GB 5009.240-2016 食品安全国家标准 食品中伏马毒素的测定 GB5009.240-2016 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国国家标准
GB5009.240—2016
食品安全国家标准
食品中伏马毒素的测定
2016-08-31发布
人民共和国
国家卫生和计划生育委员会
2017-03-01实施
GB5009.240—2016
本标准代替GB/T25228—2010《粮油检验玉米及其制品中伏马毒素含量测定免疫亲和柱净化高效液相色谱法和荧光光度法》、SN/T19582007《进出口食品中伏马毒素B残留量检测方法酶
联免疫吸附法》.SN/T1572—2005《进出口粮谷中伏马毒素检验方法高效液相色谱法》。
本标准将以上标准进行了整合，主要修订如下：—一标准名称修改为“食品安全国家标准食品中伏马毒素的测定”；伏马毒素种类增加为伏马毒素B、B2、B三种；一增加了免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱法作为第一法；——增加了高效液相色谱-串联质谱联用法作为第二法；取消荧光光度法；
改变了样品提取溶液；
一改变了免疫亲和柱净化-柱前衍生高效液相色谱法流动相的组成。1
1范围
食品安全国家标准
食品中伏马毒素的测定
GB5009.240—2016
本标准规定了玉米及其制品中伏马毒素B、伏马毒素B，、伏马毒素B（以下简写为FBFB、FB）的测定方法。
本标准第一法为免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱法，第二法为高效液相色谱-串联质谱联用法，第三法为免疫亲和柱净化-柱前衍生高效液相色谱法，适用于玉米及其制品中伏马毒素的测定第一法免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱法2原理
样品用乙睛-水溶液提取，经稀释后过免疫亲和柱净化，去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质。经高效液相色谱分离后柱后邻苯二甲醛衍生，荧光检测，外标法定量。3试剂和材料
除非另有说明，本方法使用的试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水，3.1试剂
3.1.1甲醇(CH,OH)：色谱纯
3.1.2乙睛（CH.CN)：色谱纯。
3.1.3乙酸(CH,COOH)。
3.1.4氢氧化钠（NaOH)。
氯化钠（NaCI)。
磷酸氢二钠（NazHPO4）。
磷酸二氢钾（KH,PO,）。
氯化钾(KCI)。
硼砂（NaB,O,·10H,O)。
2-巯基乙醇（C,H.OS)。
邻苯二甲醛（OPA,CsH,O，）。
吐温-20（C5sHi4O26）。
溶液配制
甲酸水溶液（0.1%）：吸取1mL甲酸，加人到999mL水中，混合均勾。乙睛-水溶液（50+50）：分别量取500mL乙睛和500mL水，混合均匀。乙睛-水溶液（20十80）：分别量取200mL乙睛和800mL水，混合均匀。1
3.2.4甲醇-乙酸溶液（98+2）：吸取2mL乙酸，加人到98mL甲醇中，混合均匀GB5009.240—2016
3.2.5氢氧化钠溶液（1mol/L）：准确称取氢氧化钠4.0g，溶于100mL水，混合均3.2.6磷酸盐缓冲液（PBS)：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾，用980mL水溶解，用盐酸调整pH至7.4，用水稀释至1000mL，混合均匀3.2.7吐温-20/PBS溶液（0.1%）：吸取1mL吐温-20，加人磷酸盐缓冲液（3.2.6）并稀释至1000mL，混合均匀。
3.2.8硼砂溶液（0.05mo1/L，pH10.5）：称取硼砂19.1g，溶于980mL水中，用氢氧化钠溶液调pH至10.5，用水稀释至1000mL，混合均勺。3.2.9衍生溶液：称取2.0g邻苯二甲醛.溶于20mL甲醇中，用硼砂溶液（0.05mol/L.pH10.5）（3.2.8）稀释至500mL，加人2-巯基乙醇500μL，混勾，装人棕色瓶中，现用现配。3.3标准品
伏马毒素B（FBi，CgHsNO1s），纯度≥95%，或有证标准溶液。3.3.1
3.3.2伏马毒素B（FBz，C34HsgNOu），纯度≥95%，或有证标准溶液。3.3.3伏马毒素B（FB.C34HsNO1），纯度≥95%，或有证标准溶液。3.4标准溶液配制
3.4.1标准储备溶液（0.1mg/mL）：分别准确称取FB、FBz、FB，各0.01g（精确至0.0001g）)至小烧杯中，用乙睛-水溶液（3.2.2)溶解，并转移至100mL容量瓶中，定容至刻度。此溶液密封后避光一20℃保存。有效期6个月。
