GB 5009.97-2016 食品安全国家标准 食品中环己基氨基磺酸钠的测定 GB5009.97-2016 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国国家标准
GB5009.97—2016
食品安全国家标准
食品中环已基氨基磺酸钠的测定2016-08-31发布
人民共和国
国家卫生和计划生育委员会
2017-03-01实施
本标准代替GB/T5009.97—2003《食品中环已基氨基磺酸钠的测定》。本标准与GB/T5009.97—2003相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准食品中环已基氨基磺酸钠的测定”；气相色谱法改为使用毛细管柱进行分析；—一优化了样品处理、衍生化和测定的条件；一增加液相色谱法；
增加液相色谱-质谱/质谱法：
GB5009.97—2016
删除GB/T5009.97一2003《食品中环已基氨基磺酸钠的测定》中的第二法比色法和第三法薄层色谱法。
1范围
食品安全国家标准
食品中环已基氨基磺酸钠的测定GB5009.97—2016
本标准规定了食品中环已基氨基磺酸钠（甜蜜素）的三种测定方法一气相色谱法、液相色谱法和液相色谱-质谱/质谱法。
本标准气相色谱法适用于饮料类、蜜钱凉果、果丹类、话化类、带壳及脱壳熟制坚果与籽类、水果罐头、果酱、糕点、面包、饼干、冷冻饮品、果冻、复合调味料、腌渍的蔬菜、腐乳食品中环已基氨基磺酸钠的测定。
本标准气相色谱法不适用于白酒中该化合物的测定本标准液相色谱法适用于饮料类、蜜饯凉果、果丹类、话化类、带壳及脱壳熟制坚果与籽类、配制酒水果罐头、果酱、糕点、面包、饼干、冷冻饮品、果冻、复合调味料、腌渍的蔬菜、腐乳食品中环己基氨基磺酸钠的测定
本标准液相色谱-质谱/质谱法适用于白酒、葡萄酒、黄酒、料酒中环己基氨基磺酸钠的测定。第一法
气相色谱法
2原理
食品中的环已基氨基磺酸钠用水提取，在硫酸介质中环已基氨基磺酸钠与亚硝酸反应，生成环已醇亚硝酸酯，利用气相色谱氢火焰离子化检测器进行分离及分析，保留时间定性，外标法定量。3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。3.1试剂
3.1.1正庚烷［CH,（CH),CH,]。3.1.2
氯化钠（NaCI)）
3.1.3石油醚：沸程为30℃～60℃。3.1.4氢氧化钠(NaOH)。
硫酸（H,SO）。
3.1.6亚铁氰化钾(K,［Fe(CN)。]·3H,O)。3.1.7下载标准就来标准下载网
硫酸锌（ZnSO,·7H,O)。
亚硝酸钠（NaNO2）。
试剂配制
氢氧化钠溶液（40g/L）：称取20g氢氧化钠，溶于水并稀释至500mL，混匀。1
GB5009.97—2016
3.2.2硫酸溶液（200g/L）：量取54mL硫酸小心缓缓加入400mL水中，后加水至500mL混匀。3.2.3亚铁氰化钾溶液（150g/L）：称取折合15g亚铁氰化钾（3.1.6）.溶于水稀释至100mL，混匀。3.2.4硫酸锌溶液（300g/L）：称取折合30g硫酸锌的试剂（3.1.7），溶于水并稀释至100mL，混匀。3.2.5亚硝酸钠溶液（50g/L）：称取25g亚硝酸钠，溶于水并稀释至500mL.混勾。3.3标准品
环已基氨基磺酸钠标准品（C,HNSO,Na）：纯度≥99%。3.4标准溶液的配制
3.4.1环已基氨基磺酸标准储备液（5.00mg/mL）：精确称取0.5612g环已基氨基磺酸钠标准品，用水溶解并定容至100mL，混匀.此溶液1.00mL相当于环已基氨基磺酸5.00mg（环已基氨基磺酸钠与环已基氨基磺酸的换算系数为0.8909）。置于1℃～4℃冰箱保存，可保存12个月3.4.2环已基氨基磺酸标准使用液（1.00mg/mL）：准确移取20.0mL环己基氨基磺酸标准储备液用水稀释并定容至100mL，混勾。置于1℃～4℃冰箱保存，可保存6个月。4仪器与设备
气相色谱仪：配有氢火焰离子化检测器（FID）。涡旋混合器。
离心机：转速≥4000r/min。
超声波振荡器。
样品粉碎机。
10μL微量注射器。
恒温水浴锅。
天平：感量1mg.0.1mg。
5分析步骤
5.1试样溶液的制备
5.1.1液体试样处理
