug/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00uμg/mL、4.00μg/mL、6.00μg/mL，维生素E浓度为2.00μg/mL、5.00μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、60.0μg/mL。临用前配制。4仪器和设备
分析天平：感量为0.01mg。
恒温水浴振荡器。
旋转蒸发仪。
氮吹仪。
紫外分光光度计。
分液漏斗萃取净化振荡器。
4.7高效液相色谱仪：带紫外检测器或二极管阵列检测器或荧光检测器。5分析步骤
5.1试样制备
GB5009.822016
将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎均质后，储存于样品瓶中，避光冷藏，尽快测定。5.2试样处理
警示：使用的所有器血不得含有氧化性物质；分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油；处理过程应避免紫外光照，尽可能避光操作；提取过程应在通风柜中操作。5.2.1皂化
5.2.1.1不含淀粉样品
称取2g～5g（精确至0.01g）经均质处理的固体试样或50g（精确至0.01g）液体试样于150mL平底烧瓶中，固体试样需加人约20mL温水，混匀，再加人1.0g抗坏血酸和0.1gBHT，混匀，加入30mL无水乙醇，加人10mL～20mL氢氧化钾溶液，边加边振摇，混勾后于80℃恒温水浴震荡皂化30min，皂化后立即用冷水冷却至室温。注：皂化时间一般为30min，如皂化液冷却后，液面有浮油，需要加人适量氢氧化钾溶液，并适当延长皂化时间。5.2.1.2含淀粉样品
称取2g~5g（精确至0.01g）经均质处理的固体试样或50g（精确至0.01g）液体样品于150mL平底烧瓶中，固体试样需用约20mL温水混匀.加人0.5g～1g淀粉酶，放人60℃水浴避光恒温振荡30min后，取出，向酶解液中加入1.0g抗坏血酸和0.1gBHT，混匀，加人30mL无水乙醇，10mL～20mL氢氧化钾溶液，边加边振摇，混匀后于80℃恒温水浴振荡皂化30min，皂化后立即用冷水冷却至室温。
5.2.2提取
将皂化液用30mL水转入250mL的分液漏斗中，加50mL石油醚-乙醚混合液，振荡萃取5min，将下层溶液转移至另一250mL的分液漏斗中，加人50mL的混合醚液再次萃取，合并醚层。注：如只测维生素A与α-生育酚，可用石油醛作提取剂5.2.3洗涤
用约100mL水洗涤醚层，约需重复3次，直至将醚层洗至中性（可用pH试纸检测下层溶液pH值），去除下层水相。
5.2.4浓缩
将洗涤后的醚层经无水硫酸钠（约3g）滤入250mL旋转蒸发瓶或氮气浓缩管中，用约15mL石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次，并入蒸发瓶内，并将其接在旋转蒸发仪或气体浓缩仪上，于40℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩，待瓶中醚液剩下约2mL时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹至近干。用甲醇分次将蒸发瓶中残留物溶解并转移至10mL容量瓶中，定容至刻度。溶液过0.22μm有机系滤膜后供高效液相色谱测定。
色谱参考条件
色谱参考条件列出如下：
色谱柱：C.柱（柱长250mm：内径4.6mm，粒径3m）.或相当者：柱温：20℃；
流动相：A：水；B：甲醇，洗脱梯度见表1；流速：0.8mL/min；
紫外检测波长：维生素A为325nm；维生素E为294nm；进样量：10μL；
标准色谱图和样品色谱图见C.1。GB5009.82—2016
注1：如难以将柱温控制在20℃土2℃，可改用PFP柱分离异构体，流动相为水和甲醇梯度洗脱。注2：如样品中只含α-生育酚.不需分离生育酚和-生育酚，可选用C1柱，流动相为甲醇，注3：如有荧光检测器，可选用荧光检测器检测，对生育酚的检测有更高的灵敏度和选择性，可按以下检测波长检测：维生素A激发波长328nm，发射波长440nm；维生素E激发波长294nm，发射波长328nm。表1C3色谱柱-反相高效液相色谱法洗脱梯度参考条件时间
标准曲线的制作
流动相A
流动相B
mL/min
本法采用外标法定量。将维生素A和维生素E标准系列工作溶液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以峰面积为纵坐标，以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线，计算直线回归方程。5.5bZxz.net
5样品测定
试样液经高效液相色谱仪分析，测得峰面积，采用外标法通过上述标准曲线计算其浓度。在测定过程中，建议每测定10个样品用同一份标准溶液或标准物质检查仪器的稳定性。6分析结果的表述
试样中维生素A或维生素E的含量按式(1)计算：X=pxVxfx100
式中：
..（1)
试样中维生素A或维生素E的含量，维生素A单位为微克每百克（μg/100g），维生素E单位为毫克每百克（mg/100g）；根据标准曲线计算得到的试样中维生素A或维生素E的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)；4
