GB 5009.96-2016
基本信息
标准号： GB 5009.96-2016
中文名称：食品安全国家标准 食品中赭曲霉毒素A的测定
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
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GB 5009.96-2016 食品安全国家标准 食品中赭曲霉毒素A的测定
GB5009.96-2016
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标准内容
中华人民共和国国家标准
GB5009.96—2016
食品安全国家标准
食品中赭曲霉毒素A的测定
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局
GB5009.96—2016
本标准代替GB/T23502—2009《食品中赭曲霉毒素A的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》、GB/T25220—2010《粮油检验粮食中赭曲霉毒素A的测定高效液相色谱法和荧光光度法》、GB/T5009.96—2003《谷物和大豆中赭曲霉毒素A的测定》、SN/T1746—2006《进出口大豆、油菜籽和食用植物油中赭曲霉毒素A的检验方法》、SN/T19402007《进出口食品中赭曲霉毒素A的测定方法》和SN0211—1993《出口粮谷中棕曲霉毒素A的检验方法》。本标准与GB/T23502—2009相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准食品中赭曲霉毒素A的测定”；增加了第三法免疫亲和层析净化液相色谱-串联质谱法和第四法酶联免疫吸附测定法；增加了适用范围并优化了提取方法；一删除了免疫亲和柱层析净化荧光光度法。I
1范围
食品安全国家标准
食品中赭曲霉毒素A的测定
本标准规定了食品中赭曲霉毒素A的测定方法GB 5009.96—2016
本标准第一法适用于谷物、油料及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品、葡萄干、胡椒粒/粉中赭曲毒素A的测定，第二法适用于玉米、稻谷（糙米）、小麦、小麦粉、大豆、咖啡、葡萄酒中赭曲霉毒素A的测定，第三法适用于玉米、小麦等粮食产品、辣椒及其制品等、啤酒等酒类、酱油等产品、生咖啡、熟咖啡中赭曲霉毒素A的测定，第四法适用于玉米、小麦、大麦、大米、大豆及其制品中赭曲霉毒素A的测定：第五法适用于小麦、玉米、大豆中赭曲霉毒素A的测定。免疫亲和层析净化液相色谱法
第一法
2原理
用提取液提取试样中的赭曲霉毒素A，经免疫亲和柱净化后，采用高效液相色谱结合荧光检测器测定赭曲霉毒素A的含量，外标法定量。3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂
甲醇（CHOH)：色谱纯。
乙睛（CH.CN）：色谱纯。
3.1.3冰乙酸（C,H,O,）：色谱纯3.1.4氯化钠(NaCI)。
3.1.5聚乙二醇[HOCH,（CH,O·CH,）,CH,OHI。3.1.6吐温20（C5H114O26）。
3.1.7碳酸氢钠（NaHCO）。
3.1.8磷酸二氢钾（KH,PO4）。
3.1.9浓盐酸(HCI)。
氮气（N2）：纯度≥99.9%
3.2试剂配制
提取液I：甲醇-水（80十20）。3.2.1
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3.2.2提取液ll：称取150.0g氯化钠、20.0g碳酸氢钠溶于约950mL水中，加水定容至1L3.2.3提取液Ⅲ：乙腈-水（60+40）。3.2.4冲洗液：称取25.0g氯化钠、5.0g碳酸氢钠溶于约950mL水中，加水定容至1L3.2.5真菌毒素清洗缓冲液：称取25.0g氯化钠、5.0g碳酸氢钠溶于水中，加入0.1mL吐温20，用水稀释至1L。
3.2.6磷酸盐缓冲液：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾溶解于约990ml水中.用浓盐酸调节pH至7.0.用水稀释至1L。3.2.7碳酸氢钠溶液（10g/L）：称取1.0g碳酸氢钠.用水溶解并稀释到100mL。3.2.8淋洗缓冲液：在1000mL磷酸盐缓冲液中加人1.0mL吐温20。3.3标准品
储曲霉毒素A（CHi：C1NO.CAS号：303-47-9），纯度≥99%。或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.4标准溶液配制
3.4.1赭曲霉毒素A标准储备液：准确称取一定量的赭曲霉毒素A标准品，用甲醇-乙睛（50十50）溶解，配成0.1mg/mL的标准储备液，在一20℃保存，可使用3个月。3.4.2赭曲霉毒素A标准工作液：根据使用需要，准确移取一定量的赭曲霉毒素A标准储备液（3.4.1），用流动相稀释，分别配成相当于1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL的标准工作液，4℃保存，可使用7d。
3.5材料
3.5.1赭曲霉毒素A免疫亲和柱：柱规格1mL或3mL，柱容量≥100ng，或等效柱。3.5.2定量滤纸。
3.5.3玻璃纤维滤纸：直径11cm，孔径1.5um，无荧光特性。4仪器和设备
分析天平：感量0.001g。
高效液相色谱仪，配荧光检测器。高速均质器：≥12000r/min。
玻璃注射器：10mL。
试验筛：孔径1mm。
空气压力泵。
超声波发生器：功率>180W。
氮吹仪。
离心机：≥10000r/min。
涡旋混合器
往复式摇床：≥250r/min。
pH计：精度为0.01。
5分析步骤
5.1试样制备与提取
5.1.1谷物、油料及其制品
5.1.1.1粮食和粮食制品
颗粒状样品需全部粉碎通过试验筛（孔径1mm），混匀后备用GB5009.96—2016
