GB 5009.209-2016
基本信息
标准号： GB 5009.209-2016
中文名称：食品安全国家标准 食品中玉米赤霉烯酮的测定
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
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相关标签： 食品安全 国家标准 食品 玉米 赤霉 烯酮 测定
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GB 5009.209-2016 食品安全国家标准 食品中玉米赤霉烯酮的测定
GB5009.209-2016
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标准内容
中华人民共和国国家标准
GB5009.209—2016
食品安全国家标准
食品中玉米赤霉烯酮的测定
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局
GB5009.209—2016
本标准代替GB/T5009.209—2008《谷物中玉米赤霉烯酮的测定》、GB/T23504—2009《食品中玉米赤霉烯酮的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》、GB/T21982-2008《动物源食品中玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮残留量检测方法液
相色谱-质谱/质谱法》、SN/T1745一2006《进出口大豆、油菜籽和食用植物油中玉米赤霉烯酮的检验方法》、SN/T1772—2006《进出口粮谷中玉米赤霉烯酮的测定免疫亲和柱-液相色谱法》。
本标准与GB/T5009.209—2008相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准食品中玉米赤霉烯酮的测定”；增加了适用范围；
—增加了荧光光度法作为第二法；一增加了固相萃取柱净化液相色谱-质谱法作为第三法。I
1范围
食品安全国家标准
食品中玉米赤霉烯酮的测定
本标准规定了食品中玉米赤霉烯酮的测定方法GB5009.209—2016
本标准第一法适用于粮食和粮食制品，酒类，酱油、醋、酱及酱制品，大豆、油菜籽、食用植物油中玉米赤霉烯酮的测定，第二法适用于大豆、油菜籽、食用植物油中玉米赤霉烯酮的测定，第三法适用于牛肉、猪肉、牛肝、牛奶、鸡蛋中玉米赤霉烯酮的测定。液相色谱法
第一法
2原理
用乙睛溶液提取试样中的玉米赤霉烯酮，经免疫亲和柱净化后，用高效液相色谱荧光检测器测定，外标法定量
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂
3.1.1甲醇(CH,OH)：色谱纯。
3.1.2乙腈（CH.CN)：色谱纯。
3.1.3氯化钠(NaCI)。
3.1.4氯化钾（KCI)。
3.1.5磷酸氢二钠（NazHPO,）。3.1.6磷酸二氢钾（KH,PO,）。
3.1.7吐温-20（CsH11O2）。
盐酸（HCI)。
试剂配制
3.2.1提取液：乙睛-水（9+1)。3.2.2PBS清洗缓冲液称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾用990mL水将上述试剂溶解，用盐酸调节pH至7.0用水定容至1L。3.2.3PBS/吐温-20缓冲液：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾，用900mL水将上述试剂溶解，用盐酸调节pH至7.0.加人1mL吐温-20.用水定容至1L。3.3标准品
玉米赤霉烯酮（C1H22O：CAS号：17924-92-4)，纯度≥98.0%。或经国家认证并授予标准物质证1
书的标准物质。
3.4标准溶液配制
GB5009.209—2016
3.4.1标准储备液：准确称取适量的标准品（精确至0.0001g），用乙睛溶解，配制成浓度为100μg/mL的标准储备液，一18℃以下避光保存3.4.2系列标准工作液：根据需要准确吸取适量标准储备液，用流动相稀释，配制成10ng/mL、50ngmL、100ng/mL、200ng/mL500ng/mL的系列标准工作液，4℃避光保存。3.5材料
3.5.1玉米赤霉烯酮免疫亲和柱：柱规格1mL或3mL.柱容量≥1500ng，或等效柱。3.5.2玻璃纤维滤纸：直径11cm，孔径1.5um，无荧光特性。4仪器和设备
高效液相色谱仪：配有荧光检测器。4.1
高速粉碎机：转速≥12000r/min。均质器：转速≥12000r/min。
高速均质器：转速18000r/min~22000r/min。4.5
氮吹仪。
空气压力泵。
玻璃注射器：10mL。
天平：感量0.0001g和0.01g。
5分析步骤
5.1.1粮食和粮食制品
称取40.0g粉碎试样（精确到0.1g）于均质杯中，加入4g氯化钠和100mL提取液，以均质器（4.3）高速搅拌提取2min，定量滤纸过滤。移取10.0mL滤液加人40mL水稀释混匀，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液备用。5.1.2酱油、醋、酱及酱制品