3.4.2混合标准溶液：准确吸取FB标准储备液1mL、FBz和FB，标准储备液0.5mL至同一10mL容量瓶中，加乙睛-水溶液（3.2.2)稀释至刻度，得到FB，浓度为10μg/mL、FBz和FB浓度为5μg/mL的混合标准溶液。再稀释10倍，得到FB，浓度为1μg/mLFBz和FB，浓度为0.5μg/mL的混合标准溶液。此溶液密封后避光4℃保存，有效期6个月。3.4.3混合标准工作溶液：准确吸取混合标准溶液用乙睛-水溶液（3.2.3）稀释，配制成FB，浓度依次为20ng/mL80ng/mL、160ng/mL、240ng/mL，320ng/mL、400ng/mL，FBz和FB，浓度依次为10ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、120ng/mL、160ng/mL、200ng/mL的系列混合标准工作溶液4仪器和设备
高效液相色谱仪，带荧光检测器。4.2
柱后衍生系统。
天平：感量0.01g和0.0001g。
均质器。
振荡器。
氮吹仪。
离心机：转速≥4000r/min。
免疫亲和柱（柱容量≥5000ng，FB，柱回收率≥80%)（柱容量及柱回收率验证方法参见附录B)。4.8
注：对于每个批次的亲和柱在使用前需进行质量检验。4.9微孔滤膜：0.45um，有机型。5分析步骤
5.1样品制备
将固体样品按四分法缩分至1kg，全部用谷物粉碎机磨碎并细至粒度小于1mm，混匀分成2份作2
为试样，分别装人洁净的容器内，密封，标识后置于4℃下避光保存。GB5009.240—2016
玉米油样品直接取2份作为试样，分别装入洁净的容器内，密封，标识后置于4℃下避光保存。在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。5.2试样提取
准确称取固体样品5g（精确至0.01g）样品于50mL离心管中，加入20mL乙睛-水溶液（3.2.2），涡旋或振荡提取20min，取出后，在4000r/min下离心5min，将上清液转移至另一离心管中。玉米油样品操作同固体样品，提取液在下层。5.3试样净化
取2mL提取液，加人47mL吐温-20/PBS溶液（3.2.7），混合均匀后过免疫亲和柱，流速控制在1mL/min~3mL/min，用10mLPBS缓冲液淋洗免疫亲和柱，分别用1mL甲醇-乙酸溶液（3.2.4）洗脱免疫亲和柱三次，收集洗脱液，55℃下氮吹至干，加入1mL乙睛-水溶液（3.2.3）溶解残渣。涡旋30s，过0.45um微孔滤膜后，收集于进样瓶中，待测。注：由于不同厂商提供的免疫亲和柱操作程序可能不同，实际操作时，请参照厂商提供的操作说明和程序使用。仪器参考条件
色谱柱：Cl8色谱柱：250mmX4.6mm，5μm，或相当者。检测波长：激发波长335nm；发射波长440nm。流动相：A：甲酸水溶液（3.2.1）；B：甲醇。梯度洗脱，洗脱程序见表1。流动相流速：0.8mL/min。
衍生液流速：0.4mL/min。
柱温：40℃。
反应器温度：40℃。
进样量：50μL。
表1流动相洗脱程序
5.5试样溶液的测定
流动相A
流动相B
在5.4项色谱条件下，将50.0uL系列伏马毒素混合标准工作溶液（3.4.3）按浓度从低到高依次注人高效液相色谱仪：待仪器条件稳定后，以目标物质的浓度为横坐标（x轴），目标物质的峰面积为纵坐标（y轴），对各个数据点进行最小二乘线性拟合，标准工作曲线按式（1）计算：3
式中：
——目标物质的峰面积比；
回归曲线的斜率；
目标物质的浓度；
回归曲线的截距。
y=ax+b
GB5009.240—2016
.（1)
标准工作溶液和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内，如果样品含量超过标准曲线范围，需稀释后再测定。
空白试验
不称取试样，按5.2和5.3的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质6分析结果的表述
待测样品中FB、FB2、FB的含量按式（2)计算：X-GxVxf
式中：
X——待测样品中FB、FB2、FB的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；C
待测物进样液中FB、FBz、FB的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；定容体积，单位为毫升（mL）；试液稀释倍数；
样品的称样量，单位为克（g）。m
注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留两位有效数字7精密度
·（2）
样品中伏马毒素含量在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。
8其他
当称样量为5g时，FBr、FBz、FB：的检出限分别为17ug/kg、8ug/kg、8μg/kg；定量限分别为50μg/kg、25μg/kg、25μg/kg。第二法高效液相色谱-串联质谱联用法9原理
