GB 15193.4-2014 食品安全国家标准 细菌回复突变试验 GB15193.4-2014 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国国家标准
GB15193.4—2014
食品安全国家标准
细菌回复突变试验
2014-12-24发布
中华人民共和国
国家卫生和计划生育委员会
2015-05-01实施
本标准代替GB15193.4—2003《鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验》。本标准与GB15193.4—2003相比，主要变化如下：标准名称修改为食品安全国家标准细菌回复突变试验”；修改了范围：
增加了术语和定义；
修改了试验目的和原理；
修改了仪器；
修改了磷酸盐贮备液的配制方法；修改了组氨酸-生物素溶液的配制方法；修改了对DMSO的要求；
修改了辅酶-Ⅱ和葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液的配制要求；修改了进行菌株基因型鉴定的条件；修改了对增菌培养的要求；
修改了受试物的特殊处理；
修改了选择溶媒的要求；
修改了剂量设计的内容；
修改了试验菌株；
修改了试验方法中对观察结果所需时间的规定；修改了对照组的设置；
GB15193.4—2014
增加了制备S9的方法、生物素缺陷型菌株的鉴定、结果判定的内容、试验报告的要求、试验的解释；
修改了附录。
1范围
食品安全国家标准
细菌回复突变试验
GB15193.4—2014
细菌回复突变试验包括鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验和大肠杆菌细菌回复突变试验。本标准规定了鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验的基本技术要求，选择大肠杆菌进行细菌回复突变试验时应参阅有关文献。
本标准适用于评价受试物的致突变作用。2术语和定义
细菌回复突变试验
以营养缺陷型的突变体菌株为指示生物检测基因突变的体外试验。常用的菌株有组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌和色氨酸营养缺陷型的大肠杆菌。2.2碱基取代型基因突变
DNA多核苷酸链上某个碱基为另一个碱基取代.引起DNA碱基序列异常。移码型基因突变
在DNA碱基序列中插人或缺失了一个或几个（除了3和3的倍数）碱基，按三联密码连续阅读的规则，该部位以后的密码子组成全部改变，指导合成的多肽链也全部发生改变。3试验自的和原理
检测受试物对微生物（细菌）的基因突变作用，预测其遗传毒性和潜在的致癌作用。细菌回复突变试验利用鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌来检测点突变，涉及DNA的一个或几个碱基对的置换、插人或缺失见附录A。鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的试验菌株分别为组氨酸缺陷突变型和色氨酸缺陷突变型，在无组氨酸或色氨酸的培养基上不能生长，在有组氨酸或色氨酸的培养基上才能正常生长。致突变物存在时可以回复突变为原养型，在无组氨酸或色氨酸的培养基上也可以生长。故可根据菌落形成数量来衡量受试物是否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能使上述细菌产生回复突变，受试物要同时在有和没有代谢活化系统的条件下进行试验
4仪器和试剂
4.1仪器
实验室常用设备、低温高速离心机、低温冰箱（一80℃）或液氮罐、生物安全柜、恒温培养箱、恒温水浴、灭菌设备、匀浆器等
4.2试剂
4.2.1营养肉汤培养基
牛肉膏
胰蛋白陈
氯化钠