称取25.0g（精确到0.1g）混匀的试样，用乙定容至100.0mL，超声提取2min，定量滤纸过滤。移取10.0mL滤液并加入40mL水稀释混勾，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液备用5.1.3大豆、油菜籽、食用植物油准确称取试样40.0g（准确到0.1g）（大豆需要磨细且粒度≤2mm）于均质杯中，加入4.0g氯化钠和100mL提取液，以高速均质器（4.4）高速搅拌提取1min，定量滤纸过滤。移取10.0mL滤液并加人40mL水稀释，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液备用。5.1.4酒类
取脱气酒类试样（含二氧化碳的酒类使用前先置于4℃冰箱冷藏30min，过滤或超声脱气）或其他2
GB5009.209—2016
不含二氧化碳的酒类试样20.0g（精确到0.1g）于50mL容量瓶中，用乙睛定容至刻度，摇匀。移取10.0mL滤液并加入40mL水稀释混勾匀，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液备用5.2净化
5.2.1粮食和粮食制品
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取10.0mL（相当于0.8g样品）5.1.1中的滤液，注人玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以1滴/s～2滴/s的流速缓慢通过免疫亲和柱，直至有部分空气进人亲和柱中。用5mL水淋洗柱子1次，流速为1滴/s～2滴/s，直至有部分空气进入亲和柱中，弃去全部流出液。准确加人1.5mL甲醇洗脱，流速约为1滴/s。收集洗脱液于玻璃试管中，于55℃以下氮气吹干后，用1.0mL流动相溶解残渣，供液相色谱测定。5.2.2酱油、醋、酱及酱制品，酒类将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取10.0mL5.1.2或5.1.4中的滤液，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力使溶液以1滴/s～2滴/s的流速缓慢通过免疫亲和柱，直至有部分空气进入亲和柱中。依次用10mLPBS清洗缓冲液和10mL水淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s～2滴/s.直至空气进人亲和柱中，弃去全部流出液。准确加人1.0mL甲醇洗脱，流速约为1滴/s。收集洗脱液于玻璃试管中，于55℃以下氮气吹干后，用1.0mL流动相溶解残渣，供液相色谱测定。
5.2.3大豆、油菜籽、食用植物油将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下.准确移取10.0mL5.1.3中的滤液，注人玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力使溶液以1滴/s～2滴/s的流速缓慢通过免疫亲和柱，直至有部分空气进人亲和柱中。依次用10mLPBS/吐温-20缓冲液和10mL水淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s～2滴/s，直至空气进人亲和柱中，弃去全部流出液。准确加人1.5mL甲醇洗脱，流速约为1滴/s。收集洗脱液于干净的玻璃试管中，于55℃以下氮气吹干后，用1.0mL流动相溶解残渣，供液相色谱测定。
5.3空白试验
不称取试样，按5.1和5.2的步骤做空白试验。应确认不含有干扰待测组分的物质。5.4测定
5.4.1高效液相色谱参考条件
高效液相色谱参考条件如下：
色谱柱：Cls柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒度4μm，或等效柱；a）
流动相：乙腈-水-甲醇（46：46：8，体积比）；b）
流速：1.0mL/min；
d）检测波长：激发波长274nm，发射波长440nm；进样量：100uL；
柱温：室温。
5.4.2标准曲线的制作
将系列玉米赤霉烯酮标准工作液按浓度从低到高依次注入高效液相色谱仪，得到相应的峰面积。3
以目标物质的浓度为横坐标，目标物质的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。5.4.3试样溶液的测定
GB 5009.209—2016
将待测试样溶液注入高效液相色谱仪，得到玉米赤霍烯酮的峰面积。由标准曲线得到试样溶液中玉米赤霉烯酮的浓度。
6分析结果的表述
试样中玉米赤霉烯酮的含量按式(1)计算：X=P×VX1000
mX1000
式中：
试样中玉米赤霉烯酮的含量，单位为微克每千克（ug/kg）)；试样测定液中玉米赤霉烯酮的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；试样测定液的最终定容体积，单位为毫升（mL)；单位换算常数；
试样的称样量，单位为克（g)；稀释倍数
计算结果需扣除空白值，保留两位有效数字。7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。8其他
..（1)
本方法对粮食和粮食制品中玉米赤霉烯酮的检出限为5ug/kg，定量限为17uμg/kg。酒类中玉米赤霉烯酮的检出限为20μg/kg·定量限为66μg/kg。酱油、醋、酱及酱制品中玉米赤霉烯酮的检出限为50ug/kg，定量限为165μg/kg。大豆、油菜籽、食用植物油中玉米赤霉烯酮的检出限为10ug/kg，定量限33uμg/kg。
第二法
荧光光度法
9原理
