GB 5009.198-2016 食品安全国家标准 贝类中失忆性贝类毒素的测定 GB5009.198-2016 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国国家标准
GB5009.198—2016
食品安全国家标准
贝类中失忆性贝类毒素的测定
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局
GB 5009.198—2016
本标准代替GB/T5009.198—2003《贝类记忆丧失性贝类毒素软骨藻酸的测定》、SN/T1070—2002《进出口贝类中记忆丧失性贝类毒素检验方法》、SN/T1867—2007《进出口贝类中软骨藻酸的检测液相色谱-串联质谱法》、SN/T2663—2010《贝类中失忆性贝类毒素检验方法酶联免疫吸附
法》。
本标准与GB/T5009.198一2003相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准修改了固相萃取条件；
—改变了流动相；
一增加了酶联免疫吸附法；
增加了液相色谱-串联质谱法。
贝类中失忆性贝类毒素的测定”；I
1范围
食品安全国家标准
贝类中失忆性贝类毒素的测定
GB5009.198—2016
本标准规定了贝类中失忆性贝类毒素测定的酶联免疫吸附法、液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。
本标准中酶联免疫吸附法适用于贝类及其制品中失忆性贝类毒素的测定，液相色谱法和液相色谱串联质谱法适用于贝类及其制品（不包括盐渍制品）中失忆性贝类毒素软骨藻酸（DA)的测定。酶联免疫吸附法
2原理
本方法测定基础是竞争性酶联免疫反应，酶标板上包被有针对软骨藻酸抗体的捕捉抗体，加入抗软骨藻酸抗体、标准液或样品溶液及软骨藻酸酶标记物，游离的失忆性贝类毒素与软骨藻酸酶标记物竞争软骨藻酸抗体，同时软骨藻酸抗体与捕提抗体连接。没有结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质和显色剂加人到微孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加人反应终止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm测量微孔溶液的吸光度值，试样中失忆性贝类毒素的含量与吸光度值成反比，按绘制的标准曲线定量计算。3试剂和材料wwW.bzxz.Net
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水3.1试剂
3.1.1 甲醇(CHOH)
3.1.2十二水合磷酸氢二钠（NazHPO·12H2O)。3.1.3氯化钠(NaCI)。
3.1.4氯化钾（KCI)。
3.1.5磷酸二氢钾（KH,PO,）。
3.1.6吐温-20（CsHnO26）。
3.1.7抗DA抗体。
3.1.8牛血清白蛋白(BSA)。
3.1.9DA酶标记物。
过氧化氢（H,O2）。
3.3,5.5-四甲基联苯胺（TMB.CH2.N，）。3.1.12
硫酸(H,SO,)。
3.2试剂配制
GB5009.198—2016
3.2.1PBS溶液（pH7.4)：分别称取磷酸二氢钾0.20g、十二水合磷酸氢二钠2.90g、氯化钠8.00g、氯化钾0.20g，加水溶解并定容至1000mL。3.2.2抗体稀释液：称取1.0gBSA，加PBS溶液（pH7.4)溶解并定容至1000mL。3.2.3抗DA抗体工作液：抗DA抗体用抗体稀释液稀释至工作浓度3.2.4DA酶标记物工作液：用抗体稀释液将DA酶标记物稀释至工作浓度。3.2.5洗脱液：吸取0.5mL吐温-20.用PBS溶液（pH7.4）稀释至1000mL。3.2.6硫酸溶液（6mol/L）：吸取319.2mL硫酸，缓缓加至600mL水中，并用水稀释至1000mL。3.3标准品
软骨藻酸（DA，Ci;H2NO，CAS号14277-97-5)标准溶液。3.4标准溶液配制
DA标准系列工作液：准确吸取适量DA标准溶液用PBS溶液稀释并定容，配制成质量浓度分别为0ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL和10.0ng/mL的DA标准系列工作液。现用现配。
3.5材料
3.5.1包被有DA捕捉抗体的微孔板。注：商业化试剂盒若评价技术参数达到本标准的要求则也适合于本标准，参见附录A，3.5.2水相微孔滤膜：0.45um。
4仪器和设备
酶标仪
天平：感量为0.01g。
4.3均质器。
离心机：转速≥6000r/min。
分析步骤
样品采集
至少采集10个贝类样品，并使贝肉达200g以上。冷冻样品置于保温盒中冷冻送检，或保证其处于低温状态（0℃～10℃）送检。如为带壳样品，应开壳去除水分后冷冻送检。5.2试样制备