磷酸氢二钾（K,HPO：3H2O）
GB15193.4—2014
加蒸馏水至500mL，加热溶解，调pH至7.4，分装后0.103MPa灭菌20min，4℃保存备用，保存期不超过半年。
4.2.2营养肉汤琼脂培养基
琼脂粉
加营养肉汤培养基至100mL，加热融化后调节pH为7.4,0.103MPa灭菌20min。4.2.3底层培养基
配制方法
在400mL灭菌的1.5%琼脂培养基（100℃）中依次加入磷酸盐贮备液8mL，40%葡萄糖溶液20mL，充分混勾，冷却至80℃左右时按每平血25mL（相对于90mm平皿）制备平板，冷凝固化后倒置于37℃培养箱中24h，备用。
4.2.3.2磷酸盐贮备液（Vogel-BonnerminimalmediumE，50倍）磷酸氢钠铵（NaNHHPO4·4H,O)
柠檬酸(C,H.O·H,O)
磷酸氢二钾（K,HPO,）
硫酸镁（MgSO47H.O)
加蒸馏水至100mL溶解，0.103MPa灭菌20min。注：待其他试剂完全溶解后再将硫酸镁缓慢放人其中继续溶解，否则容易析出沉淀。4.2.3.340%葡萄糖溶液
葡萄糖40.0g加蒸馏水至100mL.0.055MPa灭菌20min。4.2.3.41.5%琼脂培养基
琼脂粉6.0g加入400mL锥形瓶，加蒸馏水至400mL，融化后.0.103MPa灭菌20min4.2.4顶层培养基
加热融化顶层琼脂，每100mL顶层琼脂中加10mL组氨酸-生物素溶液（0.5mmol/L）。混匀，分装在4个烧瓶中.0.103MPa灭菌20min。用时融化分装小试管，每管2mL，45℃水浴中保温。顶层琼脂和组氨酸-生物素溶液（0.5mmol/L）配制如下。4.2.4.1顶层琼脂
琼脂粉3.0g，氯化钠2.5g加蒸馏水至500mL，0.103MPa灭菌20min。2
组氨酸-生物素溶液（0.5mmol/L）（诱变试验用）GB15193.4—2014
D-生物素（相对分子质量244）30.5mg和L-组氨酸（相对分子质量155）19.4mg加蒸馏水至250mL，0.103MPa灭菌20min。
4.2.5特殊试剂及培养基
4.2.5.10.8%氨苄青霉素溶液（鉴定菌株用，无菌配制）氨荣青霉素40mg用氢氧化钠溶液（0.02mol/L）稀释至5mL，保存4℃冰箱备用。4.2.5.20.1%结晶紫溶液（鉴定菌株用）100mg结晶紫，溶于无菌水至100mL。4.2.5.3L-组氨酸溶液和D-生物素溶液（0.5mmol/L）（鉴定菌株用）L-组氨酸0.4043g和D-生物素12.2mg分别溶于蒸馏水至100mL,0.103MPa灭菌20min.保存于4℃冰箱备用。
4.2.5.40.8%四环素溶液（用于四环素抗性试验和氨苄青霉素-四环素平板）40mg四环素用盐酸缓冲液（0.02mol/L）稀释至5mL，保存于4℃冰箱。4.2.5.5氨芋青霉素平板（用作TA97、TA98、TA100菌株的主平板）和氨苄青霉素-四环素平板（用作TA102菌株的主平板）
每1000mL由以下成分组成：
底层培养基
组氨酸水溶液（0.4043g/100mL）生物素（0.5mmol/L）
0.8%氨芋青霉素溶液
0.8%四环素溶液
四环素仅在使用对四环素有抗性的TA102时加人。各成分均已分别灭菌或无菌制备。4.2.5.6组氨酸-生物素平板（组氨酸需要试验用）每1000mL中由以下成分组成：
底层培养基
组氨酸水溶液（0.4043g/100mL）生物素（0.5mmol/L）
各成分均已分别灭菌。
4.2.5.7二甲亚砜（DMSO)
光谱纯，无菌。
4.2.6阳性诱变剂的配制
根据所选择的诱变剂的种类和剂量用适当的溶媒配制阳性对照品（见附录B、附录C）注：培养基成分或试剂除特殊说明外至少应是化学纯，无诱变性。避免重复高温处理，选择适当保存温度和期限4.310%S9混合液的制备
4.3.1S9辅助因子的配制
镁钾溶液