样品加人同位素内标，乙晴水溶液提取，经稀释后过免疫亲和柱或强阴离子交换固相萃取柱净化去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质。净化液中的伏马毒素经过高效液相色谱分离，串联质谱检测，同位素内标法定量。4
试剂和材料
GB5009.240—2016
除非另有说明，本方法使用的试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。10.1试剂
甲醇（CH，OH）：色谱纯。
乙睛（CH:CN)：色谱纯。
乙酸(CH,COOH)。
氯化钠(NaCI)。
磷酸氢二钠（NazHPO4）。
磷酸二氢钾（KH,PO,）。
氯化钾（KCI)。
吐温-20（CsH4O2）。
溶液配制
甲酸水溶液（0.1%）：吸取1mL甲酸，加人到999mL水中，混合均匀。乙晴-甲醇溶液（50十50）：分别量取500mL甲醇和500mL乙睛，混合均勺。乙晴-水溶液（50十50）：分别量取500mL乙晴和500mL水，混合均勺。乙晴-水溶液（20十80）：分别量取200mL乙晴和800mL水，混合均匀。甲醇-水溶液（60+20）：分别量取600mL甲醇和200mL水，混合均勾。甲醇-乙酸溶液（99+1）：吸取1mL乙酸，加人到99mL甲醇中，混合均匀。甲醇-乙酸溶液（98十2）：吸取2mL乙酸，加入到98mL甲醇中，混合均匀磷酸盐缓冲液（PBS)：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾，用10.2.8
980mL水溶解，用盐酸调整pH至7.4，用水稀释至1000mL.混合均匀。10.2.9
吐温-20/PBS溶液（0.1%）：吸取1mL吐温-20加人磷酸盐缓冲液（10.2.8）并稀释至1000mL.混合均匀。
10.3标准品
10.3.1FB,、FB2、FB3标准品
伏马毒素B（FB，CsHsNO），纯度≥95%或有证标准溶液。伏马毒素Bz（FBz，C34HNO14），纯度≥95%，或有证标准溶液。伏马毒素B:（FB，CsHs，NO），纯度≥95%，或有证标准溶液。213C34-伏马毒素B,、B2、B，同位素内标10.3.2
13C34-伏马毒素B（1*C34-FB.C34HsgNO1s），纯度≥95%或有证标准溶液。13Ca1-伏马毒素B（13C3t-FBz.C,HsNO1），纯度≥95%，或有证标准溶液。13C34-伏马毒素B（13C4-FBC34HsNO14），纯度≥95%，或有证标准溶液。注：在检测中可以只使用13C4-FB一种同位素内标，但需要对被测定试样基质进行加标实验，评估和确定\C34-FB与其他被测伏马毒素的基质效应。或使用基质匹配校正曲线10.4标准溶液配制
10.4.1标准储备溶液（0.1mg/mL）：分别准确称取FB、FBz、FB各0.01g（精确至0.0001g）至小烧5
GB5009.240—2016
杯中，用乙睛-水溶液（10.2.3）溶解，并转移至100mL容量瓶中，定容至刻度。此溶液密封后避光一20℃保存。有效期6个月。
10.4.2混合标准溶液：准确吸取FB，标准储备液1mL、FBz和FB，标准储备液0.5mL至同一10mL容量瓶中，加乙睛-水溶液（10.2.3）稀释至刻度，得到FB，浓度为10μg/mL、FB，和FB，浓度分别为5ug/mL的混合标准溶液。再稀释10倍，得到FB浓度为1pg/mL、FB，和FB，浓度分别为0.5ug/mL的混合标准溶液。此溶液密封后避光4℃保存。有效期6个月。10.4.3混合同位素标准溶液：准确吸取13C31-FB（25μg/mL）、3C31-FBz（10μg/mL）、13C31-FB（10ug/mL）各1mL至同一10mL容量瓶中，加乙腈-水溶液（10.2.3）稀释至刻度，得到含13C4-FB2.5μg/mL、1\C34-FB,和13C34-FB，1ug/mL的混合同位素标准溶液。再稀释10倍，得到含1\C4-FB250ng/mL、3C-FBz和13C-FB，100ng/mL的混合同位素标准工作溶液。有效期6个月10.4.4混合标准工作溶液：准确吸取混合标准溶液，用乙睛-水溶液（10.2.4）稀释，加人混合同位素标准工作溶液（10.4.3）.配制成FB浓度依次为20ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、240ng/mL、320ng/mL、400ng/mLFB,和FB，浓度依次为10ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、120ng/mL、160ng/mL、200ng/mL的系列混合标准工作溶液，每个标准工作溶液中含有13C34-FB25ng/mL、\C4-FBz和13Ca4-FB10ng/mL。