提取方法1：称取试样25.0g（精确到0.1g）.加人100mL提取液Ⅲ，高速均质3min或振荡30min，定量滤纸过滤，移取4mL滤液加人26mL磷酸盐缓冲液混合均匀.混匀后于8000r/min离心5min，上清作为滤液A备用。
提取方法2称取试样25.0g（精确到0.1g），加人100mL提取液I，高速均质3min或振荡30min，定量滤纸过滤，移取10mL滤液加入40mL磷酸盐缓冲液稀释至50mL，混合均，经玻璃纤维滤纸过滤，滤液B收集于干净容器中，备用。5.1.1.2食用植物油
准确称取试样5.0g（精确到0.1g），加人1g氯化钠及25mL提取液I.振荡30min，于6000r/min离心10min，移取15mL上层提取液，加入30mL磷酸盐缓冲液混合均匀，经玻璃纤维滤纸过滤，滤液C收集于干净容器中，备用。
5.1.1.3大豆、油菜籽
准确称取试样50.0g（精确到0.1g）（大豆需要磨细且粒度≤2mm）于均质器配置的搅拌杯中，加人5g氯化钠及100mL甲醇（适用于油菜籽）或100mL提取液I，以均质器高速均质提取1min。定量滤纸过滤，移取10mL滤液并加入40mL水稀释，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液D收集于干净容器中，备用。
5.1.2酒类
取脱气酒类试样（含二氧化碳的酒类样品使用前先置于4℃冰箱冷藏30min，过滤或超声脱气）或其他不含二氧化碳的酒类试样20.0g（精确到0.1g），置于25mL容量瓶中，加提取液Ⅱ定容至刻度，混匀，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液E收集于干净容器中，备用。5.1.3酱油、醋、酱及酱制品
称取25.0g（精确到0.1g）混匀的试样，加提取液I定容至50mL，超声提取5min。定量滤纸过滤，移取10mL滤液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混勾，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液F收集于干净容器中，备用。
5.1.4葡萄干
称取粉碎试样50.0g（精确到0.1g）于均质器配置的搅拌杯中，加入100mL碳酸氢钠溶液，将搅拌杯置于均质器上，以22000r/min高速均质提取1min。定量滤纸过滤，准确移取10mL滤液并加人40mL淋洗缓冲液稀释，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液G收集于干净容器中，备用。5.1.5胡椒粒/粉
称取粉碎试样25.0g（精确到0.1g）于均质器配置的搅拌杯中，加人100mL碳酸氢钠溶液，将搅拌3
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杯置于均质器上，以22000r/min高速均质提取1min。将提取物置离心杯中以4000r/min离心15min。移取20mL滤液并加人30mL淋洗缓冲液稀释，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液H收集于干净容器中，备用。
5.2试样净化
5.2.1谷物、油料及其制品
5.2.1.1粮食和粮食制品
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取提取方法1中全部滤液A或提取方法2中20mL滤液B.注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10mL真菌毒素清洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s～2滴/s，弃去全部流出液，抽干小柱。5.2.1.2食用植物油
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取30mL滤液C，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10mL真菌毒素清洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s～2滴/s.弃去全部流出液，抽干小柱。
5.2.1.3大豆、油菜籽
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取10mL滤液D.注人玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进人亲和柱中，依次用10mL真菌毒素清洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s～2滴/s，弃去全部流出液，抽干小柱。
5.2.2酒类
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取10mL滤液E，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10mL冲洗液（3.2.4）、10mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s2滴/s，弃去全部流出液，抽干小柱。
5.2.3酱油、醋、酱及酱制品
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取10mL滤液F.注人玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10mL真菌毒素清洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s~2滴/s，弃去全部流出液，抽干小柱，
5.2.4葡萄干