氯化镁1.9g和氯化钾6.15g加蒸馏水溶解至100mL。3
4.3.1.2磷酸盐缓冲液（0.2mol/L)（pH7.4）磷酸氢二钠（NazHPO+，28.4g/L）440mL
磷酸二氢钠（NaH,PO,·HzO，27.6g/L）60mL调pH至7.4.0.103MPa灭菌20min或滤菌。4.3.1.3辅酶-Ⅱ（氧化型）溶液GB15193.4—2014
无菌条件下称取辅酶-Ⅱ，用无菌蒸馏水溶解配制成溶液（0.025mo1/L），现用现配。4.3.1.4葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液无菌条件下称取葡萄糖-6-磷酸钠盐，用无菌蒸馅水溶解配制成溶液（0.05mo1/L），现用现配4.3.2大鼠肝S9组分的诱导和配制选健康雄性成年SD或Wistar大鼠，体重150g～200g，周龄约5周6周。将多氯联苯（Aroclor1254）溶于玉米油中，浓度为200g/L，按500mg/kg体重无菌操作一次腹腔注射，5d后处死动物，处死前禁食12h。
也可采用苯巴比妥钠和β-萘黄酮联合诱导的方法进行制备，经口灌胃给予大鼠苯巴比妥钠和β-茶黄酮，剂量均为80mg/kg，连续3d，禁食16h后断头处死动物。其他操作同多氯联苯诱导。处死动物后取出肝脏，称重后用新鲜冰冷的氯化钾溶液（0.15mo1/L）连续冲洗肝脏数次，以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。每克肝（湿重）加氯化钾溶液（0.1mol/L)3mL，连同烧杯移人冰浴中，用无菌剪刀剪碎肝脏，在玻璃匀浆器（低于4oo0r/min，1min～2min）或组织匀浆器（低于20000r/min，1min)中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境将制成的肝匀浆在低温（0℃～4℃）高速离心机上以9000g离心10min，吸出上清液为S9组分，分装于无菌冷冻管或安颜中，每安颜2mL左右，用液氮或干冰速冻后置80℃低温保存。S9组分制成后，经无菌检查，测定蛋白含量（Lowry法），每毫升蛋白含量不超过40mg为宜，并经间接致癌物（诱变剂）鉴定其生物活性合格后贮存于深低温或冰冻干燥，保存期不超过1年。4.3.310%S9混合液的制备
10%S9混合液一般由S9组分和辅助因子按1：9组成，也可将浓度配制成30%（不同受试物所需S9浓度不同），临用时新鲜无菌配制，或过滤除菌。10%S9混合液10mL配制如下：磷酸盐缓冲液
镁钾溶液
葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液
辅酶-Ⅱ溶液
肝S9组分
混匀，置冰浴中待用。
用每平板0.5mLS9混合液（含20μL~50μLS9）测定其对已知阳性致癌物（诱变剂）的生物活性，确定最适用量。也可按一般用量，即每平血0.5mLS9混合液。5菌株及其鉴定与保存
5.1试验菌株
推荐采用下列的菌株组合：
鼠伤寒沙门氏菌TA1535；
鼠伤寒沙门氏菌TA97a或TA97或TA1537：鼠伤寒沙门氏菌TA98：
鼠伤寒沙门氏菌TA100；
GB15193.4—2014
鼠伤寒沙门氏菌TA102或大肠杆菌WP2uvrA或大肠杆菌WP2uvrA（PKM101)5.2菌株的鉴定
5.2.1总则
菌株特性应与回复突变试验标准相符。菌株的鉴定包括：基因型鉴定、自发回变数鉴定和对阳性致突变物敏感性的鉴定。
每3个月进行一次菌株鉴定，遇到下列情况也应进行菌株鉴定：在收到培养菌株后；
当制备一套新的冷冻保存或冰冻干燥菌株时：c)
重新挑选菌株时；
使用主平板传代时。
5.2.2鉴定方法
增菌培养
在5mL营养肉汤培养基中用接种环接种贮存菌培养物，37℃振荡（100次/min）培养10h或静置培养16h，使活菌数不少于1×10%/mL~2×10/mL。5.2.2.2组氨酸缺陷型（his)的鉴定5.2.2.2.1底层培养皿的制备