用乙睛溶液提取试样中的玉米赤霉烯酮，经免疫亲和柱净化后，加入氯化铝溶液进行衍生。洗脱液通过荧光光度计测定。
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一水10.1试剂
乙睛（CH.CN）：色谱纯。
甲醇（CH,OH)：色谱纯。
氯化钠(NaCI)。
磷酸氢二钠（Na2HPO4）。
磷酸二氢钾（KH,PO,）。
氯化钾(KCI)。
吐温-20（CssH114O2）。
盐酸(HCI)。
硫酸(H,SO,)。
氯化铝(AICl，·10H2O)。
硫酸奎宁（C2Ha.NzO,·H,SO·2H,O)。试剂配制
提取液：乙晴-水（9十1）。
GB5009.209—2016
PBS/吐温-20缓冲液：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾溶于900mL水中，用盐酸调节pH至7.0加入1mL吐温-20.用水稀释至1L。10.2.3
氯化铝衍生溶液：称取2.5g氯化铝溶解于50mL甲醇中。10.2.4硫酸溶液（0.05mol/L）：取2.8mL硫酸，缓慢加入适量水中，冷却后定容至1000mL。10.2.5
荧光光度计校准溶液：称取3.40g硫酸奎宁，用0.05mol/L硫酸溶液稀释至100mL，此溶液的荧光光度计读数相当于0.45。
10.3标准品
玉米赤霉烯酮（C1sHO，，CAS号：17924-92-4），纯度≥98.0%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.4材料
10.4.1玉米赤霉烯酮免疫亲和柱：柱规格1mL或3mL,柱容量≥1500ng，或等效柱10.4.2
玻璃纤维滤纸：直径11cm，孔径1.5um，无荧光特性。仪器和设备
荧光光度计
高速均质器：18000r/min22000r/min。空气压力泵
11.4玻璃注射器：10mL。
天平：感量0.0001g和0.01g。
分析步骤
12.1提取
准确称取试样40.0g（精确至0.1g）（大豆需要磨细且粒度≤2mm）于均质杯中，加入4.0g氯化钠和100mL提取液（10.2.1）.以高速均质器高速搅拌提取1min，定量滤纸过滤。移取10.0mL滤液并加人40mLPBS/吐温-20缓冲液稀释混匀，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液备用。5
12.2净化
GB5009.209—2016
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取10.0mL滤液，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力使溶液以1滴/s2滴/s的流速缓慢通过免疫亲和柱，直至有部分空气进人亲和柱中。依次用10mLPBS/吐温-20缓冲液和10mL水淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s～2滴/s，直至空气进人亲和柱中，弃去全部流出液。准确加人1.0mL甲醇洗脱，流速约为1滴/s。收集洗脱液于玻璃试管中，于55℃以下氮气吹干后，用1.0mL流动相溶解残渣供测定。12.3空白试验
不称取试样，按12.1和12.2的步骤做空白试验。应确认不含有干扰待测组分的物质。12.4测定
12.4.1测定条件
激发波长360nm，发射波长450nm。12.4.2
荧光光度计校准
以0.05mol/L硫酸溶液为空白调零，以荧光光度计校准溶液进行校准。12.4.3
样液测定
在12.2得到的样液中加入1.0mL氯化铝衍生溶液，立即置于荧光光度计中读取玉米赤霉烯酮的浓度。
13分析结果的表述
试样中玉米赤霉烯酮的含量按式(2)算：X=pxVx1000
mX1000
式中：
试样中玉米赤霉烯酮的含量，单位为微克每千克（ug/kg)；试样测定液中玉米赤霉烯酮的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；试样测定液的最终定容体积，单位为毫升（mL）；单位换算常数；
试样的称样量，单位为克（g）；稀释倍数。
计算结果需扣除空白值，保留两位有效数字。14精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。5其他
方法检出限为10μg/kg，定量限为33ug/kg。（2)
6原理
第三法液相色谱-质谱法
GB5009.209—2016
样品经β-葡萄糖苷酸/硫酸酯复合酶水解后，采用乙醚提取，经液液分配、固相萃取柱净化后，用液相色谱-质谱测定，外标法定量。7试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。17.1试剂
甲醇(CH,OH)：色谱纯。
乙腈（CH,CN)：色谱纯。
无水乙醚（CH.O）。
三氯甲烷（CHCl）。
氢氧化钠(NaOH)。
三水合乙酸钠（CH,COONa·3H.O)。磷酸（H,PO）：纯度大于85%。
冰乙酸（CH，COOH）：色谱纯
β-葡萄糖苷酸。
硫酸酯酶。
试剂配制
氢氧化钠溶液（0.5mol/L）：称取20g氢氧化钠用水溶解并定容至1L。乙酸钠缓冲溶液（0.05mol/L）：称取6.8g三水合乙酸钠用900mL水溶解，冰乙酸调pH至4.8.定容至1L。
3磷酸-水溶液：（1+4）。
甲醇-水溶液：（1+1)。
5β-葡萄糖苷酸/硫酸酯复合酶：96000U/mLβ-葡萄糖苷酸.390U/mL硫酸酯酶。17.2.5
17.3标准品
