GB 15193.3-2014 食品安全国家标准 急性经口毒性试验 GB15193.3-2014 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国国家标准
GB15193.3—2014
食品安全国家标准
急性经口毒性试验
2014-12-24发布
中华人民共和国
国家卫生和计划生育委员会
2015-05-01实施
本标准代替GB15193.3—2003《急性毒性试验》。本标准与GB15193.3—2003相比，主要变化如下：一标准名称修改为“食品安全国家标准急性经口毒性试验”；修改了范围：
—增加了试验报告和试验的解释；修改了实验动物和试验方法；
一删除了最大耐受剂量法，增加了限量法和上-下法；——修改了附录。
GB15193.3—2014
1范围
食品安全国家标准
急性经口毒性试验bzxZ.net
本标准规定了急性经口毒性试验的基本试验方法和技术要求本标准适用于评价受试物的急性经口毒性作用：术语和定义
急性经口毒性
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一次或在24h内多次经口给予实验动物受试物后，动物在短期内出现的毒性效应2.2半数致死量（LD50）
经口一次或24h内多次给予受试物后，能够引起动物死亡率为50%的受试物剂量，该剂量为经过统计得出的计算值。其单位是每千克体重所摄人受试物质的毫克数或克数，即mg/kg体重或g/kg体重3试验目的和原理
急性经口毒性试验是检测和评价受试物毒性作用最基本的一项试验，即经口一次性或24h内多次给予受试物后，在短期内观察动物所产生的毒性反应，包括中毒体征和死亡，通常用LD来表示该试验可提供在短期内经口接触受试物所产生的健康危害信息；作为急性毒性分级的依据；为进一步毒性试验提供剂量选择和观察指标的依据；初步估测毒作用的靶器官和可能的毒作用机制。4试验方法
受试物
4.1.1受试物的配制
应将受试物溶解或悬浮于合适的溶媒中，首选溶媒为水，不溶于水的受试物可使用植物油（如橄榄油、玉米油等），不溶于水或油的受试物亦可使用羧甲基纤维素、淀粉等配成混悬液或糊状物等。受试物应新鲜配制，有资料表明其溶液或混悬液储存稳定者除外。4.1.2受试物的给予
4.1.2.1途径
经口灌胃。
试验前禁食
试验前动物需禁食，一般大鼠需整夜禁食（一般禁食16h左右），小鼠需禁食4h～6h，自由饮水。1
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给予受试物后大鼠需继续禁食3h~4h，小鼠需继续禁食1h～2h。若采用分批多次给予受试物，可根据染毒间隔时间的长短给动物一定量的饲料。4.1.2.3灌胃体积
各受试物组的灌胃体积应相同，大鼠为10mL/kg体重，小鼠为20mL/kg体重。如果溶媒为水，大鼠最大灌胃体积可达20mL/kg体重，小鼠可达40mL/kg体重4.1.2.4方式
一般一次性给予受试物。也可一日内多次给予（每次间隔4h～6h，24h内不超过3次，尽可能达到最大剂量，合并作为一次剂量计算）。4.1.2.5观察期限
般观察14d.必要时延长到28d.特殊应急情况下至少观察7d.4.2实验动物
4.2.1动物选择
实验动物的选择应符合国家标准和有关规定（GB14923、GB14922.1、GB14922.2）。选择两种性别的健康成年大鼠（180g～220g）和（或）小鼠（18g～22g），或选用其他实验动物。雌性动物应是未交配过、未妊娠的。同性别实验动物个体间体重相差不超过平均体重的士20%。4.2.2动物准备
试验前实验动物在试验环境中至少应进行3d～5d环境适应和检疫观察。4.2.3动物饲养
实验动物饲养条件、饮用水、饲料应符合国家标准和有关规定（GB14925、GB5749、GB14924.1、GB14924.2、GB14924.3)。每个受试物组动物按性别分笼饲养。每笼动物数以不影响动物自由活动和观察动物的体征为宜。对某些受试物常引起的特殊生物学特性及毒性反应（如易激动、互斗相残等）可作单笼饲养。试验期间实验动物喂饲基础饲料，自由饮水。4.3几种常用的急性毒性试验设计方法4.3.1霍恩氏（Horn）法
4.3.1.1预试验
根据受试物的性质和已知资料，选用下述方法：一般多采用100mg/kg体重，1000mg/kg体重和10000mg/kg体重的剂量，各以2只～3只动物预试。根据24h内死亡情况，估计LDs的可能范围，确定正式试验的剂量组。也可简单地直接采用一个剂量，如215mg/kg体重，用5只动物预试。观察2h内动物的中毒表现。如中毒体征严重，估计多数动物可能死亡，即可采用低于215mg/kg体重的剂量系列进人正式试验；反之中毒体征较轻，则可采用高于此剂量的剂量系列。如有相应的文献资料时可不进行预试。
