GB∕T 15670.9-2017
基本信息
标准号： GB∕T 15670.9-2017
中文名称：农药登记毒理学试验方法 第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.rar .pdf
下载大小：2195KB
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
GB∕T 15670.9-2017 农药登记毒理学试验方法 第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验
GB∕T15670.9-2017
标准压缩包解压密码：www.bzxz.net
标准图片预览
标准内容
ICS65.100
中华人民共和国国家标准
GB/T15670.9-—2017
部分代替GB/T15670—1995
农药登记毒理学试验方法
第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验Toxicological test methods for pesticides registration-Part 9: Skin sensitisation test2017-07-12发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2018-02-01实施
GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则；
第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法：第3部分：急性经口毒性试验序贯法；第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；
第6部分：急性吸入毒性试验；
第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验；第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验；第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验；第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验；第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸人染毒（28大）毒性试验：第13部分：亚慢性毒性试验；
第11部分：细菌回复突变试验；第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验：第18部分：啮齿类动物显性致死试验；第19部分：体外哺乳动物细胞染色休畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验；第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验；GB/T15670.9—2017
第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；第23部分：致畸试验；
第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验；
第27部分：致癌试验；
第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验。本部分为GB/T15670的第9部分。本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草，本部分部分代替GB/T15670—1995《农药登记毒理学试验方法》。本部分与GB/T15670一1995的皮肤变态反应（致敏）试验部分相比主要变化如下：修改和调整了标准的总体结构和编排格式：增加了一些章节内容（见第1章、第2章、第3章、第5章、6.1、6.2、6.3.3.4,6.3.3.6、6.4、6.5和第7章）；
修改了对实验动物的要求（见6.3.1，1995年版的7.3）；1
GB/T15670.9—2017
修改了对阳性和阴性对照组设置的要求（见6.3.3.5，1995年版的7.5.2)；修改了结果评定的内容（见6.3.41995年版的7.6）；一增加了豚鼠最大值试验和小鼠局部淋巴结分析试验两个试验方法（见6.4、6.5）。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由中华人民共和国农业部种植业管理司归口。本部分起草单位：农业部农药检定所。本部分主要起草人：张宏伟、张丽英、曲莞莞、陶传江。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T15670—1995。