玉米赤霉烯酮（C18H22O，，CAS号：17924-92-4)，纯度≥98.0%。或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
17.4标准溶液配制
17.4.1标准储备液：准确称取适量标准品（精确至0.0001g），用乙睛溶解，配制成浓度为100μg/mL的标准储备液，一18℃以下避光保存。2标准工作液：根据需要准确吸取适量标准储备液，用乙睛稀释，配制成适当浓度的标准工作液，17.4.2
4℃避光保存。
17.5材料
GB5009.209—2016
17.5.1固相萃取柱：N-乙烯吡咯烷酮和二乙烯基苯共聚物填料，HLB.6mL，500mg，或等效柱。17.5.2
微孔滤膜：0.20um，有机相型。氮气：纯度≥99.999%。
氩气：纯度≥99.999%。
仪器和设备
液相色谱-质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI)。组织捣碎机。
天平：感量为0.0001g和0.01g
均质器：≥12000r/min。
振荡器。
恒温振荡器。
离心机：≥6000r/min。
pH计：测量精度土0.02pH单位。氮吹仪。
涡旋混合器
旋转蒸发仪。
超声清洗器。
分析步骤
试样制备
注：在制样的操作过程中，应防止样品污染或发生残留物含量的变化。19.1.1
肌肉和内脏
取500g样品，用组织捣碎机充分捣碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封。于一18℃以下避光保存。
取500g样品，充分混匀，均分成两份，分别装人洁净容器作为试样，密封。于0℃～4℃避光保存3鸡蛋
取500g样品，去壳后用组织捣碎机搅拌充分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封。于0℃~4℃避光保存。
19.2水解
称取5.0g试样（精确至0.1g）于50mL具塞离心管中，加人10mL0.05mol/L乙酸钠缓冲溶液和0.025mLβ-葡萄糖苷酸/硫酸酯复合酶，旋涡混匀，于37℃水浴中振荡12h。8
19.3提取
GB5009.209—2016
水解后加人15mL无水乙醚，振荡提取5min后，以4000r/min离心2min，将上清液转移至浓缩瓶中，再用15mL无水乙醚重复提取一次，合并上清液，40℃以下旋转浓缩至近干。加人1mL三氯甲烷溶解残渣，超声波助溶2min后，转入10mL离心管中，再用3mL0.5mol/L氢氧化钠溶液润洗浓缩瓶后转移至同一离心管中，涡旋混勾，以4000r/min离心2min，吸取上层氢氧化钠溶液。再用3ml0.5mol/L氢氧化钠重复润洗、萃取一次，合并氢氧化钠萃取液，加入1mL磷酸-水溶液，混匀后待净化。
19.4净化
使用前依次用5mL甲醇和5mL水预淋洗固相萃取柱。将19.3中样品提取液转人固相萃取柱。用5mL水、5mL甲醇-水溶液淋洗，弃去流出液；再用10mL甲醇进行洗脱，收集洗脱液。整个固相萃取净化过程控制流速不超过2mL/min。洗脱液在40℃以下用氮气吹于。残留物用1.0mL乙溶解，涡旋混匀后，过0.2m微孔滤膜.供仪器检测19.5基质标准溶液的制备
称取5份5.0g空白试样（精确至0.1g）于50mL具塞离心管中，分别加人相应体积的玉米赤霉烯酮标准工作溶液，配制成浓度为1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、50μg/kg和100μg/kg的基质标准溶液，然后按19.2、19.3、19.4操作。19.6测定
液相色谱参考条件
液相色谱条件列出如下：
色谱柱：C1g，柱长50mm，内径2.0mm，粒径2um，或等效柱；a
流速：0.2mL/min；
进样量：5μL；
柱温：40℃：
流动相及梯度洗脱条件见表1。
表1流动相及梯度洗脱条件
时间/min
质谱参考条件
质谱条件列出如下：
a）：电离方式：电喷雾电离（ESI-)；毛细管电压：3.0kV；
源温度：120℃；
乙腊/%
去溶剂温度：350℃；
锥孔气流：氮气，流速100L/h；去溶剂气流：氟气.流速600L/h：碰撞气：氩气，碰撞气压2.60×10-4Pa；扫描方式：负离子扫描；
检测方式：多反应监测（MRM），条件见表2。表2多反应监测条件
中文名称
玉米赤霉烯酮
英文名称
Zearalenone
用于定量测定。
19.6.3标准曲线的制作
母离子
子离子
(m/z）
驻留时间/
锥孔电压/
GB5009.209—2016
碰撞能量
保留时间
按浓度由小到大的顺序，依次分析基质标准溶液，得到相应的峰面积。以基质标准溶液的浓度为横坐标，以相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。19.6.4试样溶液的测定
将试样溶液注人液相色谱-质谱仪中，得到相应的峰面积，由标准曲线得到试样溶液中玉米赤霉烯酮的浓度。
19.6.5定性
如果样品的质量色谱峰保留时间与基质标准溶液一致，定性离子对的相对丰度与浓度相当的基质标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表3的规定，则可判断样品中存在相应的被测物。表3定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度
允许的相对偏差
20分析结果的表述
试样中玉米赤霉烯酮的含量按式（3)计算：X
式中：
20%~50%
mX1000bZxz.net
10%~20%
试样中玉米赤霉烯酮的含量，单位为微克每千克（ug/kg）；≤10%