仪器和设备
11.1高效液相色谱-串联质谱联用仪：配有电喷雾离子源，11.2天平：感量0.01g和0.0001g。11.3均质器。
11.4振荡器。
11.5氮吹仪。
11.6离心机：转速≥4000r/min
强阴离子交换固相萃取柱（硅胶基，6mL，500mg）。11.7
11.8免疫亲和柱（柱容量≥5000ng，FB柱回收率≥80%）。（柱容量及柱回收率验证方法参见附录B）注：对于每个批次的亲和柱在使用前需进行质量检验微孔滤膜：0.22um，有机型。
2分析步骤
12.1样品制备
将固体样品按四分法缩分至1kg，全部用谷物粉碎机磨碎并细至粒度小于1mm，混勾分成2份作为试样，分别装人洁净的容器内，密封，标识后置于4℃下避光保存。玉米油样品直接取2份作为试样，分别装入洁净的容器内，密封，标识后置于4℃下避光保存。在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。12.2试样提取
准确称取固体样品5g（精确至0.01g）样品于50mL离心管中，加人混合同位素标准工作溶液（10.4.3）400uL，加人20mL乙睛-水溶液（10.2.3），涡旋或振荡提取20min，取出后，在4000r/min下离心5min，将上清液转移至另一离心管中。玉米油样品操作同固体样品，提取液在下层6
12.3试样净化
免疫亲和柱净化
GB5009.240—2016
取2mL提取液，加人47mL吐温-20/PBS溶液（10.2.9），混合均勾后过免疫亲和柱，流速控制在1mL/min~3mL/min，用10mLPBS缓冲液（10.2.8）淋洗免疫亲和柱.分别用1mL甲醇-乙酸溶液(10.2.7)洗脱免疫亲和柱三次，收集洗脱液，55℃下氮吹至干，加入1mL乙睛-水溶液（10.2.4）溶解残渣。涡旋30s，过0.22um微孔滤膜后，收集于进样瓶中，待测。注：由于不同厂商提供的免疫亲和柱操作程序可能不同，实际操作时，请参照厂商提供的操作说明和程序使用。12.3.2强阴离子交换固相萃取柱净化取3mL提取液，加入8mL甲醇-水溶液（10.2.5），混合均勾后过强阴离子交换固相萃取柱（使用前按要求活化），分别用8mL甲醇-水溶液（10.2.5）和3mL甲醇淋洗，用10mL甲醇-乙酸溶液（10.2.6）洗脱，55℃下氮吹至干，加入1mL乙睛-水溶液（10.2.4）溶解残渣。涡旋30s，过0.22μm微孔滤膜后，收集于进样瓶中，待测。
12.4仪器参考条件
12.4.1液相色谱条件
色谱柱：Cis柱，100mmX2.1mm，1.7μm，或相当者。流动相：A：甲酸水溶液（0.1%）；B：乙腈-甲醇溶液（50+50）。梯度洗脱，梯度见表2。流速：0.35mL/min。
柱温：30℃。
进样量：10μL。
流动相梯度洗脱程序
质谱参数
流动相A
离子化模式：电喷雾电离正离子模式（ESI十）。质谱扫描方式：多反应监测（MRM）。监测离子对信息见表3，其他仪器参考条件见附录C。流动相B
毒素名称
13Cat-FB
13C34-FB2
1Ca-FB
12.5定性判定
母离子
表3质谱参数
子离子
碰撞能量
子离子
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碰撞能量
用高效液相色谱-串联质谱联用法对样品进行定性判定，在相同试验条件下，样品中应呈现定量离子对和定性离子对的色谱峰，被测物质的质量色谱峰保留时间与标准溶液中对应物质的质量色谱峰保留时间一致；样品色谱图中所选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过表4规定范围，则可以判断样品中存在对应的目标物质。表4：定性确证时相对离子丰度的最大充许偏差相对离子丰度（k）
允许的最大偏差
12.6定量测定
k≥50%
50%>≥20%
20%>10%
k≤10%
在5.4高效液相色谱-串联质谱联用分析条件下，将10.0μL系列伏马毒素混合标准溶液（10.4.4)按浓度从低到高依次注高效液相色谱-串联质谱联用仪：待仪器条件稳定后：以目标物质和内标的浓度比为横坐标（x轴），目标物质和内标的峰面积比为纵坐标（y轴），对各个数值点进行最小二乘线性拟合，标准工作曲线按式（3)计算：式中：
目标物质/内标的峰面积比；
回归曲线的斜率；
-目标物质/内标的浓度比；
b——回归曲线的截距。
y=ar+bWww.bzxZ.net
标准工作溶液和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内，如果含量超过标准曲线范围，则重新取样，增加相应内标添加量，使内标浓度与待测液浓度相匹配，然后稀释到适当浓度后分析12.7空白试验
不称取试样，按12.2和12.3的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。8
3分析结果的表述
本方法采用内标法定量。