4.3.1.2正式试验
4.3.1.2.1动物数
一般每组10只动物，雌雄各半。2
2常用剂量系列
4.3.1.2.2
2.15/×10
t=0.±1，±2，±3
t=0，±1，±2，±3
因为剂量间距较
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X10t=0，士1，土2，土3为小，所以结果较为精确。一般试验时，可根据上述剂量系列设计5个组，即较原来的方法在最低剂量组以下或最高剂量组以上各增设一组，这样在查表时容易得出结果。
3观察
4.3.1.2.3
观察期内记录动物死亡数、死亡时间及中毒表现等.根据每组死亡动物数和所采用的剂量系列，查表求得LDso（见附录A）。
4.3.2限量法（limittest）
4.3.2.1适用范围
该方法适用于有关资料显示毒性极小的或未显示毒性的受试物，给予动物一定剂量的受试物，仍不出现死亡。
4.3.2.2动物数
一般选20只动物，雌雄各半。
4.3.2.3剂量
般选用剂量至少应为10.0g/kg体重，如剂量达不到10.0g/kg体重，则给予动物最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃体积）。
4.3.2.4观察
给予受试物后，观察期内无动物死亡，则认为受试物对某种动物的经口急性毒性耐受剂量天于某一数值，其LD5.大于该数值。果动物出现死亡应选择其他方法4.3.3上-下法（up-downprocedureUDP）4.3.3.1适用范围
该方法主要适用于纯度较高、毒性较大、摄入量小且在给予受试物后动物1d～2d内死亡的受试物，对预期给予受试物后动物在5d及以后死亡的受试物不适用。可按照试验者选择的剂量序列或在专用软件包指导下进行试验，并对试验结果进行统计。4.3.3.2上-下法限量试验
以2000mg/kg体重剂量先给1只动物受试物，如果动物在48h内死亡，应进行正式试验。如果动物在48h内存活，另取4只动物以相同的剂量给予受试物，如5只动物中有3只死亡，应进行正式试验；如3只及以上的动物存活，结束试验，则该受试物LD5.>2000mg/kg体重，3
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如需要采用5000mg/kg体重剂量时，给1只动物受试物，如动物在48h内死亡.应进行正式试验。如在48h内动物存活，另取2只动物，仍以相同剂量给予受试物，如在14d的观察期内动物全部存活，结束试验，则该受试物LDso>5000mg/kg体重；如果14d的观察期内后2只动物中有1只或2只死亡，再追加2只动物，给予受试物后在14d观察期内5只动物中3只及以上动物存活，结束试验，该受试物LD>5000mg/kg；如5只动物中3只及以上动物分别在14d观察期内死亡，应进行正式试验。
正式试验
4.3.3.3.1动物数
单一性别，实验动物数一般为6只～9只。4.3.3.3.2剂量
选择起始剂量和剂量梯度系数时，如果没有受试物LDs的估计值资料，默认的起始剂量为175mg/kg体重；如果没有受试物的剂量-反应曲线斜率的资料，默认的剂量梯度系数为3.2（是斜率为2时的梯度系数），所设定的剂量系列为1.75mg/kg体重、5.5mg/kg体重、17.5mg/kg体重、55mg/kg体重、175mg/kg体重、555mg/kg体重、2000mg/kg体重或1.75mg/kg体重、5.5mg/kg体重、17.5mg/kg体重、55mg/kg体重、175mg/kg体重、555mg/kg体重、1750mg/kg体重5000mg/kg体重。对于剂量反应曲线斜率比较平缓或较陡的受试物，剂量梯度系数可加大或缩小，起始剂量可作适当调整。附录B列出了斜率为1～8的剂量梯度。4.3.3.3.3方法
试验开始时称量禁食后动物的体重，计算灌胃体积。经口灌胃，一次一只动物，每只动物的灌胃间隔时间为48h。第二只动物的剂量取决于第一只动物的毒性结果，如动物呈死状态或死亡，剂量就下调一级；如动物存活，剂量就上调一级。4.3.3.3.4终止试验的规定
是否继续给予受试物取决于固定的时间间隔期内所有动物的生存状态，首次达到以下任何一种情况时，即可终止试验