5.2.1生鲜带壳样品
用清水将贝类样品外表彻底洗净，切断闭壳肌，开壳，用水淋洗内部去除泥沙及其他外来物。将闭壳肌和连接在胶合部的组织分开，取出贝肉，切勿割破肉体。开壳前不要加热或用麻醉剂。收集100g贝肉置于孔径约2mm的金属筛网上，沥水5min，检出碎壳等杂物，将贝肉均质，备用。2
5.2.2冷冻样品
GB5009.198—2016
在室温下，使冷冻样品呈半冷冻状态。带壳冷冻样品，按5.2.1方法清洗、开壳、淋洗取肉，除去贝肉外部附着的冰片，抹去水分，室温缓化。将100g解冻的贝肉均质，备用。5.2.3贝类罐头
将贝类罐头内容物沥干水分，充分均质，备用。5.2.4贝肉干制品
称取100g贝肉干制品放人一定量水中浸泡24h～48h（4℃冷藏），沥干、均质、备用。5.2.5盐渍制品
用清水洗涤，流水脱盐，沥干，均质，备用。5.3试样提取
称取10g（精确至0.01g）试样，加人10mL水，涡旋振荡1min，加人20mL甲醇，涡旋振荡1min6000r/min离心10min，移取上清液，用0.45um的水相微孔滤膜过滤，得到试样提取液，用PBS溶液（pH7.4）稀释100倍，得到试样稀释液。吸取50uL试样稀释液进行测定。5.4测定
将已包被捕捉抗体的微孔条插入微孔架并做好标记，其中包括空白对照孔、标准液孔和样液孔，分别做平行孔。向空白对照孔加人150uLPBS溶液（pH7.4），向标准液孔加入50μL失忆性贝类毒素标准系列工作液，向样液孔加人50αL样液。向上述所有微孔中加人100μLDA酶标记物工作液，轻轻混合，再加人100μLDA抗体工作液，迅速充分混合1min，用粘胶纸封住微孔以防溶液挥发，4℃孵育2h。孵育结束后，倒去孔中液体，每个微孔注入300μL洗脱液冲洗，翻转微孔板，倾去孔内液体，再重复以上洗板操作2次，在吸水纸上拍干。每孔加150uL过氧化氢和TMB充分混合，室温避光孵育30min。每孔加人50uL硫酸溶液（6mol/L）迅速混勾，终止反应，在30min内测量并记录450nm波长下的吸光度值。若试样稀释液经测定超出标准曲线的线性范围，可扩大稀释倍数后重新进行测定5.5标准曲线的制作
以失忆性贝类毒素标准系列工作液的质量浓度的以10为底的对数值为横坐标，以按式（1)计算的标准液的百分比吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线失忆性贝类毒素标准液（或样液）的百分比吸光度值按式（1)计算：S-S
式中：
A——百分比吸光度值：
失忆性贝类毒素标准工作液或样液的平均吸光度值；S
空白对照孔的平均吸光度值；
-0ug/L的失忆性贝类毒素标准工作液的平均吸光度值。6分析结果的表述
试样中失忆贝类毒素的含量按式(2)计算：...1)
式中：
x=exvxf
试样中失忆性贝类毒素的含量，单位为微克每克（μug/g）；GB 5009.198—2016
由标准曲线得到的试样待测液中失忆性贝类毒素的质量浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL);
试样提取液的体积，单位为毫升（mL）；稀释倍数；
试样的称样量，单位为克（g）。当测定值<20μg/g时，则报告失忆性贝类毒素含量<20uμg/g。当测定值≥20pg/g时，则报告实际测定结果。注：任何失忆性贝类毒素含量大于20μg/g的样品即被认为是有害的，人类食用不安全。7其他
本方法的定量限为1ug/g。
液相色谱法
8原理
试样经甲醇溶液（50%提取，强阴离子固相萃取柱净化，液相色谱分离，二极管阵列或紫外检测器检测，外标法定量。
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为色谱纯，水为GB/T6682规定的一级水9.1试剂
乙腈(CH,CN)。
甲醇（CH.OH)。
甲酸(HCOOH)。
冰乙酸（CHCOOH）。
试剂配制
乙溶液（10%）：量取10mL乙腈，用水稀释至100mL。甲醇溶液（50%）：量取50mL甲醇，用水稀释至100mL。甲酸溶液（0.1mol/L）：吸取3.81mL甲酸，用水稀释至1000mL。乙酸溶液（0.1%）：吸取1mL冰乙酸，用水稀释至1000mL。9.3标准品
软骨藻酸标准品（DA，C1sH21NOCAS号14277-97-5）：纯度≥90%。4
9.4标准溶液配制
GB5009.198—2016
9.4.1软骨藻酸标准储备液（150μg/mL）：准确称取8.3mg（精确至0.01mg）软骨藻酸标准品，用乙睛溶液（10%）溶解并定容至50mL。该软骨藻酸标准储备液浓度已经采用标准品的纯度进行换算，置于4℃避光保存，有效期6个月