.（3)
p—从基质标准曲线得到的试样测定液中玉米赤霉烯酮的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；V
试样测定液的最终定容体积，单位为毫升（mL）；一最终样液所代表的试样质量，单位为克（g）。10
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GB5009.209—2016
食品安全国家标准
食品中玉米赤霉烯酮的测定
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局
GB5009.209—2016
本标准代替GB/T5009.209—2008《谷物中玉米赤霉烯酮的测定》、GB/T23504—2009《食品中玉米赤霉烯酮的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》、GB/T21982-2008《动物源食品中玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮残留量检测方法液
相色谱-质谱/质谱法》、SN/T1745一2006《进出口大豆、油菜籽和食用植物油中玉米赤霉烯酮的检验方法》、SN/T1772—2006《进出口粮谷中玉米赤霉烯酮的测定免疫亲和柱-液相色谱法》。
本标准与GB/T5009.209—2008相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准食品中玉米赤霉烯酮的测定”；增加了适用范围；
—增加了荧光光度法作为第二法；一增加了固相萃取柱净化液相色谱-质谱法作为第三法。I
1范围
食品安全国家标准
食品中玉米赤霉烯酮的测定
本标准规定了食品中玉米赤霉烯酮的测定方法GB5009.209—2016
本标准第一法适用于粮食和粮食制品，酒类，酱油、醋、酱及酱制品，大豆、油菜籽、食用植物油中玉米赤霉烯酮的测定，第二法适用于大豆、油菜籽、食用植物油中玉米赤霉烯酮的测定，第三法适用于牛肉、猪肉、牛肝、牛奶、鸡蛋中玉米赤霉烯酮的测定。液相色谱法
第一法
2原理
用乙睛溶液提取试样中的玉米赤霉烯酮，经免疫亲和柱净化后，用高效液相色谱荧光检测器测定，外标法定量
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂
3.1.1甲醇(CH,OH)：色谱纯。
3.1.2乙腈（CH.CN)：色谱纯。
3.1.3氯化钠(NaCI)。
3.1.4氯化钾（KCI)。
3.1.5磷酸氢二钠（NazHPO,）。3.1.6磷酸二氢钾（KH,PO,）。
3.1.7吐温-20（CsH11O2）。
盐酸（HCI)。
试剂配制
3.2.1提取液：乙睛-水（9+1)。3.2.2PBS清洗缓冲液称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾用990mL水将上述试剂溶解，用盐酸调节pH至7.0用水定容至1L。3.2.3PBS/吐温-20缓冲液：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾，用900mL水将上述试剂溶解，用盐酸调节pH至7.0.加人1mL吐温-20.用水定容至1L。3.3标准品
玉米赤霉烯酮（C1H22O：CAS号：17924-92-4)，纯度≥98.0%。或经国家认证并授予标准物质证1
书的标准物质。
3.4标准溶液配制
GB5009.209—2016
3.4.1标准储备液：准确称取适量的标准品（精确至0.0001g），用乙睛溶解，配制成浓度为100μg/mL的标准储备液，一18℃以下避光保存3.4.2系列标准工作液：根据需要准确吸取适量标准储备液，用流动相稀释，配制成10ng/mL、50ngmL、100ng/mL、200ng/mL500ng/mL的系列标准工作液，4℃避光保存。3.5材料
3.5.1玉米赤霉烯酮免疫亲和柱：柱规格1mL或3mL.柱容量≥1500ng，或等效柱。3.5.2玻璃纤维滤纸：直径11cm，孔径1.5um，无荧光特性。4仪器和设备
高效液相色谱仪：配有荧光检测器。4.1
高速粉碎机：转速≥12000r/min。均质器：转速≥12000r/min。
高速均质器：转速18000r/min~22000r/min。4.5
氮吹仪。
空气压力泵。
玻璃注射器：10mL。
天平：感量0.0001g和0.01g。
5分析步骤
5.1.1粮食和粮食制品
称取40.0g粉碎试样（精确到0.1g）于均质杯中，加入4g氯化钠和100mL提取液，以均质器（4.3）高速搅拌提取2min，定量滤纸过滤。移取10.0mL滤液加人40mL水稀释混匀，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液备用。5.1.2酱油、醋、酱及酱制品
称取25.0g（精确到0.1g）混匀的试样，用乙定容至100.0mL，超声提取2min，定量滤纸过滤。移取10.0mL滤液并加入40mL水稀释混勾，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液备用5.1.3大豆、油菜籽、食用植物油准确称取试样40.0g（准确到0.1g）（大豆需要磨细且粒度≤2mm）于均质杯中，加入4.0g氯化钠和100mL提取液，以高速均质器（4.4）高速搅拌提取1min，定量滤纸过滤。移取10.0mL滤液并加人40mL水稀释，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液备用。5.1.4酒类