V定容体积，单位为毫升（mL）；f——换算因子（维生素A：f=1;维生素E：f=0.001)；100-试样中量以每100克计算的换算系数；m
一试样的称样量，单位为克（g）。计算结果保留三位有效数字。
GB5009.82—2016
注：如维生素E的测定结果要用α-生育酚当量（α-TE）表示，可按下式计算：维生素E（mgα-TE/100g）=α-生育酚（mg/100g）+β-生育酚（mg/100g）×0.5+十-生育酚（mg/100g）×0.1+8-生育酚（mg/100g）×0.017精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。8其他
当取样量为5g定容10mL时，维生素A的紫外检出限为10μg/100g，定量限为30μg/100g生育酚的紫外检出限为40μg/100.g，定量限为120μg/100g。第二法
食品中维生素E的测定
正相高效液相色谱法
9原理
试样中的维生素E经有机溶剂提取、浓缩后，用高效液相色谱酰氨基柱或硅胶柱分离，经荧光检测器检测，外标法定量
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯。水为GB/T6682规定的一级水。10.1
无水乙醇（C,H.OH)：色谱纯，经检验不含醛类物质，检查方法参见A.1。乙醚（CH,CH），O：分析纯，经检验不含氧化物，检查方法参见A.2。石油醚（CH20）：沸程为30℃～60℃。无水硫酸钠（NazSO）。
正已烷（n-C,H14）：色谱纯。
异丙醇［（CH，）,CHOHI:色谱纯叔丁基甲基醚LCH，OC（CH）：色谱纯。甲醇（CH,OH)：色谱纯。
四氢峡哺（C,H.O)：色谱纯
1,4-二氧六环（C,H.O2)：色谱纯2.6-二叔丁基对甲酚（C15H2O）：简称BHT有机系过滤头（孔径为0.22μm）。5
10.2试剂配制
GB5009.82—2016
10.2.1石油醚-乙醚溶液（1十1）：量取200mL石油醚，加人200mL乙醚，混匀，临用前配制10.2.2流动相：正已烷+［叔丁基甲基醚-四氢呋喃-甲醇混合液（20+1十0.1)］=90+10，临用前配制。10.3标准品
10.3.1α-生育酚（C2,Hs。O2CAS号：10191-41-0）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质；
10.3.2β-生育酚（C28H4s02，CAS号：148-03-8）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质；
10.3.3-生育酚（C28H402.CAS号：54-28-4）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质：
10.3.4.-生育酚（C2,H4602，CAS号：119-13-1）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.4标准溶液配制
10.4.1维生素E标准储备溶液（1.00mg/mL）：分别称取4种生育酚异构体标准品各50.0mg（准确至0.1mg），用无水乙醇溶解于50mL容量瓶中，定容至刻度，此溶液浓度约为1.00mg/mL。将溶液转移至棕色试剂瓶中，密封后，在一20℃下避光保存，有效期6个月。临用前将溶液回温至20℃，并进行浓度校正（校正方法参见附录B）。10.4.2维生素E标准溶液中间液：准确吸取维生素E标准储备溶液各1.00mL于同一100mL容量瓶中.用氮气吹除乙醇后，用流动相定容至刻度，此溶液中维生素E各生育酚浓度为10.00μg/mL。密封后，在一20℃下避光保存，有效期半个月。10.4.3维生素E标准系列工作溶液：分别准确吸取维生素E混合标准溶液中间液0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL于10mL棕色容量瓶中，用流动相定容至刻度，该标准系列中4种生育酚浓度分别为0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL、4.00μg/mL、6.00μg/mL。11
仪器和设备
分析天平；感量为0.1mg。
恒温水浴振荡器。
旋转蒸发仪。
11.4氮吹仪。
11.5紫外分光光度计。
11.6索氏脂肪抽提仪或加速溶剂萃取仪。11.7
高效液相色谱仪，带荧光检测器或紫外检测器。12
分析步骤
12.1试样制备
将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎、均质后，储存于样品瓶中，避光冷藏，尽快测定。6
12.2试样处理
GB5009.82—2016
警示：使用的所有器血不得含有氧化性物质；分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油；处理过程应避免紫外光照，尽可能避光操作。
12.2.1植物油脂
称取0.5g～2g油样（准确至0.01g）于25mL的棕色容量瓶中，加人0.1gBHT，加入10mL流动相超声或涡旋振荡溶解后，用流动相定容至刻度，摇匀。过孔径为0.22um有机系滤头于棕色进样瓶中，待进样。