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取10mL滤液G，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进人亲和柱中，依次用10mL淋洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s～2滴/s，弃去全部流出液，抽干小柱。
5.2.5胡椒粒/粉
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将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取10mL滤液H.注人玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10mL淋洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s～2滴/s，弃去全部流出液，抽千小柱。
5.3洗脱
准确加人1.5mL甲醇或免疫亲和柱厂家推荐的洗脱液进行洗脱，流速约为1滴/s，收集全部洗脱液于干净的玻璃试管中，45℃下氮气吹干。用流动相溶解残渣并定容到500uL，供检测用。5.4试样测定
高效液相色谱参考条件
高效液相色谱参考条件列出如下：色谱柱：Cis柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm，或等效柱；a
流动相：乙腈-水-冰乙酸（96+102+2）：b）
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
进样量：50μL；
检测波长：激发波长333nm，发射波长460nm。色谱测定
在5.4.1色谱条件下，将赭曲霉毒素A标准工作溶液按浓度从低到高依次注人高效液相色谱仪，待仪器条件稳定后，以目标物质的浓度为横坐标（轴），目标物质的峰面积积为纵坐标（y轴），对各个数据点进行最小二乘线性拟合，标准工作曲线按式（1)计算：y=ar+6
式中：
J——目标物质的峰面积比；
——回归曲线的斜率；
x——目标物质的浓度；
b——回归曲线的截距。
标准工作溶液和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内，如果样品含量超过标准曲线范围，需稀释后再测定。
5.4.3空白试验
不称取试样按5.1、5.2和5.3的步骤做空白试验。应确认不含有干扰待测组分的物质。6分析结果的表述
试样中赭曲霉毒素A的含量按式(2)计算：X=p×V×1000
mx1000
.（2）
式中：
试样中赭曲霉毒素A的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；试样测定液中赭曲霉毒素A的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)：试样测定液最终定容体积，单位为毫升（mL)；1000——单位换算常数；
试样的质量，单位为克（g）；
稀释倍数。
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计算结果时需扣除空白值，检测结果以两次测定值的算数平均值表示，计算结果保留两位有效数字。
7精密度
样品中赭曲霉毒素A含量在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
8其他
粮食和粮食制品、食用植物油、大豆、油菜籽、葡萄干、胡椒粒/粉的检出限和定量限分别为0.3ug/kg和1ug/kg。酒类的检出限和定量限分别为0.1μg/kg和0.3μg/kg。酱油、醋、酱及酱制品的检出限和定量限分别为0.5ug/kg和1.5ug/kg。第二法离子交换固相萃取柱净化高效液相色谱法9原理
用提取液提取试样中的赭曲霉毒素A，经离子交换固相萃取柱净化后，采用高效液相色谱仪结合荧光检测器测定曲霉毒素A的含量，外标法定量。试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。10.1试剂
乙睛(CH,CN)：色谱纯、
甲醇（CHOH)：色谱纯。
冰乙酸（C,H,O2）。
石油醚：分析纯，60℃～90℃。甲酸（CH,O2)。
三氯甲烷（CHCla）。
碳酸氢钠（NaHCO）。
磷酸（H,PO)。
氢氧化钾(KOH)。
10.2试剂配制
氢氧化钾溶液（0.1mol/L）：称取氢氧化钾0.56g.溶于100mL水磷酸水溶液（0.1mol/L)：移取0.68mL磷酸，溶于100mL水。碳酸氢钠溶液（30g/L）：称取碳酸氢钠30.0g溶于1000mL水。乙酸水溶液（2%）：移取20mL冰乙酸，溶于980mL水。提取液：氢氧化钾溶液（0.1mol/L)-甲醇-水（2+60十38）。淋洗液：氢氧化钾溶液（0.1mol/L）-乙腈-水（3十50十47）。洗脱液：甲醇-乙腈-甲酸-水（40+50+5+5）。甲醇-碳酸氢钠溶液（30g/L）（50+50）。乙腈-2%乙酸水溶液（50+50）。10.3标准品
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赭曲霉毒素A（C2H1sCINO，CAS号：303-47-9），纯度≥99%。或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.4标准溶液配制
10.4.1赭曲霉毒素A标准储备液：准确称取一定量的赭曲霉毒素A标准品.用甲醇溶解配制成100ug/mL的标准储备液，于一20℃避光保存10.4.2赭曲霉毒素A标准工作液：准确移取一定量的赭曲霉毒素A标准储备液（10.4.1）.用甲醇溶解配制成1ug/mL的标准储备液，于4℃避光保存。10.4.3猪曲毒素A系列标准工作液：准确移取适量猪曲霉毒素A标准工作液（10.4.2），用甲醇稀释配制成1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL的系列标准工作液。11
仪器和设备
高效液相色谱仪配荧光检测器。11.1