TYKAONKAca
1范围
农药登记毒理学试验方法
第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验GB/T15670.9—2017
GB/T15670的本部分规定了皮肤变态反应（致敏）试验的基本原则、方法和要求本部分适用于为农药登记而进行的皮肤变态反应（致敏）试验。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB14925实验动物环境及设施
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
皮肤变态反应skinsensitization过敏性接触性皮炎allergic contactdermatitis皮肤对一种物质产生的免疫源性皮肤反应。人类这种反应可能以瘙痒、红斑、丘疹、水疱、融合水疱为特征。动物的反应不同，可能只见到皮肤红斑和水肿。3.2
诱导接触inductionexposure
机体通过接触受试物而诱导出过敏状态的试验性暴露。3.3
诱导阶段inductionperiod
机体通过接触受试物而诱导出过敏状态所需的时间，一般至少1周。3.4
激发接触challengeexposure
机体接受诱导暴露后，再次接触受试物的试验性暴露，以确定皮肤是否会出现过敏反应。3.5
刺激指数stimulationindex;SI
试验组淋巴结H-甲基脱氧胸腺嘧啶苷或-\I-碘苷的结合值与对照组（溶剂或赋形剂）淋巴结\H-甲基脱氧胸腺嘧啶苷或1251-碘苷的结合值的比值（率）。4试验目的
确定重复接触受试物对哺乳动物是否可引起皮肤变态反应及其程度。1
KAONKAca
GB/T15670.9-2017
5试验概述
局部封闭涂皮试验（Buehlertest，BT）和豚鼠最大值试验（guineapigmaximisationtest，GPMT）是实验动物通过多次皮肤涂抹（诱导接触）或皮内注射受试物10d~14d（诱导阶段）后，给于激发剂量的受试物，观察实验动物，并与对照动物比较对激发接触受试物的皮肤反应强度。小鼠局部淋巴结分析试验（locallymphnodeassay，LL.NA）是通过耳部给予实验动物受试物，引起淋巴结的淋巴细胞增生，淋巴细胞增生与受试物剂量（过敏程度)成比例。利用放射性标记方法，测定试验组与对照组淋巴细胞的标记率，并进行对比，获得刺激指数，评价致敏强度。6试验方法
6.1实验动物和饲养环境
局部封闭涂皮试验和豚鼠最大值试验宜选用健康、成年雄性或雌性豚鼠雌性动物应选用未妊娠和未经产的。
小鼠局部淋巴结分析试验宜选用健康8周12周雕性未妊娠和未经产的CBA.Ca或CBA/小鼠。体重变异不超过平均体重的土20%，除非有无分证据说明其他的种系或性别在此武验中对结果没有影响，原则上不采用其他的种系或性别动物实验动物饲养环境和条件应符合GB14补充适量Vc。
6.2动物试验前准备
的有关规定。选用常规同料饮水不限制，豚鼠需注意试验前动物在实验动物房环境中至少检疫适应5d时间，将动物随机分为受试物组和对照组，按所选用的试验方法，选择适当部位给动物备皮专毛避免损伤皮肤，小鼠局部淋巴结分析试验不要采用耳部标记记号的方式，试验开始和结束时应记录动物体重无论在诱导阶股或激发阶段均应对动物进行全面观察，包括全身反应和局部反应，并作完整记录。6.3局部封闭涂皮试验（BuehlerTest，BT）6.3.1动物数
试验组至少20只，对照组至少10只6.3.2剂量水平
透诱导接触受试物浓度为能引起皮肤轻度刺激反应的最高浓度，激发接触受试物浓度为不能引起皮肤刺激反应的最高浓度。试验浓度水平可以通过少量动物（2只～3只的预试验获得水溶性受试物可用水或用无刺激性表面活性剂作为溶剂，非水溶性受试物如脂溶性受试物可用食用油或其他无刺激性、无致敏性的表面活性剂作溶剂，当受试物在诱导接触中用80%乙醇做溶剂时，则在激发接触中应用丙酮作溶剂。6.3.3试验步骤
6.3.3.1动物的准备
试验前约24h，将豚鼠背部左侧去毛，去毛范围为4cm2～6cm2
TTKAOKAca
6.3.3.2诱导接触
GB/T15670.9—2017
将受试物约0.2mL（g）涂在实验动物去毛区皮肤上.以二层纱布和一层玻璃纸覆盖，再以无刺激胶布封闭固定6h。第7天和第14天以同样方法重复一次。6.3.3.3激发接触
未次诱导后14d，将约0.2mL（g）的受试物涂于豚鼠背部右侧2cmX2cm去毛区（接触前24h去毛），然后用二层纱布和一层玻璃纸覆盖，再以无刺激胶布固定6h。6.3.3.4观察评分
激发接触后24h和48h观繁右侧皮肤反厂表1
红斑和焦痴形成
无红斑
轻微红斑（勉强可）