加热融化底层培养基两瓶。一瓶不加组氨酸，每100mL底层培养基中加0.5mmolD-生物素0.6mL；另一瓶加组氨酸，每100mL底层培养基中加L-组氨酸1mL和0.5mmolD-生物素0.6mL。冷却至50℃左右，每种底层培养基各倒两个平板。5.2.2.2.2接种
取有组氨酸和无组氨酸培养基平板各一个，按菌株号顺序各取一接种环的菌液划直线于培养基表面，37℃培养48h。
3结果判定
5.2.2.2.3
株菌在有组氨酸培养基平板表面各长出一条菌膜，在无组氨酸培养基平板上除自发回变菌落外无菌膜，说明受试菌株确为组氨酸缺陷型。5.2.2.3脂多糖屏障缺陷(rfa)的鉴定5.2.2.3.1接种
加热融化营养肉汤琼脂培养基。取菌液0.1mL移人平板，迅速将营养肉汤琼脂培养基（冷却至50℃左右)适量倒人平板，混勾，平放凝固。将无菌滤纸片一片放人已凝固的培养基平板中央，用移液器在滤纸片上滴加0.1%结品紫溶液10μL，37℃培养24h，每个菌株做一个平板，5
5.2.2.3.2结果判定
GB15193.4—2014
阳性者在纸片周围出现一个透明的抑制带，说明存在rfa突变。这种变化允许某些大分子物质进入细菌体内并抑制其生长。
5.2.2.4R因子（抗氨苄青霉素）的鉴定5.2.2.4.1接种
加热融化营养肉汤琼脂培养基，冷却到50℃左右，适量倒入平板中，平放凝固.用移液器吸0.8%的氨芋青霉素10μL，在凝固的培养基表面沿中线涂成一条带，待氨苄青霉素溶液干后，用接种环取各菌株菌液与氨苄青霉素带相交叉划线接种·并且接种一个不具有R因子的菌株作氨苄青霉素抗性的对照，37℃培养24h，一个平板可同时鉴定几个菌株。5.2.2.4.2结果判定
菌株在氨芋青霉素带的周围依然生长不受抑制，即有抗氨苄青霉素效应，证明它们都带有R因子。5.2.2.5四环素抗性的鉴定
5.2.2.5.1接种
用移液器各吸取5uL～10uL0.8%的四环素溶液和0.8%的氨苄青霉素溶液，在营养肉汤琼脂培养基平板表面沿中线涂成一条带，待四环素和氨苄青霉素溶液干后，用接种环取各菌株菌液与四环素和氨苄青霉素带相交叉划线接种TA102和一种有R因子的菌株（作四环素抗性的对照），37℃培养24h。5.2.2.5.2结果判定
TA102菌株生长不受抑制，对照菌株有一段生长抑制区，表明TA102菌株有抗四环素效应。5.2.2.6uvrB修复缺陷型的鉴定下载标准就来标准下载网
5.2.2.6.1接种
在营养肉汤琼脂培养基平板表面用接种环划线接种需要的菌株。接种后的平板一半用墨纸覆盖在距15W紫外线灭菌灯33cm处照射8s.37℃培养24h。5.2.2.6.2结果判定
对紫外线敏感的三个菌株（TA97、TA98、TA100)仅在没有照射过的一半生长，具有野生型切除修复酶的菌株TA102仍能生长。
生物素缺陷型(bio)的鉴定
5.2.2.7.1底层培养血的制备
加热融化底层培养基两瓶。一瓶加生物素，每100mL底层培养基中加0.5mmolD-生物素0.6ml和L-组氨酸1mL；另一瓶不加生物素，每100mL底层培养基中加L-组氨酸1mL.冷却至50℃左右：每种底层培养基各倒两个平板
5.2.2.7.2接种
取有生物素和无生物素培养基平板各一个，按菌株号顺序各取一接种环的菌液划直线于培养基表6
面，37℃培养48h。
5.2.2.7.3结果判定
GB 15193.4—2014
株菌在有生物素培养基平板表面各长出一条菌膜，在无生物素培养基平板上除自发回变菌落外无菌膜，说明受试菌株确为生物素缺陷型、5.2.2.8自发回变率的测定
5.2.2.8.1测定方法