a）在较高剂量给予受试物中连续有3只动物存活：b）连续6只动物给予受试物后出现5个相反结果；c）在第一次出现相反结果后，继续给予受试物至少4只动物，并且从第一次出现相反结果后计算每一个剂量的似然值，其给定的似然比超过临界值。依照试验结束时的动物生存状态即可计算受试物的LD5。附录C描述了正式试验LDs估计值和可信限的计算方法及特殊情况的处理方法如果给予受试物后动物在试验的后期才死亡，而较该剂量还高的动物仍处于存活状态，应当暂时停正继续给予受试物，观察其他动物是否也出现延死亡。当所有已经给予受试物的动物其结局明确后再继续染毒。如果后面的动物也出现延迟死亡，表示所有染毒的剂量水平都超过了LD0，应当选择更适当的、低于已经死亡的最低剂量的两个剂量级重新开始试验，并要延长观察期限。统计时延迟死亡的动物按死亡来计算。
4.3.4寇氏（Korbor）法
4.3.4.1预试验
除另有要求外，一般应在预试验中求得动物全死亡或90%以上死亡的剂量和动物不死亡或10%以下死亡的剂量，分别作为正式试验的最高剂量与最低剂量。4.3.4.2动物数
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除另有要求外，一般设5个～10个剂量组，每组每种性别以6只～10只动物为宜。4.3.4.3剂量
将由预试验得出的最高、最低剂量换算为常用对数，然后将最高、最低剂量的对数差，按所需要的组数，分为几个对数等距(或不等距)的剂量组。4.3.4.4观察
给予受试物后，观察期内记录动物死亡数、死亡时间及中毒表现等。4.3.4.5试验结果的计算与统计
4.3.4.5.1列出试验数据及其计算表包括各组剂量（mg/kg体重，g/kg体重）、剂量对数（X）、动物数（n）、动物死亡数（r）、动物死亡百分比（P，以小数表示），以及统计公式中要求的其他计算数据项目。4.3.4.5.2LD5g的计算公式
根据试验条件及试验结果，可分别选用下列三个公式中的一个，求出IgLD5，再查其自然数，即为LDs。（mg/kg体重，g/kg体重）。按本试验设计得出的任何结果，均可用式（1）计算：IgLDao=
(X,+X+)X(P+1 P)
式中：
X,与X,+1—一相邻两组的剂量对数；P与P，一相邻两组动物死亡百分比。按本试验设计且各组间剂量对数等距时，可用式(2)计算：IgLD=XK
式中：
XK-最高剂量对数；
其他同式（1）。
-(P+Pt)
.（1）
按本试验设计且各组间剂量对数等距且最高、最低剂量组动物死亡百分比分别为100（全死）和0（全不死时），则可用便于计算的式（3计算。IgLDs=XK-d(ZP-0.5)
式中：
ZP——各组动物死亡百分比之和；其他同式（2）。
4.3.4.5.3标准误与95%可信限
IgLDsa的标准误（S)的计算见式（4）：S tet.Deo
ZP(I-P)
（3）
·（4）
95%可信限（X）的计算见式（5）：X =Ig-1(IgLDso±1.96 . SigLD)GB 15193.3—2014
·（5）
注：此法易于了解，计算简便，可信限不大，结果可靠，特别是在试验前对受试物的急性毒性程度了解不多时，尤为适用。
4.3.5机率单位
4.3.5.1预试验
对数图解法
以每组2只～3只动物找出全死和全不死的剂量。动物数
一般每组每种性别不少于10只，各组动物数不一定要求相等。4.3.5.3剂量及分组
一般在预试验得到的两个剂量组之间拟出等比的六个剂量组或更多剂量组。此法不要求剂量组间呈等比关系，但等比可使各点距离相等，有利于作图。4.3.5.4观察
给予受试物后，观察期内记录动物死亡数、死亡时间及中毒表现等。4.3.5.5作图计算
4.3.5.5.1将各组按剂量及死亡百分率，在对数概率纸上作图。除死亡百分率为0%及100%外，也可将剂量化成对数，并将百分率查概率单位表（见附录D）得其相应的概率单位作点于普通算术格纸上0%及100%死亡率在理论上不存在，为计算需要用式（6）和式（7）代替：0%
0.25X100m
100%(N-0.25)
式中：
+++++.++++.++
N一一该组动物数，相当于0%及100%的作图用概率单位（见附录E）。4.3.5.5.2划出直线.以透明尺目测.并照顾概率。4.3.5.6计算标准误
标准误计算见式（8）：
式中：
SE-标准误；
LDu与LD之差，即2S=LD4-LD（或EDED）；概率单位3.5~6.5之间（反应百分率为6.7%~93.7%）各组动物数之和......(6)
........(7)
（8）
注：相当于LD及LD1的剂量均可从所作直线上找到。也可用普通方格纸作图，查表将剂量换算成对数值，将死亡率换算成概率单位，方格纸横坐标为剂量对数，纵坐标为概率单位，根据剂量对数及概率单位作点连成线，由概率单位5处作一水平线与直线相交，由相交点向横坐标作一垂直线，在横坐标上的相交点即为剂量对数值，求反对数LD值。