11.2分析天平：感量0.01g和0.0001g。11.3固相萃取柱：高分子聚合物基质阴离子交换固相萃取柱，柱规格3mL，柱床重量200mg，或等效柱。
11.4氮吹仪。
涡旋振荡器。
11.6旋转蒸发仪。
高速万能粉碎机：≥12000r/min。11.820目筛。
有机滤膜：孔径0.45μm。
快速定性滤纸。
分析步骤
12.1试样制备
玉米、稻谷（糙米）、小麦、小麦粉、大豆及咖啡豆等用高速万能粉碎机将样品粉碎，过20目筛后混匀备用。
12.2试样提取
12.2.1玉米
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称取试样10.0g（精确至0.01g），加入50mL三氯甲烷和5mL0.1mol/L的磷酸水溶液，于涡旋振荡器上振荡提取3min~5min，提取液用定性滤纸过滤，取10mL下层滤液至100mL平底烧瓶中，于40℃水浴中用旋转蒸发仪旋转蒸发至近干，用20mL石油醚溶解残渣后加入10mL提取液，再用涡旋振荡器振荡提取3min5min，静置分层后取下层溶液.用滤纸过滤，取5mL滤液进行固相萃取净化。
12.2.2稻谷（糙米）、小麦、小麦粉、大豆称取试样10.0g（精确至0.01g），加人50mL提取液，于涡旋振荡器上振荡提取3min～5min，用定性滤纸过滤，取10mL滤液至100mL平底烧瓶中，加人20mL石油醚，涡旋振荡器振荡提取3min~5min，静置分层后取下层溶液.用滤纸过滤，取5mL滤液进行固相萃取净化，12.2.3咖啡
称取试样2.5g（精确至0.01g）于50mL聚丙烯锥形试管（带盖）中，加入25mL甲醇-碳酸氢钠溶液于涡旋振荡器振荡提取3min~5min，4000r/min离心10min后上清液用滤纸过滤，取10mL滤液进行固相萃取净化。
12.2.4葡萄酒
移取试样10.0g（精确至0.01g）于烧杯中，加入6mL提取液，混匀，再用氢氧化钾溶液调pH至9.0~10.0进行固相萃取净化
12.3试样净化
分别用5mL甲醇、3mL提取液活化固相萃取柱，然后将12.2制备的样品提取液加入固相萃取柱，调节流速以1滴/s~2滴/s的速度通过柱子，分别依次用3mL淋洗液3mL水、3mL甲醇淋洗柱，抽干，用5mL洗脱液洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中，于45℃下氮气吹干，用1mL乙睛-2%乙酸水溶液溶解，过滤后备用。
12.4高效液相色谱参考条件
高效液相色谱参考条件列出如下：色谱柱：Ci柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm，或等效柱；a）
b）柱温：30℃；
c）进样量：10μL；
d）流速：1mL/min；
检测波长：激发波长：333nm，发射波长：460nme）
流动相及洗脱条件：
流动相：A：冰乙酸-水（2+100），B：乙腈：等度洗脱条件：A-B（50+50）；梯度洗脱条件：见表1。8
时间/min
表1流动相及梯度洗脱条件
流动相A/%
注：咖啡和葡萄酒样品测定采用梯度洗脱程序，其他样品采用等度洗脱程序12.5
色谱测定
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流动相B/%
在12.4的色谱条件下，将赭曲霉毒素A标准工作溶液按浓度从低到高依次注人高效液相色谱仪；待仪器条件稳定后，以目标物质的浓度为横坐标（x轴），目标物质的峰面积为纵坐标（轴），对各个数据点进行最小二乘线性拟合，标准工作曲线按式（3）计算：y=ax+b
式中：
目标物质的峰面积；
回归曲线的斜率；
目标物质的浓度；
回归曲线的截距。
注：咖啡和葡萄酒样品测定采用梯度洗脱程序，其他样品采用等度洗脱程序。13
分析结果的表述
试样中赭曲霉毒素A的含量按式(4)计算：X=pxVx1000
mx1000
式中：
试样中赭曲霉毒素A的含量，单位为微克每千克（ug/kg）；待测试样液中赭曲霉毒素A的含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）；试样测定液最终定容体积，单位为毫升（mL）；单位换算系数；
试样的质量，单位为克（g）；
稀释倍数。
***...(4)
计算结果（需扣除空白值)以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。
14精密度
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在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。5其他
葡萄酒检出限为0.1μg/L，定量限为0.33μg/L：其他样品检出限为1.0μg/kg，定量限为3.3μg/kg。第三法免疫亲和层析净化液相色谱-串联质谱法5原理
用提取液提取试样中的曲霉毒素A，经免疫亲和柱净化后，采用液相色谱-串联质谱测定赭曲霉毒素A的含量，外标法定量。
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。17.1试剂
甲醇(CH.OH)：色谱纯。
乙睛（CH,CN）：色谱纯。
甲酸（HCOOH)：色谱纯。
甲酸铵（HCOONH）：色谱纯。
氯化钠(NaCI)。
碳酸氢钠（NaHCO）。
试剂配制
提取液I：甲醇-水（80+20）。
提取液IⅡ：称取150.0g氯化钠、20.0g碳酸氢钠溶于约950mL水中，加水定容至1L。提取液Ⅲ：甲醇-3%碳酸氢钠溶液（50+50）。3%碳酸氢钠溶液：称取30.0g碳酸氢钠.加水定容至1L。苯基硅烷固相萃取柱淋洗液1：甲醇-3%碳酸氢钠溶液（25+75）。苯基硅烷固相萃取柱淋洗液2：称取10.0g碳酸氢钠，加水定容至1L。苯基硅烷固相萃取柱洗脱液：甲醇-水（7十93）。磷酸盐缓冲液（PBS)：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾用水溶解，调节pH至7.0，加水定容至1L。定容溶液：乙腈-水（35十65）。17.2.9