9.4.2软骨藻酸标准系列工作液：分别吸取适量软骨藻酸储备液（150ug/mL），用乙睛溶液（10%）分别稀释成浓度为0.3ug/mL、0.6μg/mL、3ug/mL、15μg/mL、30μg/mL的标准系列工作液。标准系列工作液于4℃避光保存，有效期3个月。9.5材料
9.5.1强阴离子固相萃取柱：500mg/3mL,或性能相当者。使用前分别用6mL甲醇、3mL水和3mL甲醇溶液（50%）活化。
9.5.2微孔滤膜：0.22μm，水相。10
仪器和设备
液相色谱仪：配有二极管阵列或紫外检测器10.1
10.2分析天平：感量为0.01mg和0.01g10.3均质器：转速≥10000r/min10.4涡旋振荡器
离心机：转速≥8000r/min。
固相萃取装置。
真空泵。
分析步骤
11.1样品采集
同5.1。
11.2试样制备
同5.2.15.2.4。
11.3试样提取
称取5g（精确到0.01g）试样于50mL具塞离心管中，加人10mL甲醇溶液（50%），涡旋混勾1min，超声提取5min，以8000r/min离心15min，移出上清液至25mL容量瓶中，残渣再加人10mL甲醇溶液（50%）重复提取一次，合并上清液，以甲醇溶液（50%）定容至25mL。11.4试样净化
准确吸取5mL提取液移入已活化过的强阴离子固相萃取柱上，待液体以1mL/min的流速流出后再依次用5mL乙溶液（10%）0.5mL甲酸溶液（0.1mol/L）淋洗，保持抽气2min.弃去流出液最后用3mL甲酸溶液（0.1mol/L）洗脱，保持抽气2min，收集洗脱液（3mL洗脱液相当于1g试样），过0.22um水相微孔滤膜后，供液相色谱测定。5
11.5空白试验
除不加试样外，采用与试样相同的操作步骤，得到空白溶液。11.6
仪器参考条件
色谱柱：Cis柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒径3um，或性能相当者；流动相：乙睛+乙酸溶液（0.1%）（13+87）；流速：1mL/min；
柱温：35℃；
进样量：10μL；
测定波长：242nm。
标准曲线的制作
GB5009.198—2016
将标准系列工作液分别注人液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准工作液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。软骨藻酸标准溶液的液相色谱图参见图B.1。11.8试样溶液的测定
将试样溶液注入液相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到试样溶液中软骨藻酸的质量浓度12
分析结果的表述
试样中软骨藻酸的含量按式（3)计算：(p-po)xv
式中：
—试样中软骨藻酸的含量，单位为微克每克（ug/g)；X
(———由标准曲线得到的试样溶液中软骨藻酸的质量浓度，单位为微克每毫升（μug/mL)；由标准曲线得到的空白溶液中软骨藻酸的质量浓度，单位为微克每毫升（ug/mL)；P
V—洗脱液的体积，单位为毫升（mL）；m
与洗脱液相当的试样质量，单位为克（g）。计算结果保留两位有效数字。
13精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。14其他
本方法的检出限为0.3μg/g，定量限为1.0ug/g。..（3)
15原理
液相色谱-串联质谱法
GB5009.198—2016
试样经甲醇溶液（50%）提取，强阴离子固相萃取柱净化.液相色谱-串联质谱检测，外标法定量。6试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为色谱纯，水为GB/T6682规定的一级水16.1试剂
甲醇(CH,OH)。
乙睛(CH,CN)。
甲酸（HCOOH)：分析纯。
甲酸铵（HCOONH）：分析纯。
16.2试剂配制
乙晴溶液（10%）：量取50mL乙睛，用水稀释至500mL。甲醇溶液（50%）：量取500mL甲醇，用水稀释至1000mL。甲酸铵缓冲溶液（2mmol/L）：称取0.126g甲酸铵，加人200μL甲酸，用水溶解并稀释至1000mL。
甲酸溶液（0.3%）：吸取300ulL甲酸，用水稀释至100mL。16.3标准品
软骨藻酸标准品（DAC15HzNO，CAS号14277-97-5）：纯度≥90%16.4标准溶液配制
16.4.1软骨藻酸标准储备液（100ug/mL）：准确称取5.6mg（精确至0.01mg）软骨藻酸标准品，用乙睛溶液（10%）溶解并定容至50mL。该软骨藻酸标准储备液浓度已经采用标准品的纯度进行换算，置于4℃避光保存，有效期6个月。16.4.2软骨藻酸标准中间液（2.0μg/mL）：准确移取1mL软骨藻酸标准储备液（100μg/mL）于50mL容量瓶中，以乙睛溶液（10%）定容至刻度。4℃避光保存，有效期3个月。16.4.3软骨藻酸基质标准系列工作液：准确吸取适量体积的软骨藻酸标准中间液（2.0ug/mL），用空白基质液稀释并定容，配制成质量浓度分别为2.5ng/mL、5ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL的基质标准系列工作液。16.5材料