5.1.1.1普通液体试样摇勾后称取25.0g试样（如需要可过滤）.用水定容至50mL备用5.1.1.2含二氧化碳的试样：称取25.0g试样于烧杯中，60℃水浴加热30min以除二氧化碳，放冷，用水定容至50mL备用。
5.1.1.3含酒精的试样：称取25.0g试样于烧杯中，用氢氧化钠溶液（3.2.1)调至弱碱性pH7~8，60℃水浴加热30min以除酒精，放冷，用水定容至50mL备用。5.1.2固体、半固体试样处理
5.1.2.1低脂、低蛋白样品（果酱、果冻、水果罐头、果丹类、蜜饯凉果、浓缩果汁、面包、糕点、饼干、复合调味料、带壳熟制坚果和籽类、腌渍的蔬菜等）：称取打碎、混匀的样品3.00g～5.00g于50mL离心管中，加30mL水，振摇，超声提取20min，混匀，离心（3000r/min）10min，过滤，用水分次洗涤残渣，收集滤液并定容至50mL，混匀备用。5.1.2.2高蛋白样品（酸乳、雪糕、冰淇淋等奶制品及豆制品、腐乳等）：冰棒、雪糕、冰淇淋等分别放置于2
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250mL烧杯中，待融化后搅匀称取；称取样品3.00g~5.00g于50mL离心管中，加30mL水，超声提取20min，加2mL亚铁氰化钾溶液，混匀，再加人2ml硫酸锌溶液，混匀，离心（3000r/min）10min，过滤，用水分次洗涤残渣，收集滤液并定容至50mL，混匀备用。5.1.2.3高脂样品（奶油制品、海鱼罐头、熟肉制品等）：称打碎、混匀的样品3.00g～5.00g于50mL离心管中，加人25mL石油醚.振摇，超声提取3min，再混匀，离心（1000r/min以上）10min，弃石油醚再用25mL石油醚提取一次，弃石油醚，60℃水浴挥发去除石油醚，残渣加30mL水，混匀，超声提取20min，加2mL亚铁氰化钾溶液，混匀，再加入2ml硫酸锌溶液，混匀，离心（3000r/min）10min过滤，用水洗涤残渣，收集滤液并定容至50mL，混匀备用。5.1.3衍生化
准确移取液体试样溶液（5.1.1）、固体、半固体试样溶液（5.1.2）10.0mL于50mL带盖离心管中离心管置试管架上冰浴中5min后，准确加入5.00mL正庚烷，加入2.5mL亚硝酸钠溶液，2.5mL硫酸溶液，盖紧离心管盖，摇匀，在冰浴中放置30min，其间振摇3次5次；加人2.5g氯化钠，盖上盖后置旋涡混合器上振动1min（或振摇60次~80次），低温离心（3000r/min）10min分层或低温静置20min至澄清分层后取上清液放置1℃～4℃冰箱冷藏保存以备进样用。5.2标准溶液系列的制备及衍生化准确移取1.00mg/mL环已基氨基磺酸标准溶液0.50mL、1.00mL、2.50mL、5.00mL、10.0mL、25.0mL于50mL容量瓶中，加水定容。配成标准溶液系列浓度为：0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.50mg/mL。临用时配制以备衍生化用。准确移取标准系列溶液10.0mL同（5.1.3)衍生化。5.3测定
5.3.1色谱条件
5.3.1.1色谱柱：弱极性石英毛细管柱（内涂5%苯基甲基聚硅氧烷，30m×0.53mm×1.0μm）或等效柱。
5.3.1.2柱温升温程序：初温55℃保持3min，10℃/min升温至90℃保持0.5min，20℃/min升温至200℃保持3min。
5.3.1.3进样口：温度230℃；进样量1μL，不分流/分流进样，分流比1：5（分流比及方式可根据色谱仪器条件调整）。
5.3.1.4检测器：氢火焰离子化检测器（FID).温度260℃。5.3.1.5载气：高纯氮气，流量12.0mL/min，尾吹20mL/min。5.3.1.6氢气：30mL/min；空气330mL/min（载气、氢气、空气流量大小可根据仪器条件进行调整）。5.3.2色谱分析
分别吸取1μL经衍生化处理的标准系列各浓度溶液上清液（5.2）.注入气相色谱仪中，可测得不同浓度被测物的响应值峰面积，以浓度为横坐标，以环已醇亚硝酸酯和环已醇两峰面积之和为纵坐标，绘制标准曲线