明显红斑（散在或小块红斑）
中度至重度红
按表1评分
变态反应试验（局部封闭涂皮法）皮肤反应评分皮肤反应
严重红斑（紫红色）至轻微焦制形成水肿形成
无水肿
轻微水肿（勉强可见）
中度水肿（皮肤隆起轮廓清梵
重度水肿（皮肤隆起药
试验对照
最高积分
试验中应设阴性对照组，使用6.3.3.2和6.3.3.3的方法，在诱导接触时仅涂以溶剂作为对照，在激发接触时涂以受试物。对照组动物应和受试物组动物为同使用新的动物种属或品系时，应同时设阳性对照组。6.3.3.6试验方法可靠性的检查
批。在实验室开展变态反应试验初期，或使用已知的能引起轻度/中度致敏的阳性物每隔半年检查一次。局部封闭涂皮试验至少有15%动物出现皮肤过敏反应。阳性物一般采用2，4-二硝基氯苯、肉桂醛、2-巯基苯并噻唑或对氨基苯甲酸乙酯。
6.3.4结果评价
6.3.4.1当受试物组动物出现皮肤反应积分≥2时，判为该动物出现皮肤变态反应阳性，按表2判定受试物的致敏强度。
TTKAONTKAca
GB/T15670.9—2017
致敏率%
81~100
表2致敏强度
注；当致敏率为0时，可判为未见皮肤变态反应。致敏强度
6.3.4.2如激发接触所得结果可疑，应于第一次激发后1周，给予第二次激发，对照组作同步处理或按6.4的方法进行评价。
6.4豚鼠最大值试验（GuineaPigMaximisationTest，GPMT）注：采用完全福氏佐剂（Freundcompleteadjuvant，FCA）皮内注射方法检测致敏的可能性。6.4.1动物数
试验组至少10只，对照组至少5只。如果试验结果难以确定受试物的致敏性，应增加动物数，试验组20只，对照组10只。
6.4.2剂量水平
诱导接触受试物浓度为能引起皮肤轻度到中度刺激反应的最高浓度，激发接触受试物浓度为不能引起皮肤刺激反应的最高浓度，试验浓度水平可以通过少量动物（2只～3只）的预试验获得。6.4.3试验步骤
6.4.3.1诱导接触（第0天）
受试物组：将颈背部去毛区（2cm×4cm）中线两侧划定三个对称点，每点皮内注射0.1mL下述溶液：
第1点：1：1（体积比）FCA/水或生理盐水的混合物；第2点耐受浓度的受试物；
第3点用1：1（体积比）FCA/水或生理盐水配制的受试物，浓度与第2点相同。对照组：注射部位同受试物组，每点皮内注射0.1mL下述溶液：第1点，1：1（体积比)FCA/水或生理盐水的混合物；第2点未稀释的溶剂；
一第3点，用1：1（体积比)FCA/水或生理盐水配制的浓度为500g/L的溶剂。6.4.3.2诱导接触（第7天）
将涂有0.5g（mL）受试物的2cm×4cm滤纸敷贴在上述再次去毛的注射部位，然后用两层纱布，一层玻璃纸覆盖，无刺激胶布封闭固定48h。对无皮肤刺激作用的受试物，可加强致敏，对照组和试验组动物于第二次诱导接触前24h在注射部位涂抹10%十二烷基硫酸钠（SLS)0.5mL。对照组仪用溶剂作诱导处理。
KAONIKAca
6.4.3.3激发接触（第21天）
GB/T15670.9—2017
将豚鼠干部去毛，用涂有0.5g（mL）受试物的2cm×2.cm滤纸片敷贴在去毛区，然后再用两层纱布，一层玻璃纸覆盖，无刺激胶布封闭固定24h。对照组动物作同样处理。如激发接触所得结果不能确定，可在第一次激发接触1周后进行第二次激发接触。对照组作同步处理。6.4.3.4试验方法可靠性的检查
使用已知的能引起轻度/中度致敏的阳性物每隔半年检查一次。豚鼠最大值试验至少有30%动物出现皮肤过敏反应。阳性物一般采用2,4-二硝基氯苯、肉桂醛、2-巯基苯并噻唑或对氨基苯甲酸乙酯。6.4.4观察及结果评价
激发接触结束，除去涂有受试物的滤纸后24h、48h和72h，观察皮肤反应，按表3评分。如需要清除受试残留物可用水或选用不改变皮肤已有反应和不损伤皮肤的溶剂。当受试物组动物皮肤反应积分≥1时，应判为变态反应阳性，按表2对受试物进行致敏强度分级。表3变态反应试验（豚鼠最大值法）皮肤反应评分皮肤反应
未见皮肤反应
散在或小块红斑
中度红斑和融合红斑
重度红斑和水肿
6.5小鼠局部淋巴结分析试验（locallymphnodeassay，LLNA）注：本方法由于使用放射性同位素，试验应严格按照同位素实验室的有关规定进行。6.5.1动物数
试验组和对照组至少各4只。
6.5.2剂量水平
至少设3个试验剂量浓度，1个阴性（溶剂）对照组以及1个阳性对照组。若要收集每个动物的试验数据，则每组至少需要5只小鼠。剂量可选择100%，50%，25%，10%，5%，2.5%，1%或0.5%等。选择的最高浓度应不产生急性毒性和局部刺激性。对照组除了不给予受试物外，动物处理方式应与试验组一致。
溶剂的选择应考虑到最高测试浓度和合适的溶解度。建议使用的溶剂有丙酮/橄榄油（4：1，体积比）、二甲基甲酰胺、甲乙酮、丙二醇、二甲基亚砜，也可使用其他合适的溶剂。6.5.3试验步骤