取脱气酒类试样（含二氧化碳的酒类使用前先置于4℃冰箱冷藏30min，过滤或超声脱气）或其他2
GB5009.209—2016
不含二氧化碳的酒类试样20.0g（精确到0.1g）于50mL容量瓶中，用乙睛定容至刻度，摇匀。移取10.0mL滤液并加入40mL水稀释混勾匀，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液备用5.2净化
5.2.1粮食和粮食制品
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取10.0mL（相当于0.8g样品）5.1.1中的滤液，注人玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以1滴/s～2滴/s的流速缓慢通过免疫亲和柱，直至有部分空气进人亲和柱中。用5mL水淋洗柱子1次，流速为1滴/s～2滴/s，直至有部分空气进入亲和柱中，弃去全部流出液。准确加人1.5mL甲醇洗脱，流速约为1滴/s。收集洗脱液于玻璃试管中，于55℃以下氮气吹干后，用1.0mL流动相溶解残渣，供液相色谱测定。5.2.2酱油、醋、酱及酱制品，酒类将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取10.0mL5.1.2或5.1.4中的滤液，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力使溶液以1滴/s～2滴/s的流速缓慢通过免疫亲和柱，直至有部分空气进入亲和柱中。依次用10mLPBS清洗缓冲液和10mL水淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s～2滴/s.直至空气进人亲和柱中，弃去全部流出液。准确加人1.0mL甲醇洗脱，流速约为1滴/s。收集洗脱液于玻璃试管中，于55℃以下氮气吹干后，用1.0mL流动相溶解残渣，供液相色谱测定。
5.2.3大豆、油菜籽、食用植物油将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下.准确移取10.0mL5.1.3中的滤液，注人玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力使溶液以1滴/s～2滴/s的流速缓慢通过免疫亲和柱，直至有部分空气进人亲和柱中。依次用10mLPBS/吐温-20缓冲液和10mL水淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s～2滴/s，直至空气进人亲和柱中，弃去全部流出液。准确加人1.5mL甲醇洗脱，流速约为1滴/s。收集洗脱液于干净的玻璃试管中，于55℃以下氮气吹干后，用1.0mL流动相溶解残渣，供液相色谱测定。
5.3空白试验
不称取试样，按5.1和5.2的步骤做空白试验。应确认不含有干扰待测组分的物质。5.4测定
5.4.1高效液相色谱参考条件
高效液相色谱参考条件如下：
色谱柱：Cls柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒度4μm，或等效柱；a）
流动相：乙腈-水-甲醇（46：46：8，体积比）；b）
流速：1.0mL/min；
d）检测波长：激发波长274nm，发射波长440nm；进样量：100uL；
柱温：室温。
5.4.2标准曲线的制作
将系列玉米赤霉烯酮标准工作液按浓度从低到高依次注入高效液相色谱仪，得到相应的峰面积。3
以目标物质的浓度为横坐标，目标物质的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。5.4.3试样溶液的测定
GB 5009.209—2016
将待测试样溶液注入高效液相色谱仪，得到玉米赤霍烯酮的峰面积。由标准曲线得到试样溶液中玉米赤霉烯酮的浓度。
6分析结果的表述
试样中玉米赤霉烯酮的含量按式(1)计算：X=P×VX1000
mX1000
式中：
试样中玉米赤霉烯酮的含量，单位为微克每千克（ug/kg）)；试样测定液中玉米赤霉烯酮的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；试样测定液的最终定容体积，单位为毫升（mL)；单位换算常数；
试样的称样量，单位为克（g)；稀释倍数
计算结果需扣除空白值，保留两位有效数字。7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。8其他
..（1)
本方法对粮食和粮食制品中玉米赤霉烯酮的检出限为5ug/kg，定量限为17uμg/kg。酒类中玉米赤霉烯酮的检出限为20μg/kg·定量限为66μg/kg。酱油、醋、酱及酱制品中玉米赤霉烯酮的检出限为50ug/kg，定量限为165μg/kg。大豆、油菜籽、食用植物油中玉米赤霉烯酮的检出限为10ug/kg，定量限33uμg/kg。
第二法
荧光光度法
9原理
用乙睛溶液提取试样中的玉米赤霉烯酮，经免疫亲和柱净化后，加入氯化铝溶液进行衍生。洗脱液通过荧光光度计测定。
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一水10.1试剂
乙睛（CH.CN）：色谱纯。
甲醇（CH,OH)：色谱纯。
氯化钠(NaCI)。
磷酸氢二钠（Na2HPO4）。
磷酸二氢钾（KH,PO,）。
氯化钾(KCI)。
吐温-20（CssH114O2）。