4.3.6急性联合毒性试验
4.3.6.1原理
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两种或两种以上的受试物同时存在时，可能发生拮抗、相加或协同三种不同的联合作用方式，可以根据一定的公式计算和判定标准来确定这三种不同的作用4.3.6.2步骤
4.3.6.2.1分别测定单个受试物的LD50方法同4.3.1、4.3.2、4.3.3、4.3.4、4.3.54.3.6.2.2按各受试物的LD5o值的比例配制等毒性的混合受试物，4.3.6.2.3测定混合物的LDso，用其他LDs.测定方法时，可以按各个受试物的LDso值的二分之一之和作为中组，然后按等比级数向上、下推算几组，与单个受试物LD测定的设计相同，如估计是相加作用，可向上、下各推算两组：如可能为协同作用，则可向下多设几组；如可能为拮抗作用，则可向上多设几组。4.3.6.3计算
4.3.6.3.1混合物中各个受试物是以等毒比例混合的，因此求出的LD乘以各受试物的比例，即可求得各受试物的剂量。
4.3.6.3.2用式（9)计算混合物的预期LDs值的比值，按比值判定作用的方式。1
混合物的预期LD值=受试物A的LD。值+受试物B的LDs值+…+受试物N的LD。值...（9)
式中：
a、b.n——A、B..N各受试物在混合物中所占的质量比例.a+b十十n=1。4.3.6.3.3判定受试物联合作用方式的比值采用Keplinger的规定，即小于0.57为拮抗作用，0.57~1.75为相加作用，大于1.75为协同作用4.4观察指标
4.4.1临床观察
观察包括皮肤、被毛、眼、黏膜以及呼吸系统、泌尿生殖系统、消化系统和神经系统等，特别要注意观察有无震颤、惊厥、流涎、腹泻、呆滞、嗜睡和昏迷等（见附录F）。在试验开始和结束时称取并记录动物体重，并且在观察期每周至少称取动物体重1次。全面观察并记录动物变化发生的时间、程度和持续时间，评估可能的毒作用靶器官。如发现动物处于濒死或表现出严重的疼痛和持续的痛苦状态应处死动物。死亡时间记录应当尽可能的精确。4.4.2病理学检查
所有的动物包括试验期间死亡、人道处死和试验结束处死的动物都要进行大体解剖检查，记录每只动物大体病理学变化，出现大体解部病理改变时应做病理组织学观察。5数据处理和结果评价
描述由中毒表现初步提示的毒作用特征，根据LDs值确定受试物的急性毒性分级（见附录G）。6报告
试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号。试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期。6.2
试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期6.4
试验摘要。
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受试物：名称、批号、剂型、状态（包括感官、性状、包装完整性、标识）、数量、前处理方法、溶媒实验动物：物种、品系、级别、数量、体重、性别、来源（供应商名称、实验动物生产许可证号）、动物检6.6
疫、适应情况，饲养环境（温度、相对湿度、实验动物设施使用许可证号），饲料来源（供应商、实验动物饲料生产许可证号）。
6.7试验方法：试验分组、每组动物数、剂量选择依据、受试物给予途径及期限、观察指标、统计学方法。6.8试验结果：动物生长活动情况、体重、体重增长、每只动物的反应（包括动物的毒性体征、严重程度，持续时间、是否可逆的、死亡率列表、每只动物大体解剖、病理组织学所见、LDs，和95%可信限，给出结果的统计处理方法。
6.9试验结论：受试物经口急性毒性的特点、可逆性、可能的靶器官、LDsa和95%可信限以及急性经口毒性分级。
7试验的解释
急性经口毒性试验可提供在短时间内经口接触受试物所产生的健康危害信息，为进一步毒性试验的剂量选择提供依据，并初步估测毒作用的靶器官和可能的毒作用机制。但由于动物和人存在种属差异，故试验结果外推到人存在一定的局限性8
附录A
霍恩氏（Horn）法LDso值计算（剂量递增法测定LDso计算用表）GB15193.3—2014
A.1表A.1用于每组5只动物，其剂量递增公比为V10，意即10×10=21.5，21.5×V10=46.4，余此类推。此剂量系列排列如下：1.00
2.15/×10%
t=0，±1,±2，±3·..