在完全相同的条件下进样1μL经衍生化处理的试样待测液上清液（5.1.3），保留时间定性，测得峰面积，根据标准曲线得到样液中的组分浓度：试样上清液响应值若超出线性范围，应用正庚烷稀释后再进样分析。平行测定次数不少于两次。3
5分析结果的表述
试样中环已基氨基磺酸含量按式(1)计算：X,==×V
式中：
试样中环已基氨基磺酸的含量，单位为克每千克（g/kg)；C
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...（1)
由标准曲线计算出定容样液中环已基氨基磺酸的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；试样质量，单位为克（g)；
试样的最后定容体积，单位为毫升（mL）。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。8其他
取样量5g时，本方法检出限为0.010g/kg，定量限0.030g/kg。第二法
高效液相色谱法
9原理
食品中的环已基氨基磺酸钠用水提取后，在强酸性溶液中与次氯酸钠反应，生成N，N-二氯环已胺，用正庚烧萃取后，利用高效液相色谱法检测，保留时间定性，外标法定量。10
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水，10.1试剂
正庚烷[CH,（CH),CH,]：色谱纯乙睛(CH,CN)：色谱纯。
硫酸(H,SO,)。
次氯酸钠（NaCIO)
碳酸氢钠（NaHCO,）。
硫酸锌（ZnSO,·7H2O)。
亚铁氰化钾(K[Fe(CN)·3H,O)。石油醚：沸程为30℃~60℃。
试剂配制
硫酸溶液（1+1）：50mL硫酸小心缓缓加人50mL水中，混匀。4
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2次氯酸钠溶液：用次氯酸钠（10.1.4)稀释，保存于棕色瓶中，保持有效氯含量50g/L以上，混10.2.2
匀，市售产品需及时标定，临用时配制。10.2.3碳酸氢钠溶液（50g/L）：称取5g碳酸氢钠，用水溶解并稀释至100mL，混匀。硫酸锌溶液（300g/L）：称取折合30g硫酸锌（10.1.6)，溶于水并稀释至100mL，混匀。10.2.4
混匀。
亚铁氰化钾溶液（150g/L）：称取折合15g亚铁氰化钾（10.1.7），溶于水并稀释至100mL，10.3标准品
环已基氨基磺酸钠标准品（C,H1zNSONa）：纯度≥99%。10.4标准溶液配制
10.4.1环已基氨基磺酸标准储备液（5.00mg/mL）：按第一法3.4.1配制。10.4.2环已基氨基磺酸标准中间液（1.00mg/mL）：按第一法3.4.2配制。10.4.3环已基氨基磺酸标准曲线系列工作液：分别吸取标准中间液（10.4.2)0.50mL、1.0mL、2.5ml5.0mL、10.0mL至50mL容量瓶中，用水定容。该标准系列浓度分别为10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL。临用现配。11
仪器和设备
11.1液相色谱仪，配有紫外检测器或二极管阵列检测器。11.2超声波振荡器。
11.3离心机：转速≥4000r/min
11.4样品粉碎机。
11.5恒温水浴锅。
6天平：感量1mg、0.1mg。
2分析步骤
12.1试样溶液的制备
固体类和半固体类试样处理
称取均质后试样5.00g于50mL离心管中，加人30mL水，混匀.超声提取20min，离心（3000r/min）20min，将上清液转出，用水洗涤残渣并定容至50mL备用。含高蛋白类样品可在超声提取时加入2.0mL硫酸锌溶液（10.2.4）和2.0mL亚铁氰化钾溶液（10.2.5）。含高脂质类样品可在提取前先加人25mL石油醚（10.1.8）振摇后弃去石油醚层除脂12.1.2液体类试样处理
12.1.2.1普通液体试样摇匀后可直接称取样品25.0g，用水定容至50mL备用（如需要可过滤）。12.1.2.2含二氧化碳的试样：称取25.0g试样于烧杯中，60℃水浴加热30min以除二氧化碳，放冷，用水定容至50mL备用。