17.3标准品
赭曲霉毒素A（C2HisCINO6.CAS号：303-47-9），纯度≥99%。或经国家认证并授予标准物质证10
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食品安全国家标准
食品中赭曲霉毒素A的测定
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中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局
GB5009.96—2016
本标准代替GB/T23502—2009《食品中赭曲霉毒素A的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》、GB/T25220—2010《粮油检验粮食中赭曲霉毒素A的测定高效液相色谱法和荧光光度法》、GB/T5009.96—2003《谷物和大豆中赭曲霉毒素A的测定》、SN/T1746—2006《进出口大豆、油菜籽和食用植物油中赭曲霉毒素A的检验方法》、SN/T19402007《进出口食品中赭曲霉毒素A的测定方法》和SN0211—1993《出口粮谷中棕曲霉毒素A的检验方法》。本标准与GB/T23502—2009相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准食品中赭曲霉毒素A的测定”；增加了第三法免疫亲和层析净化液相色谱-串联质谱法和第四法酶联免疫吸附测定法；增加了适用范围并优化了提取方法；一删除了免疫亲和柱层析净化荧光光度法。I
1范围
食品安全国家标准
食品中赭曲霉毒素A的测定
本标准规定了食品中赭曲霉毒素A的测定方法GB 5009.96—2016
本标准第一法适用于谷物、油料及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品、葡萄干、胡椒粒/粉中赭曲毒素A的测定，第二法适用于玉米、稻谷（糙米）、小麦、小麦粉、大豆、咖啡、葡萄酒中赭曲霉毒素A的测定，第三法适用于玉米、小麦等粮食产品、辣椒及其制品等、啤酒等酒类、酱油等产品、生咖啡、熟咖啡中赭曲霉毒素A的测定，第四法适用于玉米、小麦、大麦、大米、大豆及其制品中赭曲霉毒素A的测定：第五法适用于小麦、玉米、大豆中赭曲霉毒素A的测定。免疫亲和层析净化液相色谱法
第一法
2原理
用提取液提取试样中的赭曲霉毒素A，经免疫亲和柱净化后，采用高效液相色谱结合荧光检测器测定赭曲霉毒素A的含量，外标法定量。3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂
甲醇（CHOH)：色谱纯。
乙睛（CH.CN）：色谱纯。
3.1.3冰乙酸（C,H,O,）：色谱纯3.1.4氯化钠(NaCI)。
3.1.5聚乙二醇[HOCH,（CH,O·CH,）,CH,OHI。3.1.6吐温20（C5H114O26）。
3.1.7碳酸氢钠（NaHCO）。
3.1.8磷酸二氢钾（KH,PO4）。
3.1.9浓盐酸(HCI)。
氮气（N2）：纯度≥99.9%
3.2试剂配制
提取液I：甲醇-水（80十20）。3.2.1
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3.2.2提取液ll：称取150.0g氯化钠、20.0g碳酸氢钠溶于约950mL水中，加水定容至1L3.2.3提取液Ⅲ：乙腈-水（60+40）。3.2.4冲洗液：称取25.0g氯化钠、5.0g碳酸氢钠溶于约950mL水中，加水定容至1L3.2.5真菌毒素清洗缓冲液：称取25.0g氯化钠、5.0g碳酸氢钠溶于水中，加入0.1mL吐温20，用水稀释至1L。
3.2.6磷酸盐缓冲液：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾溶解于约990ml水中.用浓盐酸调节pH至7.0.用水稀释至1L。3.2.7碳酸氢钠溶液（10g/L）：称取1.0g碳酸氢钠.用水溶解并稀释到100mL。3.2.8淋洗缓冲液：在1000mL磷酸盐缓冲液中加人1.0mL吐温20。3.3标准品
储曲霉毒素A（CHi：C1NO.CAS号：303-47-9），纯度≥99%。或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.4标准溶液配制
3.4.1赭曲霉毒素A标准储备液：准确称取一定量的赭曲霉毒素A标准品，用甲醇-乙睛（50十50）溶解，配成0.1mg/mL的标准储备液，在一20℃保存，可使用3个月。3.4.2赭曲霉毒素A标准工作液：根据使用需要，准确移取一定量的赭曲霉毒素A标准储备液（3.4.1），用流动相稀释，分别配成相当于1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL的标准工作液，4℃保存，可使用7d。
3.5材料
3.5.1赭曲霉毒素A免疫亲和柱：柱规格1mL或3mL，柱容量≥100ng，或等效柱。3.5.2定量滤纸。
3.5.3玻璃纤维滤纸：直径11cm，孔径1.5um，无荧光特性。4仪器和设备
分析天平：感量0.001g。
高效液相色谱仪，配荧光检测器。高速均质器：≥12000r/min。
玻璃注射器：10mL。
试验筛：孔径1mm。
空气压力泵。
超声波发生器：功率>180W。
氮吹仪。
离心机：≥10000r/min。
涡旋混合器
往复式摇床：≥250r/min。
pH计：精度为0.01。
5分析步骤
5.1试样制备与提取
5.1.1谷物、油料及其制品
5.1.1.1粮食和粮食制品
颗粒状样品需全部粉碎通过试验筛（孔径1mm），混匀后备用GB5009.96—2016
提取方法1：称取试样25.0g（精确到0.1g）.加人100mL提取液Ⅲ，高速均质3min或振荡30min，定量滤纸过滤，移取4mL滤液加人26mL磷酸盐缓冲液混合均匀.混匀后于8000r/min离心5min，上清作为滤液A备用。