6.5.3.1受试物测试
试验第1天，称量每只动物的体重。在小鼠每只耳朵背部表面给予25uL的受试物，溶剂或阳性对照物。
第2,3天，重复第1天的步骤。第4、5天不进行任何处理。5
-TTTKAONTKAca
GB/T15670.9—2017
第6天，称量每只动物的体重。通过尾静脉给予试验组、对照组每只小鼠250uL的20uCi(7.4×105Bg）°H-甲基脱氧胸腺嘧啶苷的PBS缓冲液，也可给予250uL的2uCi（7.4×10*Bq）的1251-碘苷和1X10-5mol/L氟尿嘧啶脱氧核昔的PBS缓冲液。5h后，处死动物，以每个试验组为单位，分离每只动物耳部的一对淋巴结，放入PBS缓冲液中，也可以每只动物为单位，分离一对淋巴结。6.5.3.2耳部淋巴结分离
通常采用腹侧解剖的方法分离淋巴结，将小鼠腹部暴露，用70%乙醇湿润腹部和颈部。在胸部和前肢之间剪开，再与此相垂直沿中线剪开，直至下颌部。剥离皮肤暴露外侧颈部静脉，避开中线部位的睡液腺和与之相连的淋巴结。淋巴结位于咀嚼肌远端，颈静脉分枝处。淋巴结为均勾的、半透明状的结节。
6.5.3.3细胞悬液的制备
上述分离的淋巴结组织经研磨，过200目（μm）筛，在PBS缓冲液中充分洗涤2遍，于5%的三氯乙酸（TCA）4℃放置18h。沉淀重悬于1mL的5%三氯乙酸（TCA)中，转移至含有1.0mLH闪烁液的闪烁管内或直接转移至含125I的计数管内。6.5.3.4细胞增生的检测（放射活性的结合测定）通过β闪烁计数，以每分钟的衰变计算\H-甲基脱氧胸腺嘧啶苷的结合率。通过12I的计数管，以每分钟的衰变计算125I-碘苷的结合率。6.5.4实验动物的观察
每天应观察一次实验动物的一般表现、局部的刺激性或系统毒性，认真记录。试验前和处死动物前记录体重。
6.5.5结果评价
结果以刺激指数（stimulationindex，SI)表示。试验以组为单位：
试验以每只动物为单位：
SI_试验组动物放射性结合率
溶剂组放射性结合率
试验组每只动物的DPM均值
溶液组每只动物的DPM均值
其中DPM(disintcgrationspcrminute）为每分钟的衰变率。（1）
··（2)bZxz.net
利用每只动物进行分析、计算SI值的方法，可以评价处理组和溶剂组的每个数据并进行统计学分析。
阳性结果的判断，SI值≥3，具有剂量-反应关系和统计学意义。为了阐明某些研究结果，要考虑不同受试物的特性，包括是否与已知的致敏物结构相似，是否可引起过度皮肤刺激，所见的剂量-反应特点。7试验报告
试验报告至少应包括以下内容：a）试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号：6
-iiKAoNiiKAca
试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期和封样情况；b)
GB/T15670.9—2017
试验开始和结束日期、试验项日负责人、试验单位技术负责人，签发日期；d)
试验摘要
受试物名称、有效成分美国化学文摘登录号（CAS号）（如已知）、代码（如有）、纯度（或含量）、剂型、生产日期（批号）、理化性质、配制所用溶剂和方法：实验动物的种属、品系、级别、数量、体重、性别、来源（供应商名称、实验动物质量合格证号、实验动物生产许可证号），检疫、适应情况，实验动物饲养环境，包括温度、相对湿度、伺料、单笼饲养或群伺、实验动物设施使用许可证号；剂量和组别，包括选择剂量的原则和依据、动物分组方式和每组每种性别动物数；试验条件和方法，包括主要仪器和设备、染毒途径、染毒方案、试验周期、观察指标等；试验结果：以文字描述和表格逐项进行汇总，报告各组动物皮肤反应情况和致敏率等；小鼠局部淋巴结分析试验报告每个剂量组平均或单个的DPM值和刺激指数；可信度的检查，包括最近的可信度试验结果，实验室目前或历史上阳性物和阴性物控制数据：试验结论：给出受试物在试验条件下是否引起变态反应的结论，必要时对有关间题进行讨论原始记录保存情况的说明。
GB/T15670.9-2017
中华人民共和国
国家标准
农药登记毒理学试验方法
第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验GB/T15670.9—2517
中国标准出版社出版发行
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）网址spc.net.cn
总编室：(010)68533533发行中心：(010)51780238读者服务部：（010)68523946
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销
开本880×12301/16印张0.75字数18千字2017年7月第一次印刷
2017年7月第一版