霍恩氏（Horn）法LDso值计算（剂量递增公比为/o）剂量1=0.464
剂量2=1.00
剂量3-2.15
剂量4=4.64
可信限
1.37~2.91
1.26~2.33
1.23~3.24
1.05~2.78
0.951~2.27
0.926~1.71
1.01~2.91
0.862~2.50
0.775~2.05
0.741~1.57
0.7402.14
0.665~1.75
1.22~3.14
1.07~2.43
1.05~1.70
1.06~3.60
0.866~3.01
0.7372.41
0.661~1.83
0.818~3.19
0.658~2.70
0.550~2.20
0.523~2.32
1.00~3.58
剂量1=1,00）
剂量22.15
剂量3-4.64
剂量4=10.0
可信限
2.71~5.01
2.65~6.98
2.27~5.99
2.00~3.69
2.17~6.28
1.86~~5.38
1.69~4.41
1.60~3.99
1.43~3.78
2.63~6.76
2.26~3.65
2.29~7.75
1.87~6.49
1.59~5.20
1.42~3.95
1.76~6.37
1.19~4.74
1.13~4.99
剂量1=2.15
剂量2=4.64
剂量3=10.0
剂量4=21.5
可信限
6.36~13.5
5.84~10.8
5.70~15.0
4.89~12.9
4.41~10.5
4.30~7.94
4.67~13.5
4.00~13.5
3.60~9.50
3.44~7.30
3.08~8.14
5.66~14.6
4.98~11.3
4.87~7.87
4.02~16.7
3.42~11.2
3.07~8.51
3.80~14.8
3.05~12.5
2.55~10.2
2.43~10.8
4.66~16.6
剂量1=0.464
剂量2-1.00
剂量3=2.15
剂量4=4.64
表A.1（续）
剂量1=1.00
可信限
0.8062.67
0.674~1.92
0.839~4.29
0.616~3.50
0.466~2.77
0.573~3.76
0.406~3.18
1.18~3.26
1.27~2.05
0.978-3.92
0.893~2.92
0.885~2.01
0.930~4.12
0.797~3.28
0.715~2.49
0.686~1.77
0.676~2.63
0.599~2.02
0.9693.71
1.02~2.11
0.757~4.75
0.654~3.30
0.581~2.22
0.706~5.09
0.564~3.82
0.454~2.85
0.423~3.05
0.662~4.78
0.583~2.52
0.455~6.95
0.327~4.48
0.410~7.72
0.266~5.52
1.12~3.20
0.7774.63
剂量2-2.15
剂量3=4.64
剂量4=10.0
可信限
1.74~5.76
1.81~9.23
1.33~7.53
1.00~5.98
1.24~8.10
0.875~6.85
2.53~7.02
2.74~4.42
1.92~6.30
1.91~4.33
2.00~8.88
1.72~7.06
1.54~5.36
1.46~5.67
2.20~4.54
1.63~10.2
1.41~7.10
1.25~4.79
1.52~11.0
0.977~6.13
0.912~6.57
1.43~10.3
0.980~15.0
0.705~9.66
0.883~16.6
0.573~11.9
GB 15193.3—2014
剂量1-2.15
剂量2-4.64
剂量3=10.0
剂量4=21.5
可信限
3.74~12.4
3.13~8.89
2.86~16.2
2.16~12.9
2.66~17.4
1.89~14.8
5.46~15.1
5.90~9.53
4.54~18.2
4.14~13.6
4.11~9.33
4.31~19.1
3.70~15.2
3.32~11.5
3.19~8.19
3.14~12.2
2.78~9.39
4.50~17.2
4.74~9.78
3.51~22.0
3.03~15.3
3.28~23.6
2.62~17.7
2.11~13.2
1.97~14.2
3.07~22.2
2.71~11.7
2.11~32.3
1.52~20.8
1.90~35.8
1.23~25.6
5.22~14.8
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