提取方法2称取试样25.0g（精确到0.1g），加人100mL提取液I，高速均质3min或振荡30min，定量滤纸过滤，移取10mL滤液加入40mL磷酸盐缓冲液稀释至50mL，混合均，经玻璃纤维滤纸过滤，滤液B收集于干净容器中，备用。5.1.1.2食用植物油
准确称取试样5.0g（精确到0.1g），加人1g氯化钠及25mL提取液I.振荡30min，于6000r/min离心10min，移取15mL上层提取液，加入30mL磷酸盐缓冲液混合均匀，经玻璃纤维滤纸过滤，滤液C收集于干净容器中，备用。
5.1.1.3大豆、油菜籽
准确称取试样50.0g（精确到0.1g）（大豆需要磨细且粒度≤2mm）于均质器配置的搅拌杯中，加人5g氯化钠及100mL甲醇（适用于油菜籽）或100mL提取液I，以均质器高速均质提取1min。定量滤纸过滤，移取10mL滤液并加入40mL水稀释，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液D收集于干净容器中，备用。
5.1.2酒类
取脱气酒类试样（含二氧化碳的酒类样品使用前先置于4℃冰箱冷藏30min，过滤或超声脱气）或其他不含二氧化碳的酒类试样20.0g（精确到0.1g），置于25mL容量瓶中，加提取液Ⅱ定容至刻度，混匀，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液E收集于干净容器中，备用。5.1.3酱油、醋、酱及酱制品
称取25.0g（精确到0.1g）混匀的试样，加提取液I定容至50mL，超声提取5min。定量滤纸过滤，移取10mL滤液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混勾，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液F收集于干净容器中，备用。
5.1.4葡萄干
称取粉碎试样50.0g（精确到0.1g）于均质器配置的搅拌杯中，加入100mL碳酸氢钠溶液，将搅拌杯置于均质器上，以22000r/min高速均质提取1min。定量滤纸过滤，准确移取10mL滤液并加人40mL淋洗缓冲液稀释，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液G收集于干净容器中，备用。5.1.5胡椒粒/粉
称取粉碎试样25.0g（精确到0.1g）于均质器配置的搅拌杯中，加人100mL碳酸氢钠溶液，将搅拌3
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杯置于均质器上，以22000r/min高速均质提取1min。将提取物置离心杯中以4000r/min离心15min。移取20mL滤液并加人30mL淋洗缓冲液稀释，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液H收集于干净容器中，备用。
5.2试样净化
5.2.1谷物、油料及其制品
5.2.1.1粮食和粮食制品
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取提取方法1中全部滤液A或提取方法2中20mL滤液B.注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10mL真菌毒素清洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s～2滴/s，弃去全部流出液，抽干小柱。5.2.1.2食用植物油
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取30mL滤液C，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10mL真菌毒素清洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s～2滴/s.弃去全部流出液，抽干小柱。
5.2.1.3大豆、油菜籽
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取10mL滤液D.注人玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进人亲和柱中，依次用10mL真菌毒素清洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s～2滴/s，弃去全部流出液，抽干小柱。
5.2.2酒类
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取10mL滤液E，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10mL冲洗液（3.2.4）、10mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s2滴/s，弃去全部流出液，抽干小柱。
5.2.3酱油、醋、酱及酱制品
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取10mL滤液F.注人玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10mL真菌毒素清洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s~2滴/s，弃去全部流出液，抽干小柱，
5.2.4葡萄干
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取10mL滤液G，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进人亲和柱中，依次用10mL淋洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s～2滴/s，弃去全部流出液，抽干小柱。