书号：155066·1-53764定价16.00元告由本社发行中心调换
如有印装差错
侵权必究
版权专有
举报电话：（010)68510107
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。
中华人民共和国国家标准
GB/T15670.9-—2017
部分代替GB/T15670—1995
农药登记毒理学试验方法
第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验Toxicological test methods for pesticides registration-Part 9: Skin sensitisation test2017-07-12发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2018-02-01实施
GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则；
第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法：第3部分：急性经口毒性试验序贯法；第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；
第6部分：急性吸入毒性试验；
第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验；第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验；第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验；第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验；第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸人染毒（28大）毒性试验：第13部分：亚慢性毒性试验；
第11部分：细菌回复突变试验；第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验：第18部分：啮齿类动物显性致死试验；第19部分：体外哺乳动物细胞染色休畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验；第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验；GB/T15670.9—2017
第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；第23部分：致畸试验；
第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验；
第27部分：致癌试验；
第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验。本部分为GB/T15670的第9部分。本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草，本部分部分代替GB/T15670—1995《农药登记毒理学试验方法》。本部分与GB/T15670一1995的皮肤变态反应（致敏）试验部分相比主要变化如下：修改和调整了标准的总体结构和编排格式：增加了一些章节内容（见第1章、第2章、第3章、第5章、6.1、6.2、6.3.3.4,6.3.3.6、6.4、6.5和第7章）；
修改了对实验动物的要求（见6.3.1，1995年版的7.3）；1
GB/T15670.9—2017
修改了对阳性和阴性对照组设置的要求（见6.3.3.5，1995年版的7.5.2)；修改了结果评定的内容（见6.3.41995年版的7.6）；一增加了豚鼠最大值试验和小鼠局部淋巴结分析试验两个试验方法（见6.4、6.5）。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由中华人民共和国农业部种植业管理司归口。本部分起草单位：农业部农药检定所。本部分主要起草人：张宏伟、张丽英、曲莞莞、陶传江。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T15670—1995。
TYKAONKAca
1范围
农药登记毒理学试验方法
第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验GB/T15670.9—2017
