GB 5009.224-2016 食品安全国家标准 大豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性的测定 GB5009.224-2016 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国国家标准
GB5009.224—2016
食品安全国家标准
大豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性的测定2016-08-31发布
中华人民共和国
国家卫生和计划生育委员会
2017-03-01实施
本标准代替GB/T21498—2008《大豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性的测定》。本标准与GB/T21498—2008相比，主要变化如下：GB5009.224—2016
标准名称修改为“食品安全国家标准大豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性的测定”；删除了原标准范围中“胰蛋白酶抑制剂活性可以用来表示豆制品的烘烤程度”；修改了“原理”；
修改了“试剂和材料”；
删除了“采样”；
修改了“试样制备”；
删除了“测定次数”；
修改了“结果计算”；
—修改了“精密度”；
删除了“检验报告”；
删除了附录B。
1范围
食品安全国家标准
大豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性的测定本标准规定了大豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性（TIA)的测定方法。本标准适用于大豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性的测定2原理
GB5009.224—2016
胰蛋白酶可与苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（L-BAPA）发生反应，生成对硝基苯胺，该物质在410nm下有特征吸收。大豆制品中的胰蛋白酶抑制剂可抑制此反应，使吸光度值下降，其下降程度与胰蛋白酶抑制活性成正比。采用分光光度计在410nm处测定该反应前后的吸光度值，可定量分析胰蛋白酶抑制剂活性。
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。3.1试剂
3.1.1盐酸(HCI)。
3.1.2冰乙酸（CH,COOH)。
3.1.3氢氧化钠(NaOH）。
3.1.4氯化钙（CaCl2·2H2O)。
3.1.5胰蛋白酶（Trypsin）：一20℃冻藏。3.1.6苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺(L-BAPA)。3.1.7
三羟甲基氨基甲烷[NH,C(CH,OH)，Tris]。3.1.8
二甲亚矾（C,H。OS.DMOS)。
试剂配制
盐酸溶液（6mol/L）：取50mL盐酸（3.1.1)加人水中，用水稀释至100mL，混匀。3.2.2盐酸溶液（1mol/L）：取83mL盐酸（3.1.1)加人水中，用水稀释至1000mL.混匀。3.2.3盐酸溶液（0.1mol/L）：取8.3mL盐酸（3.1.1)加人水中，用水稀释至1000mL，混匀。3.2.4盐酸溶液（0.001mol/L）：取1mL1mol/L盐酸溶液加入水中，用水稀释至1000mL，混匀。3.2.5乙酸溶液（5.3mol/L）：取30mL冰乙酸（3.1.2）加入水中，用水稀释至100mL，混匀3.2.6氢氧化钠溶液（0.01mol/L）：称取0.40g氢氧化钠（3.1.3），溶于500mL水中，用水稀释至1000mLa
3.2.7氯化钙盐酸溶液：称取0.735g氯化钙（3.1.4)溶解于1L0.001mol/L盐酸溶液中，用1mol/L盐酸溶液和0.1mol/L盐酸溶液调节pH至3.0土0.1。1
GB5009.224—2016
3.2.8胰蛋白酶储备液（0.270mg/mL）：将胰蛋白酶（3.1.5）放置至室温，称取胰蛋白酶27.0mg于小烧杯中，用氯化钙盐酸溶液（3.2.7)溶解，转移至100mL.容量瓶中，以氯化钙盐酸溶液（3.2.7)定容至刻度。保存于0℃～4℃冰箱中，最多可使用5d。3.2.9胰蛋白酶使用液（0.0135mg/mL）：用移液管量取5.0mL胰蛋白酶储备液（3.2.8）于100mL容量瓶中，用氯化钙盐酸溶液（3.2.7）定容至刻度。3.2.10三羟甲基氨基甲烷-氯化钙缓冲液：称取6.05g三羟甲基氨基甲烷（3.1.7)和0.735g氯化钙（3.1.4)溶于预先加人900mL水的带有刻度的1000mL烧杯中，用1mol/L盐酸溶液和0.1mol/L盐酸溶液调节pH值至8.2士0.1.加水至1000mL。3.2.11L-BAPA溶液：称取60mgL-BAPA(3.1.6)用1mL二甲亚矾（3.1.8）溶解，用三羟甲基氨基甲烷-氯化钙缓冲溶液（3.2.10)转移至100mL容量瓶中，稀释至刻度。用时现配。4仪器和设备
可见分光光度计。
分析天平：感量分别为0.01g、0.001g、0.0001g4.2