准备底层培养基平板8个。融化顶层培养基8管，每管2mL，在45℃水浴中保温。在每管顶层培养基中，分别加人待鉴定的测试菌株的菌液0.1mL一式两份，轻轻摇勾，迅速将此试管内容物倒人已固化的底层培养基平板中，转动平板，使顶层培养基均匀分布，平放固化，37℃培养48h，计数菌落数5.2.2.8.2结果判定
每一株的自发回变率应落在表A.3所列的正常范围内。5.3菌株的保存
鉴定合格的菌株应保存在深低温（如一80℃），或加人9%光谱级DMSO作为冷冻保护剂保存在液氮条件下（一196℃）。无上述条件者可冰冻干燥制成干粉，4℃保存。除液氮条件外，保存期一般不超过2年。主平板贮存于4℃，超过2个月后应丢弃（TA102除外，保存2周后丢弃）。6试验设计及受试物的处理
6.1溶媒
溶媒应不与受试物发生反应，对所选菌株和S9没有毒性，没有诱变性。首选蒸馏水，对于不溶于水的受试物可选择其他溶媒，首选DMSO（每平板最高添加量不超过0.1mL）。也可选择其他溶媒。6.2剂量设计
决定受试物最高剂量的原则是受试物对试验菌株的毒性和受试物的溶解度。进行预试验有助于了解受试物对菌株的毒性和受试物的溶解度。对于无细菌毒性的可溶性受试物推荐的最高剂量是5mg/血或5L/血；对于溶解度差的受试物，可以采用悬浊液，但溶液浑浊的程度（沉淀的多少）不能影响菌落计数。由于溶解度或者毒性的限制最大剂量达不到5mg/皿或5μL/Ⅲ时，最高剂量应为出现沉淀或细菌毒性的剂量。评价含有潜在致突变杂质的受试物时.试验剂量可以高于5mg/血或5μL/皿。对于需要前处理的受试物（如液体饮料、袋泡茶、口服液和辅料含量较大的样品等），其剂量设计应以处理后的样品计。
每种受试物在允许的最高剂量下设4个剂量组，包括加和不加S9两种情况。按等比组距的原则设定剂量间隔，推荐采用/10倍组距。每个剂量应作3个平板。一般受试物的最低剂量不低于0.2ug/Ⅲ。受试物应无菌，必要时以适当的方法灭菌或除菌。6.3对照组的设置
试验应同时设阳性对照组、溶媒对照组和未处理对照组，包括加和不加S9种情况阳性对照物要根据所采用的菌株进行选择，并选择合适的剂量以保证每次试验的有效性，可参考附录B、附录C或其他资料
溶媒对照组的处理方法除不加人受试物外与处理组相同。GB 15193.4—2014
当阳性致突变物采用DMSO溶解，而受试物不用DMSO溶解时，应同时做DMSO溶媒对照6.4含组氨酸受试物
对已知和经证实含有组氨酸并可能影响试验结果的受试物必要时进行预处理（如经XADⅡ树脂柱过滤）。
7试验方法
7.1总则
常用的试验方法有平板掺人法、预培养平板掺人法和点试法等。7.2平板掺入法
7.2.1将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内，37℃振荡（100次/min）培养10h或静置培养16h，使活菌数不少于1×10°/mL~2×10%/mL。7.2.2底层培养基平板，每个剂量加S9和不加S9均做3个平板7.2.3融化顶层培养基分装于无菌带帽小试管（试管数与平板数相同），每管2mL，在45℃水浴中保温。
7.2.4在保温的顶层培养基（试管）中依次加人测试菌株新鲜增菌液0.1mL，混匀；试验组加受试物0.05mL~0.2mL（一般加人0.1mL，需活化时另加10%S9混合液0.5mL)，再混匀，迅速倾人铺好底层培养基的平板上，转动平板使顶层培养基均勾分布在底层培养基上，平放固化：37℃培养48h观察结果，必要时延长至72h观察结果。7.2.5阳性对照组加入同体积标准诱变剂；溶媒对照组只加入同体积的溶媒；未处理对照组只在培养基上加菌液；其他方法同试验组7.3预培养平板掺入法
预培养对于某些受试物可取得较好效果。因此可根据情况确定是否进行预培养。在加人顶层培养基前，先进行以下预培养步骤：a）将受试物（需活化时另加10%S9混合液0.5mL）和菌液，在37℃中培养20min，或在30℃中培养30min；
b）再加入2mL顶层琼脂；
其他同7.2。
7.4点试法
7.4.1按7.2.1操作。