盐酸(HCI)。
硫酸(H,SO,)。
氯化铝(AICl，·10H2O)。
硫酸奎宁（C2Ha.NzO,·H,SO·2H,O)。试剂配制
提取液：乙晴-水（9十1）。
GB5009.209—2016
PBS/吐温-20缓冲液：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾溶于900mL水中，用盐酸调节pH至7.0加入1mL吐温-20.用水稀释至1L。10.2.3
氯化铝衍生溶液：称取2.5g氯化铝溶解于50mL甲醇中。10.2.4硫酸溶液（0.05mol/L）：取2.8mL硫酸，缓慢加入适量水中，冷却后定容至1000mL。10.2.5
荧光光度计校准溶液：称取3.40g硫酸奎宁，用0.05mol/L硫酸溶液稀释至100mL，此溶液的荧光光度计读数相当于0.45。
10.3标准品
玉米赤霉烯酮（C1sHO，，CAS号：17924-92-4），纯度≥98.0%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.4材料
10.4.1玉米赤霉烯酮免疫亲和柱：柱规格1mL或3mL,柱容量≥1500ng，或等效柱10.4.2
玻璃纤维滤纸：直径11cm，孔径1.5um，无荧光特性。仪器和设备
荧光光度计
高速均质器：18000r/min22000r/min。空气压力泵
11.4玻璃注射器：10mL。
天平：感量0.0001g和0.01g。
分析步骤
12.1提取
准确称取试样40.0g（精确至0.1g）（大豆需要磨细且粒度≤2mm）于均质杯中，加入4.0g氯化钠和100mL提取液（10.2.1）.以高速均质器高速搅拌提取1min，定量滤纸过滤。移取10.0mL滤液并加人40mLPBS/吐温-20缓冲液稀释混匀，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液备用。5
12.2净化
GB5009.209—2016
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取10.0mL滤液，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力使溶液以1滴/s2滴/s的流速缓慢通过免疫亲和柱，直至有部分空气进人亲和柱中。依次用10mLPBS/吐温-20缓冲液和10mL水淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s～2滴/s，直至空气进人亲和柱中，弃去全部流出液。准确加人1.0mL甲醇洗脱，流速约为1滴/s。收集洗脱液于玻璃试管中，于55℃以下氮气吹干后，用1.0mL流动相溶解残渣供测定。12.3空白试验
不称取试样，按12.1和12.2的步骤做空白试验。应确认不含有干扰待测组分的物质。12.4测定
12.4.1测定条件
激发波长360nm，发射波长450nm。12.4.2
荧光光度计校准
以0.05mol/L硫酸溶液为空白调零，以荧光光度计校准溶液进行校准。12.4.3
样液测定
在12.2得到的样液中加入1.0mL氯化铝衍生溶液，立即置于荧光光度计中读取玉米赤霉烯酮的浓度。
13分析结果的表述
试样中玉米赤霉烯酮的含量按式(2)算：X=pxVx1000
mX1000
式中：
试样中玉米赤霉烯酮的含量，单位为微克每千克（ug/kg)；试样测定液中玉米赤霉烯酮的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；试样测定液的最终定容体积，单位为毫升（mL）；单位换算常数；
试样的称样量，单位为克（g）；稀释倍数。
计算结果需扣除空白值，保留两位有效数字。14精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。5其他
方法检出限为10μg/kg，定量限为33ug/kg。（2)
6原理
第三法液相色谱-质谱法
GB5009.209—2016
样品经β-葡萄糖苷酸/硫酸酯复合酶水解后，采用乙醚提取，经液液分配、固相萃取柱净化后，用液相色谱-质谱测定，外标法定量。7试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。17.1试剂
甲醇(CH,OH)：色谱纯。
乙腈（CH,CN)：色谱纯。
无水乙醚（CH.O）。
三氯甲烷（CHCl）。
氢氧化钠(NaOH)。
三水合乙酸钠（CH,COONa·3H.O)。磷酸（H,PO）：纯度大于85%。
冰乙酸（CH，COOH）：色谱纯
β-葡萄糖苷酸。
硫酸酯酶。
试剂配制
氢氧化钠溶液（0.5mol/L）：称取20g氢氧化钠用水溶解并定容至1L。乙酸钠缓冲溶液（0.05mol/L）：称取6.8g三水合乙酸钠用900mL水溶解，冰乙酸调pH至4.8.定容至1L。
3磷酸-水溶液：（1+4）。
甲醇-水溶液：（1+1)。
5β-葡萄糖苷酸/硫酸酯复合酶：96000U/mLβ-葡萄糖苷酸.390U/mL硫酸酯酶。17.2.5
17.3标准品
玉米赤霉烯酮（C18H22O，，CAS号：17924-92-4)，纯度≥98.0%。或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
17.4标准溶液配制
17.4.1标准储备液：准确称取适量标准品（精确至0.0001g），用乙睛溶解，配制成浓度为100μg/mL的标准储备液，一18℃以下避光保存。2标准工作液：根据需要准确吸取适量标准储备液，用乙睛稀释，配制成适当浓度的标准工作液，17.4.2