5.2.5胡椒粒/粉
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将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取10mL滤液H.注人玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10mL淋洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s～2滴/s，弃去全部流出液，抽千小柱。
5.3洗脱
准确加人1.5mL甲醇或免疫亲和柱厂家推荐的洗脱液进行洗脱，流速约为1滴/s，收集全部洗脱液于干净的玻璃试管中，45℃下氮气吹干。用流动相溶解残渣并定容到500uL，供检测用。5.4试样测定
高效液相色谱参考条件
高效液相色谱参考条件列出如下：色谱柱：Cis柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm，或等效柱；a
流动相：乙腈-水-冰乙酸（96+102+2）：b）
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
进样量：50μL；
检测波长：激发波长333nm，发射波长460nm。色谱测定
在5.4.1色谱条件下，将赭曲霉毒素A标准工作溶液按浓度从低到高依次注人高效液相色谱仪，待仪器条件稳定后，以目标物质的浓度为横坐标（轴），目标物质的峰面积积为纵坐标（y轴），对各个数据点进行最小二乘线性拟合，标准工作曲线按式（1)计算：y=ar+6
式中：
J——目标物质的峰面积比；
——回归曲线的斜率；
x——目标物质的浓度；
b——回归曲线的截距。
标准工作溶液和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内，如果样品含量超过标准曲线范围，需稀释后再测定。
5.4.3空白试验
不称取试样按5.1、5.2和5.3的步骤做空白试验。应确认不含有干扰待测组分的物质。6分析结果的表述
试样中赭曲霉毒素A的含量按式(2)计算：X=p×V×1000
mx1000
.（2）
式中：
试样中赭曲霉毒素A的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；试样测定液中赭曲霉毒素A的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)：试样测定液最终定容体积，单位为毫升（mL)；1000——单位换算常数；
试样的质量，单位为克（g）；
稀释倍数。
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计算结果时需扣除空白值，检测结果以两次测定值的算数平均值表示，计算结果保留两位有效数字。
7精密度
样品中赭曲霉毒素A含量在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
8其他
粮食和粮食制品、食用植物油、大豆、油菜籽、葡萄干、胡椒粒/粉的检出限和定量限分别为0.3ug/kg和1ug/kg。酒类的检出限和定量限分别为0.1μg/kg和0.3μg/kg。酱油、醋、酱及酱制品的检出限和定量限分别为0.5ug/kg和1.5ug/kg。第二法离子交换固相萃取柱净化高效液相色谱法9原理
用提取液提取试样中的赭曲霉毒素A，经离子交换固相萃取柱净化后，采用高效液相色谱仪结合荧光检测器测定曲霉毒素A的含量，外标法定量。试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。10.1试剂
乙睛(CH,CN)：色谱纯、
甲醇（CHOH)：色谱纯。
冰乙酸（C,H,O2）。
石油醚：分析纯，60℃～90℃。甲酸（CH,O2)。
三氯甲烷（CHCla）。
碳酸氢钠（NaHCO）。
磷酸（H,PO)。
氢氧化钾(KOH)。
10.2试剂配制
氢氧化钾溶液（0.1mol/L）：称取氢氧化钾0.56g.溶于100mL水磷酸水溶液（0.1mol/L)：移取0.68mL磷酸，溶于100mL水。碳酸氢钠溶液（30g/L）：称取碳酸氢钠30.0g溶于1000mL水。乙酸水溶液（2%）：移取20mL冰乙酸，溶于980mL水。提取液：氢氧化钾溶液（0.1mol/L)-甲醇-水（2+60十38）。淋洗液：氢氧化钾溶液（0.1mol/L）-乙腈-水（3十50十47）。洗脱液：甲醇-乙腈-甲酸-水（40+50+5+5）。甲醇-碳酸氢钠溶液（30g/L）（50+50）。乙腈-2%乙酸水溶液（50+50）。10.3标准品
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赭曲霉毒素A（C2H1sCINO，CAS号：303-47-9），纯度≥99%。或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.4标准溶液配制
10.4.1赭曲霉毒素A标准储备液：准确称取一定量的赭曲霉毒素A标准品.用甲醇溶解配制成100ug/mL的标准储备液，于一20℃避光保存10.4.2赭曲霉毒素A标准工作液：准确移取一定量的赭曲霉毒素A标准储备液（10.4.1）.用甲醇溶解配制成1ug/mL的标准储备液，于4℃避光保存。10.4.3猪曲毒素A系列标准工作液：准确移取适量猪曲霉毒素A标准工作液（10.4.2），用甲醇稀释配制成1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL的系列标准工作液。11
仪器和设备
高效液相色谱仪配荧光检测器。11.1
11.2分析天平：感量0.01g和0.0001g。11.3固相萃取柱：高分子聚合物基质阴离子交换固相萃取柱，柱规格3mL，柱床重量200mg，或等效柱。
11.4氮吹仪。
涡旋振荡器。
11.6旋转蒸发仪。