GB/T15670的本部分规定了皮肤变态反应（致敏）试验的基本原则、方法和要求本部分适用于为农药登记而进行的皮肤变态反应（致敏）试验。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB14925实验动物环境及设施
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
皮肤变态反应skinsensitization过敏性接触性皮炎allergic contactdermatitis皮肤对一种物质产生的免疫源性皮肤反应。人类这种反应可能以瘙痒、红斑、丘疹、水疱、融合水疱为特征。动物的反应不同，可能只见到皮肤红斑和水肿。3.2
诱导接触inductionexposure
机体通过接触受试物而诱导出过敏状态的试验性暴露。3.3
诱导阶段inductionperiod
机体通过接触受试物而诱导出过敏状态所需的时间，一般至少1周。3.4
激发接触challengeexposure
机体接受诱导暴露后，再次接触受试物的试验性暴露，以确定皮肤是否会出现过敏反应。3.5
刺激指数stimulationindex;SI
试验组淋巴结H-甲基脱氧胸腺嘧啶苷或-\I-碘苷的结合值与对照组（溶剂或赋形剂）淋巴结\H-甲基脱氧胸腺嘧啶苷或1251-碘苷的结合值的比值（率）。4试验目的
确定重复接触受试物对哺乳动物是否可引起皮肤变态反应及其程度。1
KAONKAca
GB/T15670.9-2017
5试验概述
局部封闭涂皮试验（Buehlertest，BT）和豚鼠最大值试验（guineapigmaximisationtest，GPMT）是实验动物通过多次皮肤涂抹（诱导接触）或皮内注射受试物10d~14d（诱导阶段）后，给于激发剂量的受试物，观察实验动物，并与对照动物比较对激发接触受试物的皮肤反应强度。小鼠局部淋巴结分析试验（locallymphnodeassay，LL.NA）是通过耳部给予实验动物受试物，引起淋巴结的淋巴细胞增生，淋巴细胞增生与受试物剂量（过敏程度)成比例。利用放射性标记方法，测定试验组与对照组淋巴细胞的标记率，并进行对比，获得刺激指数，评价致敏强度。6试验方法
6.1实验动物和饲养环境
局部封闭涂皮试验和豚鼠最大值试验宜选用健康、成年雄性或雌性豚鼠雌性动物应选用未妊娠和未经产的。
小鼠局部淋巴结分析试验宜选用健康8周12周雕性未妊娠和未经产的CBA.Ca或CBA/小鼠。体重变异不超过平均体重的土20%，除非有无分证据说明其他的种系或性别在此武验中对结果没有影响，原则上不采用其他的种系或性别动物实验动物饲养环境和条件应符合GB14补充适量Vc。
6.2动物试验前准备
的有关规定。选用常规同料饮水不限制，豚鼠需注意试验前动物在实验动物房环境中至少检疫适应5d时间，将动物随机分为受试物组和对照组，按所选用的试验方法，选择适当部位给动物备皮专毛避免损伤皮肤，小鼠局部淋巴结分析试验不要采用耳部标记记号的方式，试验开始和结束时应记录动物体重无论在诱导阶股或激发阶段均应对动物进行全面观察，包括全身反应和局部反应，并作完整记录。6.3局部封闭涂皮试验（BuehlerTest，BT）6.3.1动物数
试验组至少20只，对照组至少10只6.3.2剂量水平
透诱导接触受试物浓度为能引起皮肤轻度刺激反应的最高浓度，激发接触受试物浓度为不能引起皮肤刺激反应的最高浓度。试验浓度水平可以通过少量动物（2只～3只的预试验获得水溶性受试物可用水或用无刺激性表面活性剂作为溶剂，非水溶性受试物如脂溶性受试物可用食用油或其他无刺激性、无致敏性的表面活性剂作溶剂，当受试物在诱导接触中用80%乙醇做溶剂时，则在激发接触中应用丙酮作溶剂。6.3.3试验步骤
6.3.3.1动物的准备
试验前约24h，将豚鼠背部左侧去毛，去毛范围为4cm2～6cm2
TTKAOKAca
6.3.3.2诱导接触
GB/T15670.9—2017
将受试物约0.2mL（g）涂在实验动物去毛区皮肤上.以二层纱布和一层玻璃纸覆盖，再以无刺激胶布封闭固定6h。第7天和第14天以同样方法重复一次。6.3.3.3激发接触
未次诱导后14d，将约0.2mL（g）的受试物涂于豚鼠背部右侧2cmX2cm去毛区（接触前24h去毛），然后用二层纱布和一层玻璃纸覆盖，再以无刺激胶布固定6h。6.3.3.4观察评分
激发接触后24h和48h观繁右侧皮肤反厂表1
红斑和焦痴形成
无红斑
轻微红斑（勉强可）
明显红斑（散在或小块红斑）
中度至重度红
按表1评分
变态反应试验（局部封闭涂皮法）皮肤反应评分皮肤反应
严重红斑（紫红色）至轻微焦制形成水肿形成
无水肿
轻微水肿（勉强可见）
中度水肿（皮肤隆起轮廓清梵
重度水肿（皮肤隆起药
试验对照
最高积分
试验中应设阴性对照组，使用6.3.3.2和6.3.3.3的方法，在诱导接触时仅涂以溶剂作为对照，在激发接触时涂以受试物。对照组动物应和受试物组动物为同使用新的动物种属或品系时，应同时设阳性对照组。6.3.3.6试验方法可靠性的检查