含量按式（4)计算：
式中：
X=Xc,XAXA.XV
CsiXA XA,Xm
样品中待测组分的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；标准溶液中待测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；测定液中待测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；测定液中待测组分的峰面积；
标准溶液中内标物质的峰面积；定容体积，单位为毫升（mL）；标准溶液中内标物质的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；测定液中内标物质的峰面积；
标准溶液中待测组分的峰面积；样品称样量，单位为克（g）。
注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留两位有效数字。14精密度
GB5009.240—2016
样品中伏马毒素含量在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。
5其他
当称样量为5g时FB、FB、FB，的检出限分别为7μg/kg、3μg/kg、3ug/kg：定量限分别为20μg/kg、10μg/kg、10μg/kg。第三法免疫亲和层析净化-柱前衍生高效液相色谱法6原理
样品用乙睛-水溶液提取，经稀释后过免疫亲和柱净化，去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质。净化液中的伏马毒素经过OPA衍生后进高效液相色谱分离，荧光检测，外标法定量。17
试剂和材料
除非另有说明，本方法使用的试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。17.1试剂
甲醇(CH.OH)：色谱纯。
乙睛（CH,CN)：色谱纯。
乙酸(CH.COOH)。
氢氧化钠(NaOH)。
氯化钠（NaCI)。
磷酸氢二钠（Na2HPO)。
磷酸二氢钾（KH,PO）。
氯化钾(KCI)。
硼砂（NazB,O,·10HzO)。
2-硫基乙醇（CHOS)。
邻苯二甲醛（OPA.C.HO,)。
吐温-20（CHmO26）。
17.2溶液配制
GB5009.240—2016
甲酸铵-甲酸水溶液（0.1mol/L，pH：3.3）：称取6.3g甲酸铵，溶于980mL水中，用甲酸调pH至3.3，用水稀释至1000mL，混合均勾。乙腈-水溶液（50十50）：分别量取500mL乙和500mL水，混合均匀。17.2.2
乙睛-水溶液（20+十80）：分别量取200mL乙睛和800mL水，混合均匀。17.2.4
甲醇-乙酸溶液（98+2）：吸取2mL乙酸，加人到98mL甲醇中，混合均匀。17.2.5
氢氧化钠(1mol/L)溶液：准确称取氢氧化钠4.0g，溶于100mL水.混合均匀。磷酸盐缓冲液（PBS)：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾，用17.2.6
980mL水溶解，然后用盐酸调整pH至7.4，最后用水稀释至1000mL，混合均匀17.2.7吐温-20/PBS溶液（0.1%）：吸取1mL吐温-20.加人磷酸盐缓冲液（17.2.6）并稀释至1000mL，混合均匀。
17.2.8硼砂溶液（0.1mol/L）：称取硼砂3.8g，用水溶解并稀释至100mL，混合均匀。17.2.9衍生溶液：准确称取40mg邻苯二甲醛，溶于1mL甲醇中，用硼砂溶液（0.1mol/L）（17.2.8）5mL稀释，加入2-统基乙醇50μL，混合均匀，装人棕色瓶中，现用现配。17.3标准品
FB、FB2、FB.标准品：
伏马毒素B（FB，CsHs.NO1s），纯度≥95%，或有证标准溶液。伏马毒素B（FBCHNO），纯度≥95%，或有证标准溶液。伏马毒素B（FBs，Cs4Hs.NOi），纯度≥95%，或有证标准溶液。17.4标准溶液配制
17.4.1标准储备溶液（0.1mg/mL）：分别准确称取FBFBzFB各0.01g（精确至0.0001g）至小烧杯中，用乙睛-水溶液（17.2.2)溶解，并转移至100mL容量瓶中，定容至刻度。此溶液密封后避光一20℃保存。有效期6个月。
17.4.2混合标准溶液：准确吸取FB标准储备液1mL、FB,和FB，标准储备液各0.5mL至同一10mL容量瓶中，加乙-水溶液（17.2.2）稀释至刻度，得到FB，浓度为10μg/mL、FB，和FB，浓度分别为5μg/mL的混合标准溶液。再稀释10倍，得到FB，浓度为1μg/mL、FBz和FB，浓度为0.5μg/mL的混合标准溶液。此溶液密封后避光4℃保存，有效期6个月。10
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