高速万能粉碎机：≥12000r/min。11.820目筛。
有机滤膜：孔径0.45μm。
快速定性滤纸。
分析步骤
12.1试样制备
玉米、稻谷（糙米）、小麦、小麦粉、大豆及咖啡豆等用高速万能粉碎机将样品粉碎，过20目筛后混匀备用。
12.2试样提取
12.2.1玉米
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称取试样10.0g（精确至0.01g），加入50mL三氯甲烷和5mL0.1mol/L的磷酸水溶液，于涡旋振荡器上振荡提取3min~5min，提取液用定性滤纸过滤，取10mL下层滤液至100mL平底烧瓶中，于40℃水浴中用旋转蒸发仪旋转蒸发至近干，用20mL石油醚溶解残渣后加入10mL提取液，再用涡旋振荡器振荡提取3min5min，静置分层后取下层溶液.用滤纸过滤，取5mL滤液进行固相萃取净化。
12.2.2稻谷（糙米）、小麦、小麦粉、大豆称取试样10.0g（精确至0.01g），加人50mL提取液，于涡旋振荡器上振荡提取3min～5min，用定性滤纸过滤，取10mL滤液至100mL平底烧瓶中，加人20mL石油醚，涡旋振荡器振荡提取3min~5min，静置分层后取下层溶液.用滤纸过滤，取5mL滤液进行固相萃取净化，12.2.3咖啡
称取试样2.5g（精确至0.01g）于50mL聚丙烯锥形试管（带盖）中，加入25mL甲醇-碳酸氢钠溶液于涡旋振荡器振荡提取3min~5min，4000r/min离心10min后上清液用滤纸过滤，取10mL滤液进行固相萃取净化。
12.2.4葡萄酒
移取试样10.0g（精确至0.01g）于烧杯中，加入6mL提取液，混匀，再用氢氧化钾溶液调pH至9.0~10.0进行固相萃取净化
12.3试样净化
分别用5mL甲醇、3mL提取液活化固相萃取柱，然后将12.2制备的样品提取液加入固相萃取柱，调节流速以1滴/s~2滴/s的速度通过柱子，分别依次用3mL淋洗液3mL水、3mL甲醇淋洗柱，抽干，用5mL洗脱液洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中，于45℃下氮气吹干，用1mL乙睛-2%乙酸水溶液溶解，过滤后备用。
12.4高效液相色谱参考条件
高效液相色谱参考条件列出如下：色谱柱：Ci柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm，或等效柱；a）
b）柱温：30℃；
c）进样量：10μL；
d）流速：1mL/min；
检测波长：激发波长：333nm，发射波长：460nme）
流动相及洗脱条件：
流动相：A：冰乙酸-水（2+100），B：乙腈：等度洗脱条件：A-B（50+50）；梯度洗脱条件：见表1。8
时间/min
表1流动相及梯度洗脱条件
流动相A/%
注：咖啡和葡萄酒样品测定采用梯度洗脱程序，其他样品采用等度洗脱程序12.5
色谱测定
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流动相B/%
在12.4的色谱条件下，将赭曲霉毒素A标准工作溶液按浓度从低到高依次注人高效液相色谱仪；待仪器条件稳定后，以目标物质的浓度为横坐标（x轴），目标物质的峰面积为纵坐标（轴），对各个数据点进行最小二乘线性拟合，标准工作曲线按式（3）计算：y=ax+b
式中：
目标物质的峰面积；
回归曲线的斜率；
目标物质的浓度；
回归曲线的截距。
注：咖啡和葡萄酒样品测定采用梯度洗脱程序，其他样品采用等度洗脱程序。13
分析结果的表述
试样中赭曲霉毒素A的含量按式(4)计算：X=pxVx1000
mx1000
式中：
试样中赭曲霉毒素A的含量，单位为微克每千克（ug/kg）；待测试样液中赭曲霉毒素A的含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）；试样测定液最终定容体积，单位为毫升（mL）；单位换算系数；
试样的质量，单位为克（g）；
稀释倍数。
***...(4)
计算结果（需扣除空白值)以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。
14精密度
GB5009.96—2016
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。5其他
葡萄酒检出限为0.1μg/L，定量限为0.33μg/L：其他样品检出限为1.0μg/kg，定量限为3.3μg/kg。第三法免疫亲和层析净化液相色谱-串联质谱法5原理
用提取液提取试样中的曲霉毒素A，经免疫亲和柱净化后，采用液相色谱-串联质谱测定赭曲霉毒素A的含量，外标法定量。
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。17.1试剂
甲醇(CH.OH)：色谱纯。
乙睛（CH,CN）：色谱纯。
甲酸（HCOOH)：色谱纯。
甲酸铵（HCOONH）：色谱纯。
氯化钠(NaCI)。
碳酸氢钠（NaHCO）。
试剂配制
提取液I：甲醇-水（80+20）。
提取液IⅡ：称取150.0g氯化钠、20.0g碳酸氢钠溶于约950mL水中，加水定容至1L。提取液Ⅲ：甲醇-3%碳酸氢钠溶液（50+50）。3%碳酸氢钠溶液：称取30.0g碳酸氢钠.加水定容至1L。苯基硅烷固相萃取柱淋洗液1：甲醇-3%碳酸氢钠溶液（25+75）。苯基硅烷固相萃取柱淋洗液2：称取10.0g碳酸氢钠，加水定容至1L。苯基硅烷固相萃取柱洗脱液：甲醇-水（7十93）。磷酸盐缓冲液（PBS)：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾用水溶解，调节pH至7.0，加水定容至1L。定容溶液：乙腈-水（35十65）。17.2.9
17.3标准品
赭曲霉毒素A（C2HisCINO6.CAS号：303-47-9），纯度≥99%。或经国家认证并授予标准物质证10
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