7.4.2按7.2.2操作。
7.4.3按7.2.3操作。
7.4.4在水浴保温的顶层培养基中依次加人测试增菌液0.1mL（需活化时另加10%S9混合液0.5mL），混勾，迅速倾入底层培养基上，转动平板，使顶层培养基在底层分布均匀。平放固化后取无菌滤纸片（直径约为6mm），小心放在已固化的顶层培养基的适当位置上，用移液器取适量受试物（如10uL），点在纸片上，或将少量固体受试物结晶加到纸片或琼脂表面；37℃培养48h观察结果7.4.5另作阳性对照组和溶媒对照组，分别在滤纸片上加入同体积标准诱变剂、溶媒，未处理对照组滤8
纸片上不加物质，其他步骤同上。8数据处理与结果评价
回变菌落计数
GB15193.4—2014
直接计数培养基上的回变菌落数，计算各菌株各剂量3个平板回变菌落数的均数和标准差。8.2掺入法结果评价
在背景生长良好的条件下，测试菌株TA1535、TA1537、TA98和大肠杆菌的回变菌落数等于或大于未处理对照组的2倍，其他测试菌株的回变菌落数等于或大于未处理对照组的2倍，并具有以下a）、b）两种情况之一的可判定为阳性结果：a）有剂量-反应关系；
b）某一测试点有可重复的阳性结果8.3点试法结果评价
如在受试物点样纸片周围长出较多密集的回变菌落，与未处理对照相比有明显区别者，可初步判定该受试物诱变试验阳性，但应该用掺入法试验来验证。8.4验证
明显的阳性结果不需要进行验证可疑的结果要改用其他的方法进行验证：阴性结果需要验证（即重复一次），应改变试验的条件，如剂量间距（改为5倍间距)等。8.5对照组结果评价
阳性结果表明受试物对试验菌株的基因组诱发了点突变。阴性结果表明，在该试验条件下受试物对测试菌株不诱发基因突变。
9报告
试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号9.2
试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期。试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期9.3
试验摘要。
受试物：名称、鉴定资料、CAS编号（如已知）、纯度、与本试验有关的受试物的物理和化学性质及稳定性等。
9.6溶媒：溶媒的选择依据，受试物在溶媒中的溶解性和稳定性。9.7
菌株：来源、名称、浓度（细菌个数/皿）及菌株特性（包括菌株鉴定的时间和结果）。9.8
试验条件：剂量、代谢活化系统、标准诱变剂、操作步骤等。9试验结果：受试物对菌株的毒性、背景菌苔生长情况、平板上是否有沉淀、每个平板的回变菌落数、9.9
各剂量各菌株加和不加S9每皿回变菌落数的均数和标准差、是否具有剂量-反应关系、统计结果，同时进行的溶媒对照和阳性对照的均数和标准差、以及溶媒对照和阳性对照的历史范围9.10结论：本试验条件下受试物是否具有致突变作用。9
试验的解释
GB15193.4—2014
本试验采用的是原核细胞，与哺乳动物细胞在摄取、代谢、染色体结构和DNA修复等方面都有所不同。体外试验一般需要外源性代谢活化，但体外代谢活化系统不能完全模拟哺乳动物体内代谢条件，因此，本试验结果不能直接外推到哺乳动物本试验通常用于遗传毒性的初步筛选，并特别适用于诱发点突变的筛选。已有的数据库证明在本试验为阳性结果的很多化学物在其他试验也显示致突变活性。也有一些致突变物在本试验不能检测，这可能是由于检测终点的特殊性质、代谢活化的差别，或生物利用度的差别。本试验不适用于某些类别的化学物，如强杀菌剂和特异性干扰哺乳动物细胞复制系统的化学品。对这些受试样品可使用哺乳动物细胞基因突变试验对于各菌株的自发回变范围，各实验室在参考其他实验室数据的基础上应建立自己的历史对照数据库，形成适合本实验室条件的实用范围，10
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