12.2.2奶油、黄油
称取2g~5g样品（准确至0.01g）于50mL的离心管中，加人0.1gBHT，45℃水浴融化加人5g无水硫酸钠，涡旋1min，混匀，加人25mL流动相超声或涡旋振荡提取，离心，将上清液转移至浓缩瓶中，再用20mL流动相重复提取1次，合并上清液至浓缩瓶，在旋转蒸发器或气体浓缩仪上，于45℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩，待瓶中醚剩下约2mL时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹干。用流动相将浓缩瓶中残留物溶解并转移至10mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀。溶液过0.22um有机系滤膜后供高效液相色谱测定。
12.2.3坚果、豆类、辣椒粉等干基植物样品称取2g～5g样品（准确至0.01g）.用索氏提取仪或加速溶剂萃取仪提取其中的植物油脂，将含油脂的提取溶剂转移至250mL蒸发瓶内，于40℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩至干，取下蒸发瓶，用10mL流动相将油脂转移至25mL容量瓶中，加人0.1gBHT，超声或涡旋振荡溶解后，用流动相定容至刻度，摇匀。过孔径为0.22um有机系滤头于棕色进样瓶中，待进样。12.3色谱参考条件
色谱参考条件列出如下：
色谱柱：酰氨基柱（柱长150mm，内径3.0mm，粒径1.7um）或相当者：a)
柱温：30℃；
流动相：正已烷十［叔丁基甲基醚-四氢呋喃-甲醇混合液（20十1十0.1)=90十10；c）馆
流速：0.8mL/min；
荧光检测波长：激发波长294nm，发射波长328nm；e)
f）进样量：10μL。
注：可用Si60硅胶柱（柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm）分离4种生育酚异构体，推荐流动相为正已烷与1.4二氧六环按（95十5）的比例混合。12.4标准曲线的制作
本法采用外标法定量。将维生素E标准系列工作溶液从低浓度到高浓度分别注人高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积。以峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，计算直线回归方程。
12.5样品测定
试样液经高效液相色谱仪分析.测得峰面积，采用外标法通过上述标准曲线计算其浓度。在测定过程中，建议每测定10个样品用同一份标准溶液或标准物质检查仪器的稳定性。7
3分析结果的表述
试样中α-生育酚、β-生育酚、-生育酚或-生育酚的含量按式(2)计算：X=pxV×/×100
式中：
GB5009.82—2016
.（2)
—试样中α-生育酚、β-生育酚、-生育酚或α-生育酚的含量，单位为毫克每百克（mg/100g)；根据标准曲线计算得到的试样中α-生育酚、β生育酚、-生育酚或3-生育酚的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
定容体积，单位为毫升（mL）：换算因子（=0.001)；
试样中量以每百克计算的换算系数；试样的称样量，单位为克（g）。计算结果保留三位有效数字。
注：如维生素E的测定结果要用α-生育酚当量（α-TE)表示，可按下式计算：维生素E(mgα-TE/100g）=α-生育酚（mg/100g）+β-生育酚（mg/100g）X0.5+-生育酚（mg/100g）×0.1+8-生育酚（mg/100g）×0.01。4精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。5其他
当取样量为2g，定容25mL时，各生育酚的检出限为50μg/100g.定量限为150μg/100g。第三法
食品中维生素D的测定
液相色谱-串联质谱法
5原理
试样中加人维生素D和维生素D：的同位素内标后，经氢氧化钾乙醇溶液皂化（含淀粉试样先用淀粉酶酶解）、提取、硅胶固相萃取柱净化、浓缩后，反相高效液相色谱Cls柱分离，串联质谱法检测，内标法定量。
7试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯。水为GB/T6682规定的一级水。17.1试剂
17.1.1无水乙醇（CHOH)：色谱纯，经检验不含醛类物质，检查方法参见A.1。2抗坏血酸（C,H,O,）。
32,6-二叔丁基对甲酚（C15H2/O)：简称BHT17.1.3
淀粉酶：活力单位≥100U/mg：
氢氧化钟（KOH）。
乙酸乙酯（C.H.O）：色谱纯。
正已烷（n-C,H）：色谱纯。
无水硫酸钠（Na2SO,）。
pH试纸（pH范围114）。
固相萃取柱（硅胶）：6mL，500mg。甲醇（CH,OH)：色谱纯。
甲酸（HCOOH）：色谱纯
甲酸铵（HCOONH）：色谱纯。
17.2试剂配制
GB5009.822016