12.1.2.3含酒精的试样：称取25.0g试样于烧杯中，用氢氧化钠溶液调至弱碱性pH7～8，60℃水浴加热30min以除酒精，放冷.用水定容至50mL备用。12.1.2.4含乳类饮料称取试样25.0g于50mL离心管中，加入3.0mL硫酸锌溶液（10.2.4）和3.0mL5
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亚铁氰化钾溶液（10.2.5），混匀，离心分层后，将上清液转出，用水洗涤残渣并定容至50mL备用。12.1.3衍生化
准确移取10mL已制备好的试样溶液（12.1.1或12.1.2），加入2.0mL硫酸溶液（10.2.1）,5.0mL正庚烷（10.1.1），和1.0mL次氯酸钠溶液（10.2.2），剧烈振荡1min，静置分层，除去水层后在正庚烷层中加入25mL碳酸氢钠溶液（10.2.3）.振荡1min。静置取上层有机相经0.45um微孔有机相滤膜过滤，滤液备进样用。
12.2仪器参考条件
色谱柱：Cls柱，5μm，150mmX3.9mm(i,d），或同等性能的色谱柱。流动相：乙腈+水（70+30）。
流速：0.8mL/min。
进样量：10μl。
柱温：40℃。
检测器：紫外检测器或二极管阵列检测器。检测波长：314nm。
12.3标准曲线的制作
移取10mL环已基氨基磺酸标准系列工作液（10.4.3）按12.1.3衍生化。取过0.45μm微孔有机相滤膜后的溶液10μL分别注人液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准工作溶液的浓度为横坐标，以环已基氨基磺酸钠衍生化产物N，N-二氯环已胺峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。12.4样品的测定
将衍生后试样溶液（12.1.3)10μL注人液相色谱仪中，保留时间定性，测得峰面积，根据标准曲线得到试样定容溶液中环已基氨基磺酸的浓度，平行测定次数不少于两次。3分析结果的表述
试样中环已基氨基磺酸含量按式（2）计算：X2
式中：
mX1000
试样中环已基氨基磺酸的含量，单位为克每千克（g/kg)；.（2）
由标准曲线计算出试样定容溶液中环已基氨基磺酸的浓度，单位为微克每毫升（ug/mL)；一试样的最后定容体积，单位为毫升（mL)；-试样的质量，单位为克（g）；由ug/g换算成g/kg的换算因子
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。14精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。6
5其他
取样量5g时，本方法检出限为0.010g/kg，定量限0.030g/kg。第三法液相色谱-质谱/质谱法
5原理
GB5009.97—2016
酒样经水浴加热除去乙醇后以水定容，用液相色谱-质谱/质谱仪测定其中的环已基氨基磺酸钠，外标法定量。
17试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水17.1试剂
17.1.1甲醇（CH,OH）：色谱纯。17.1.2乙酸铵（CH.COONH)。
17.1.310mmol/L乙酸铵溶液：称取0.78g乙酸铵，用水溶解并稀释至1000mL，摇匀后经0.22um水相滤膜过滤备用。
17.2标准品
环已基氨基磺酸钠标准品（C,Hi2NSO.Na）：纯度99%。17.3标准溶液配制
17.3.1环已基氨基磺酸标准储备液（5.00mg/mL）：按第一法3.4.1配制。17.3.2环已基氨基磺酸标准中间液（1.00mg/ml）：按第一法3.4.2配制。17.3.3环已基氨基磺酸标准工作液（10μg/mL）：用水将1.00mL标准中间液（17.3.2）定容至100mL。放置于1℃～4℃冰箱可保存一周。17.3.4环已基氨基磺酸标准曲线系列工作液：分别吸取适量体积的标准工作液（17.3.3），用水稀释，配成浓度分别为0.01μg/mL.0.05uμg/mL.0.1μg/mL.0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0uμg/mL的系列标准工作溶液。使用前配置。
17.4微孔滤膜：0.22um，水相。18
仪器和设备