4℃避光保存。
17.5材料
GB5009.209—2016
17.5.1固相萃取柱：N-乙烯吡咯烷酮和二乙烯基苯共聚物填料，HLB.6mL，500mg，或等效柱。17.5.2
微孔滤膜：0.20um，有机相型。氮气：纯度≥99.999%。
氩气：纯度≥99.999%。
仪器和设备
液相色谱-质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI)。组织捣碎机。
天平：感量为0.0001g和0.01g
均质器：≥12000r/min。
振荡器。
恒温振荡器。
离心机：≥6000r/min。
pH计：测量精度土0.02pH单位。氮吹仪。
涡旋混合器
旋转蒸发仪。
超声清洗器。
分析步骤
试样制备
注：在制样的操作过程中，应防止样品污染或发生残留物含量的变化。19.1.1
肌肉和内脏
取500g样品，用组织捣碎机充分捣碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封。于一18℃以下避光保存。
取500g样品，充分混匀，均分成两份，分别装人洁净容器作为试样，密封。于0℃～4℃避光保存3鸡蛋
取500g样品，去壳后用组织捣碎机搅拌充分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封。于0℃~4℃避光保存。
19.2水解
称取5.0g试样（精确至0.1g）于50mL具塞离心管中，加人10mL0.05mol/L乙酸钠缓冲溶液和0.025mLβ-葡萄糖苷酸/硫酸酯复合酶，旋涡混匀，于37℃水浴中振荡12h。8
19.3提取
GB5009.209—2016
水解后加人15mL无水乙醚，振荡提取5min后，以4000r/min离心2min，将上清液转移至浓缩瓶中，再用15mL无水乙醚重复提取一次，合并上清液，40℃以下旋转浓缩至近干。加人1mL三氯甲烷溶解残渣，超声波助溶2min后，转入10mL离心管中，再用3mL0.5mol/L氢氧化钠溶液润洗浓缩瓶后转移至同一离心管中，涡旋混勾，以4000r/min离心2min，吸取上层氢氧化钠溶液。再用3ml0.5mol/L氢氧化钠重复润洗、萃取一次，合并氢氧化钠萃取液，加入1mL磷酸-水溶液，混匀后待净化。
19.4净化
使用前依次用5mL甲醇和5mL水预淋洗固相萃取柱。将19.3中样品提取液转人固相萃取柱。用5mL水、5mL甲醇-水溶液淋洗，弃去流出液；再用10mL甲醇进行洗脱，收集洗脱液。整个固相萃取净化过程控制流速不超过2mL/min。洗脱液在40℃以下用氮气吹于。残留物用1.0mL乙溶解，涡旋混匀后，过0.2m微孔滤膜.供仪器检测19.5基质标准溶液的制备
称取5份5.0g空白试样（精确至0.1g）于50mL具塞离心管中，分别加人相应体积的玉米赤霉烯酮标准工作溶液，配制成浓度为1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、50μg/kg和100μg/kg的基质标准溶液，然后按19.2、19.3、19.4操作。19.6测定
液相色谱参考条件
液相色谱条件列出如下：
色谱柱：C1g，柱长50mm，内径2.0mm，粒径2um，或等效柱；a
流速：0.2mL/min；
进样量：5μL；
柱温：40℃：
流动相及梯度洗脱条件见表1。
表1流动相及梯度洗脱条件
时间/min
质谱参考条件
质谱条件列出如下：
a）：电离方式：电喷雾电离（ESI-)；毛细管电压：3.0kV；
源温度：120℃；
乙腊/%
去溶剂温度：350℃；
锥孔气流：氮气，流速100L/h；去溶剂气流：氟气.流速600L/h：碰撞气：氩气，碰撞气压2.60×10-4Pa；扫描方式：负离子扫描；
检测方式：多反应监测（MRM），条件见表2。表2多反应监测条件
中文名称
玉米赤霉烯酮
英文名称
Zearalenone
用于定量测定。
19.6.3标准曲线的制作
母离子
子离子
(m/z）
驻留时间/
锥孔电压/
GB5009.209—2016
碰撞能量
保留时间
按浓度由小到大的顺序，依次分析基质标准溶液，得到相应的峰面积。以基质标准溶液的浓度为横坐标，以相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。19.6.4试样溶液的测定
将试样溶液注人液相色谱-质谱仪中，得到相应的峰面积，由标准曲线得到试样溶液中玉米赤霉烯酮的浓度。
19.6.5定性
如果样品的质量色谱峰保留时间与基质标准溶液一致，定性离子对的相对丰度与浓度相当的基质标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表3的规定，则可判断样品中存在相应的被测物。表3定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度
允许的相对偏差
20分析结果的表述
试样中玉米赤霉烯酮的含量按式（3)计算：X
式中：
20%~50%
mX1000bZxz.net
10%~20%
试样中玉米赤霉烯酮的含量，单位为微克每千克（ug/kg）；≤10%
.（3)
p—从基质标准曲线得到的试样测定液中玉米赤霉烯酮的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；V
试样测定液的最终定容体积，单位为毫升（mL）；一最终样液所代表的试样质量，单位为克（g）。10
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