16.5.1强阴离子固相萃取柱：500mg/3mL，或性能相当者。使用前依次用6mL甲醇、3mL水和3mL甲醇溶液（50%）活化。
16.5.2微孔滤膜：0.22um，水相。7
仪器和设备
液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。2分析天平：感量为0.01mg和0.01g。17.2
高速冷冻离心机：转速≥10000r/min。17.3
17.4超声波清洗器。
涡旋混匀器。
均质器。
固相萃取装置。
分析步骤
样品采集
同5.1。
18.2试样制备
同5.2.1~5.2.4。
18.3试样提取
GB5009.198—2016
称取5g（精确至0.01g）试样于50mL离心管中，加人12mL甲醇溶液（50%），涡旋混合1min，超声提取10min，再涡旋混合1min，以4000r/min离心10min，移出上清液。残渣再用5mL甲醇溶液（50%）重复提取两次，合并上清液，以甲醇溶液（50%）定容至25mL.混匀。于一18℃放置2h后，5℃下10000r/min离心15min，上清液待净化。18.4试样净化
准确吸取提取液5mL于预先活化好的强阴离子固相萃取柱中，控制流出液速度约为每秒1滴，然后分别用5mL乙睛溶液（10%）和0.3mL甲酸溶液（0.3%）淋洗，弃去流出液，用甲酸溶液（0.3%）4mL洗脱，收集洗脱液，用甲酸溶液（0.3%）稀释至4mL（相当于1g试样），混匀后经0.22um的水相微孔滤膜过滤，滤液供液相色谱-串联质谱测定。18.5空白试验
18.5.1试剂空白试验：除不加试样外，采用与试样相同的操作步骤，得到空白溶液。18.5.2
空白基质液：选取空白试样，采用与试样相同的操作步骤，得到空白基质液。18.6仪器参考条件
液相色谱参考条件
色谱柱：Cl柱，柱长100mm，内径2.1mm，粒径5μm，或性能相当者；b）
流动相：流动相A为甲醇，流动相B为甲酸铵缓冲溶液（2mmol/L)，梯度洗脱，梯度洗脱条件见表1；
流速：0.35mL/min；
d）柱温：30℃；
进样量：25μL。
时间/min
质谱参考条件
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描：
表1流动相梯度洗脱条件
监测方式：多反应监测模式。软骨藻酸母离子、子离子和碰撞能量见表2。喷雾电压：4500V；
离子传输毛细管温度：300℃；
锥孔电压：-8V；
雾化气流速：12.3L/min；
辅助气流速：1.7L/min；
碰撞气压力：0.2Pa。
表2软骨藻酸母离子、子离子和碰撞能量目标化合物
软骨藻酸
为定量离子
基质标准曲线的制作
母离子
子离子
GB5009.198—2016
碰撞能量
将基质标准系列工作液按浓度由低到高注入液相色谱-串联质谱仪测定，得到相应的峰面积。以基质标准系列工作液中软骨藻酸的质量浓度为横坐标，以相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。软骨藻酸标准溶液的多反应监测色谱图参见图C.1。18.8试样溶液的测定
将试样溶液注入液相色谱-串联质谱仪测定，得到试样溶液中软骨藻酸色谱峰的峰面积，由基质标准曲线得到试样溶液中软骨藻酸的质量浓度试样溶液中软骨藻酸的保留时间与标准溶液中软骨藻酸的保留时间之间的偏差在土2.5%以内。试样溶液中软骨藻酸的定性离子的相对丰度应当与质量浓度相近的基质标准工作液中软骨藻酸的定性离子的相对丰度一致，其丰度比偏差应符合表3要求，则可判定试样中存在被测化合物。9
定性离子相对丰度
允许的相对偏差
分析结果的表述
表3定性离子相对丰度的最大允许偏差>50%
试样中软骨藻酸的含量按式(4)计算：式中：
>20%~50%
mx1000
>10%~20%
试样中软骨藻酸的含量，单位为微克每克（ug/g）；GB 5009.198—2016
≤10%
....(4)
由标准工作曲线得到的试样溶液中软骨藻酸的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；洗脱液的定容体积，单位为毫升（mL)；与洗脱液相当的试样质量，单位为克(g)；换算因子。
计算结果保留三位有效数字。计算结果应扣除空白值，精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。21其他
本方法的检出限为0.005ug/g.定量限为0.02.ug/g。10
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