液相色谱-质谱/质谱仪.配有电喷雾（ESI）离子源。18.2分析天平，感量0.1mg.0.1g。18.3恒温水浴锅
分析步骤
19.1试样溶液制备
称取酒样10.0g，置于50mL烧杯中，于60℃水浴上加热30min，残渣全部转移至100mL容量瓶中，用水定容并摇匀，经0.22μm水相微孔滤膜过滤后备用19.2仪器参考条件
色谱柱：Ci柱，1.7μm，100mmX2.1mm(i.d），或同等性能的色谱柱。19.2.1.1
19.2.1.2流动相：甲醇、10mmol/L乙酸铵溶液。19.2.1.3梯度洗脱：参见附录A中的表A.1。19.2.1.4流速：0.25mL/min。
19.2.1.5进样量：10μL。
柱温：35℃。
质谱操作条件
19.2.2.1离子源：电喷雾电离源（ESI）。19.2.2.2扫描方式：多反应监测（MRM)扫描GB5009.97—2016
19.2.2.3质谱调谐参数应优化至最佳条件，确保环已基氨基磺酸钠在正离子模式下的灵敏度达到最佳状态，并调节正、负模式下定性离子的相对丰度接近。质谱调谐参数和定性、定量离子参见附录A19.3标准曲线的制作
将配制好的标准系列溶液（17.3.4)按照浓度由低到高的顺序进样测定，以环已基氨基磺酸钠定量离子的色谱峰面积对相应的浓度作图，得到标准曲线回归方程。典型的环已基氨基磺酸钠标准溶液选择反应监测质量色谱图参见附录B。19.4定性测定
在相同的试验条件下测定试样溶液（19.1），若试样溶液质量色谱图中环已基氨基磺酸钠的保留时间与标准溶液一致（变化范围在土2.5%以内），且试样定性离子的相对丰度与浓度相当的标准溶液中定性离子的相对丰度，其偏差不超过表1的规定，则可判定样品中存在环已基氨基磺酸钠。表1定性离子相对丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%
允许的相对偏差/%
19.5定量测定
>20~50
>10~20
将试样溶液注入液相色谱-质谱/质谱仪中，得到环已基氨基磺酸钠定量离子峰面积，根据标准曲线计算试样溶液中环已基氨基磺酸的浓度，平行测定次数不少于两次0分析结果的表述
试样中环已基氨基磺酸含量按式（3)计算：X-XV
式中：
试样中环己基氨基磺酸的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；X3
.（3）
由标准曲线计算出的试样溶液中环己基氨基磺酸的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)；8
V一试样的定容体积，单位为毫升（mL）；m试样的质量，单位为克(g)。
GB 5009.97—2016
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%2其他
本方法检出限为0.03mg/kg，定量限为0.1mg/kg。9
附录A
液相色谱-质谱/质谱参考条件
液相色谱梯度洗脱条件见表A.1。A.1
时间/min
负离子模式的质谱参考条件：
毛细管电压：2.8kV；
离子源温度：110℃；
脱溶剂气温度：450℃；
脱溶剂气（N，）流量：700L/h；锥孔气（Nz）流量：50L/h；
液相色谱梯度洗脱条件
甲醇/%
分辨率：Q1（单位质量分辨）Q3（单位质量分辨）；碰撞气及碰撞室压力：氩气，3.6×10-mPa；扫描方式：多反应监测（MRM）；GB5009.97—2016
10mmol/L乙酸铵溶液/%
环已基氨基磺酸钠参考保留时间、定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量见表A.2。正离子模式的质谱参考条件：
毛细管电压：3.5kV；
离子源温度：110℃；
脱溶剂气温度：450℃；
脱溶剂气（Nz）流量：700L/h；锥孔气（Nz）流量：50L/h；
分辨率：Q1（单位质量分辨）Q3（单位质量分辨）；碰撞气及碰撞室压力：氩气.3.6×10-mPa；扫描方式：多反应监测（MRM）；环已基氨基磺酸钠参考保留时间、定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量见表A.210
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