酸度计：精度为0.05。
离心机：转速≥4000r/min。
涡旋振荡器。
恒温水浴锅：精度为士0.1℃。
5分析步骤
5.1试样制备
对于粉末状样品，取有代表性的样品至少200，充分混匀后备用。对于块状或颗粒状样品，取有代表性的样品至少200g，粉碎至425um以下，充分混勾备用。粉碎过程中避免样品过热5.2样品提取
称取1g~10g（精确至0.001g）制备好的试样（5.1)于100mL锥形瓶中，加人50mL0.01mol/L氢氧化钠溶液，摇匀。用1mol/L盐酸溶液和0.1mol/L盐酸溶液调节pH至9.5土0.1，置于0℃~4℃冰箱中静置15h～24h。
将样品提取液取出放置至室温，转移至100mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇勾。经过15min的沉淀后，根据需要对样品提取液进行稀释。稀释度取决于预期的样品TIA值。将提取液保存于0℃～4℃冰箱中，可保存1d。
5.3样品提取液稀释
参照附录A中表A.1的稀释方案，将样品提取液稀释三个不同稀释浓度，确保在三个抑制百分率中至少有一个TIA值的测定结果在40%～60%之间。如果三个测定结果均没有在此范围内，则需要改变稀释度重新测定。5.4胰蛋白酶使用液活性测定
依据表1吸取一定量的溶液分别加人至两个10mL离心管中。2
加人物
L-BAPA溶液(3.2.11)
乙酸溶液（3.2.5）
表1胰蛋白酶使用液活性测定时各溶液加入量标准空白
GB5009.224—2016
单位为毫升
用涡旋振荡器（4.5）混匀离心管中的溶液，置于37℃恒温水浴锅（4.6）中.保温10min。在空白管中和标准管中各加入1mL胰蛋白酶使用液（3.2.9）.用涡旋振荡器（4.5)将试管内溶液混匀。将离心管放回到恒温水浴锅（4.6）中。在37℃水浴中保温10min士5s后，在标准管中加人1mL乙酸溶液（3.2.5），用涡旋振荡器（4.5）混匀。将离心管置于离心机（4.4)中，以4000r/min的速度离心10min。采用可见分光光度计（4.1），于410nm波长，用10mm比色皿以水调零，测定上清液的吸光度。该溶液应在2h内保持稳定，胰蛋白酶使用液的吸光度和空白液的吸光度之间的差值（A，一A）为0.380士0.050时，可以使用。否则，需重新配制胰蛋白酶使用液。必要时，取用一瓶新鲜的胰蛋白酶。5.5胰蛋白酶抑制剂活性的测定
按表2分别吸取一定量的四种溶液分别加入至四个10mL离心管中每一样品的试样稀释液（5.3）均需准备相应的空白溶液。样品提取液和相应的空白溶液在测定过程中应同时进行操作（包括离心步骤）。表2胰蛋白酶抑制剂活性测定时各溶液加入量加人物
L-BAPA溶液(3.2.11)
试样稀释液（5.3）
乙酸溶液（3.2.5）
标准空白
样品空白
单位为毫升
用涡旋振荡器（4.5）混匀离心管中的溶液，并置于37℃恒温水浴锅（4.6)中，保温10min。在四个离心管中各加人1mL胰蛋白酶使用液（3.2.9）。用涡旋振荡器将管内溶液混勾后，将试管放回到恒温水浴（4.6)中。在37℃C水浴中保温10min士5s后，在标准试管中和样品管中加人1mL乙酸溶液（3.2.5）.混匀
将离心管置于离心机（4.4)中，以4000r/min速度离心10min。采用可见分光光度计（4.1），于410nm波长，用10mm比色皿，以水调零，测定上清液的吸光度。该溶液可在2h内保持稳定。
6分析结果的表述
6.1样品提取液的抑制率
样品提取液的抑制率按式（1)计算：(A,-AM)-(A,-A)
式中：
抑制率；
标准溶液的吸光度；
标准空白溶液的吸光度；
样品溶液的吸光度；
样品空白溶液的吸光度；
100%—
换算系数。
胰蛋白酶抑制剂活性
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胰蛋白酶抑制剂活性按式（2)计算，以每克样品抑制胰蛋白酶毫克数（mg/g)表示：TIA
式中：
胰蛋白酶抑制剂活性，单位为毫克每克（mg/g)；抑制百分率；www.bzxz.net
换算系数；
胰蛋白酶使用液的质量浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；（2)
5.6×103.该数值是满足本实验胰蛋白酶活性条件下（5.4）的胰蛋白酶纯度折算系数试样的质量，单位为克（g）；
-样品提取液的稀释度（表A.1所示理论稀释度，mL/100mL）。计算结果精确至0.1mg/g。
精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。其他
本方法的检出限为0.5mg/g。
样品提取液的稀释方案见表A.1。附录A
样品提取液稀释方案
表A.1样品提取液的稀释表
预计的TIA
不同抑制百分率的理论稀释度（FmL/100mL
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样品提取液稀释方案的图解实例见图A.1。100
GB5009.224—2016
TTA/(my/g)
胰蛋白酶抑制剂活性与样品理论稀释度（F）的关系6
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