氢氧化钾溶液（50g/100g）：50g氢氧化钾，加人50mL水溶解，冷却后储存于聚乙烯瓶中。乙酸乙酯-正已烷溶液（5+95）：量取5ml乙酸乙酯加人到95mL正已烷中，混匀。乙酸乙酯-正已烷溶液（15+85）：量取15mL乙酸乙酯加入到85mL正已烧中，混匀17.2.40.05%甲酸-5mmol/L甲酸铵溶液：称取0.315g甲酸铵，加人0.5mL甲酸、1000mL水溶解，超声混匀。
17.2.50.05%甲酸-5mmol/L甲酸铵甲醇溶液：称取0.315g甲酸铵，加人0.5mL甲酸、1000mL甲醇溶解，超声混勾。
17.3标准品
17.3.1维生素D，标准品：钙化醇（C28HOCAS号：50-14-6），纯度>98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
17.3.2维生素D：标准品：胆钙化醇（C2H4O.CAS号：511-28-4)，纯度>98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质，
17.3.3维生素Dz-d内标溶液（CzH4O-dg）：100μg/mL。17.3.4维生素D-d，内标溶液（C2H44O-d，）：100μg/mL。17.4标准溶液配制
17.4.1维生素D，标准储备溶液：准确称取维生素D，标准品10.0mg，用色谱纯无水乙醇溶解并定容至100mL.使其浓度约为100μg/mL.转移至棕色试剂瓶中，于一20℃冰箱中密封保存，有效期3个月。临用前用紫外分光光度法校正其浓度（校正方法见附录B）。17.4.2维生素D标准储备溶液：准确称取维生素D，标准品10.0mg，用色谱纯无水乙醇溶解并定容至10mL，使其浓度约为100μg/mL，转移至100mL的棕色试剂瓶中，于-20℃冰箱中密封保存，有效期3个月。临用前用紫外分光光度法校正其浓度（校正方法见附录B）。17.4.3维生素D，标准中间使用液：准确吸取维生素D2标准储备溶液10.00mL，用流动相稀释并定容至100mL，浓度约为10.0ug/mL，有效期1个月。准确浓度接校正后的浓度折算。17.4.4维生素D，标准中间使用液：准确吸取维生素D，标准储备溶液10.00mL,用流动相稀释并定容至100mL棕色容量瓶中，浓度约为10.0μg/mL，有效期1个月。准确浓度按校正后的浓度折算。17.4.5维生素D，和维生素D，混合标准使用液：准确吸取维生素Dz和维生素D，标准中间使用液各10.00mL，用流动相稀释并定容至100mL，浓度为1.00μg/mL：有效期1个月。17.4.6维生素D，-d，和维生素D-d内标混合溶液：分别量取100uL浓度为100ug/mL的维生系Dz-d，和维生素D-ds标准储备液加入10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1μg/mL混合内标。有效9
期1个月。
17.5标准系列溶液的配制
GB5009.82—2016
分别准确吸取维生素D,和D,混合标准使用液0.10mL、0.20mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL于10mL棕色容量瓶中，各加人维生素Dz-d，和维生素D-d，内标混合溶液1.00mL，用甲醇定容至刻度，混匀。此标准系列工作液浓度分别为10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100ug/L、150μg/L200μg/L
仪器和设备
注：使用的所有器Ⅲ不得含有氧化性物质。分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油。分析天平：感量为0.1mg。
磁力搅拌器或恒温振荡水浴：带加热和控温功能旋转蒸发仪。
氮吹仪。
紫外分光光度计。
萃取净化振荡器。
多功能涡旋振荡器。
高速冷冻离心机：转速≥6000r/min。高效液相色谱-串联质谱仪：带电喷雾离子源。分析步骤
19.1试样制备
将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎、均质后，储存于样品瓶中，避光冷藏，尽快测定19.2试样处理
注：处理过程应避免紫外光照，尽可能避光操作。19.2.1皂化
19.2.1.1不含淀粉样品
称取2g（准确至0.01g）经均质处理的试样于50mL具塞离心管中，加人100μL维生素Dz-d和维生素D;-d，混合内标溶液和0.4g抗坏血酸，加入6mL约40℃温水，涡旋1min，加人12ml乙醇，涡旋30s，再加入6mL氢氧化钾溶液，涡旋30s后放人恒温振荡器中，80℃避光恒温水浴振荡30min（如样品组织较为紧密，可每隔5min～10min取出涡旋0.5min），取出放入冷水浴降温。注：一股皂化时间为30min，如皂化液冷却后，液面有浮油.需要加人适量氢氧化钾溶液，并适当延长皂化时间。19.2.1.2含淀粉样品
称取2g（准确至0.01g）经均质处理的试样于50mL具塞离心管中，加人100μL维生素Dz-d，和维生素D-d，混合内标溶液和0.4g淀粉酶，加入10mL约40℃温水，放入恒温振荡器中，60℃避光恒温振荡30min后，取出放入冷水浴降温，向冷却后的酶解液中加入0.4g抗坏血酸、12mL乙醇，涡旋30s.再加人6mL氢氧化钾溶液，涡旋30s后放入恒温振荡器中，同19.2.1.1皂化30min。10
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