批。在实验室开展变态反应试验初期，或使用已知的能引起轻度/中度致敏的阳性物每隔半年检查一次。局部封闭涂皮试验至少有15%动物出现皮肤过敏反应。阳性物一般采用2，4-二硝基氯苯、肉桂醛、2-巯基苯并噻唑或对氨基苯甲酸乙酯。
6.3.4结果评价
6.3.4.1当受试物组动物出现皮肤反应积分≥2时，判为该动物出现皮肤变态反应阳性，按表2判定受试物的致敏强度。
TTKAONTKAca
GB/T15670.9—2017
致敏率%
81~100
表2致敏强度
注；当致敏率为0时，可判为未见皮肤变态反应。致敏强度
6.3.4.2如激发接触所得结果可疑，应于第一次激发后1周，给予第二次激发，对照组作同步处理或按6.4的方法进行评价。
6.4豚鼠最大值试验（GuineaPigMaximisationTest，GPMT）注：采用完全福氏佐剂（Freundcompleteadjuvant，FCA）皮内注射方法检测致敏的可能性。6.4.1动物数
试验组至少10只，对照组至少5只。如果试验结果难以确定受试物的致敏性，应增加动物数，试验组20只，对照组10只。
6.4.2剂量水平
诱导接触受试物浓度为能引起皮肤轻度到中度刺激反应的最高浓度，激发接触受试物浓度为不能引起皮肤刺激反应的最高浓度，试验浓度水平可以通过少量动物（2只～3只）的预试验获得。6.4.3试验步骤
6.4.3.1诱导接触（第0天）
受试物组：将颈背部去毛区（2cm×4cm）中线两侧划定三个对称点，每点皮内注射0.1mL下述溶液：
第1点：1：1（体积比）FCA/水或生理盐水的混合物；第2点耐受浓度的受试物；
第3点用1：1（体积比）FCA/水或生理盐水配制的受试物，浓度与第2点相同。对照组：注射部位同受试物组，每点皮内注射0.1mL下述溶液：第1点，1：1（体积比)FCA/水或生理盐水的混合物；第2点未稀释的溶剂；
一第3点，用1：1（体积比)FCA/水或生理盐水配制的浓度为500g/L的溶剂。6.4.3.2诱导接触（第7天）
将涂有0.5g（mL）受试物的2cm×4cm滤纸敷贴在上述再次去毛的注射部位，然后用两层纱布，一层玻璃纸覆盖，无刺激胶布封闭固定48h。对无皮肤刺激作用的受试物，可加强致敏，对照组和试验组动物于第二次诱导接触前24h在注射部位涂抹10%十二烷基硫酸钠（SLS)0.5mL。对照组仪用溶剂作诱导处理。
KAONIKAca
6.4.3.3激发接触（第21天）
GB/T15670.9—2017
将豚鼠干部去毛，用涂有0.5g（mL）受试物的2cm×2.cm滤纸片敷贴在去毛区，然后再用两层纱布，一层玻璃纸覆盖，无刺激胶布封闭固定24h。对照组动物作同样处理。如激发接触所得结果不能确定，可在第一次激发接触1周后进行第二次激发接触。对照组作同步处理。6.4.3.4试验方法可靠性的检查
使用已知的能引起轻度/中度致敏的阳性物每隔半年检查一次。豚鼠最大值试验至少有30%动物出现皮肤过敏反应。阳性物一般采用2,4-二硝基氯苯、肉桂醛、2-巯基苯并噻唑或对氨基苯甲酸乙酯。6.4.4观察及结果评价
激发接触结束，除去涂有受试物的滤纸后24h、48h和72h，观察皮肤反应，按表3评分。如需要清除受试残留物可用水或选用不改变皮肤已有反应和不损伤皮肤的溶剂。当受试物组动物皮肤反应积分≥1时，应判为变态反应阳性，按表2对受试物进行致敏强度分级。表3变态反应试验（豚鼠最大值法）皮肤反应评分皮肤反应
未见皮肤反应
散在或小块红斑
中度红斑和融合红斑
重度红斑和水肿
6.5小鼠局部淋巴结分析试验（locallymphnodeassay，LLNA）注：本方法由于使用放射性同位素，试验应严格按照同位素实验室的有关规定进行。6.5.1动物数
试验组和对照组至少各4只。
6.5.2剂量水平
至少设3个试验剂量浓度，1个阴性（溶剂）对照组以及1个阳性对照组。若要收集每个动物的试验数据，则每组至少需要5只小鼠。剂量可选择100%，50%，25%，10%，5%，2.5%，1%或0.5%等。选择的最高浓度应不产生急性毒性和局部刺激性。对照组除了不给予受试物外，动物处理方式应与试验组一致。
溶剂的选择应考虑到最高测试浓度和合适的溶解度。建议使用的溶剂有丙酮/橄榄油（4：1，体积比）、二甲基甲酰胺、甲乙酮、丙二醇、二甲基亚砜，也可使用其他合适的溶剂。6.5.3试验步骤
6.5.3.1受试物测试
试验第1天，称量每只动物的体重。在小鼠每只耳朵背部表面给予25uL的受试物，溶剂或阳性对照物。
第2,3天，重复第1天的步骤。第4、5天不进行任何处理。5
-TTTKAONTKAca
GB/T15670.9—2017
第6天，称量每只动物的体重。通过尾静脉给予试验组、对照组每只小鼠250uL的20uCi(7.4×105Bg）°H-甲基脱氧胸腺嘧啶苷的PBS缓冲液，也可给予250uL的2uCi（7.4×10*Bq）的1251-碘苷和1X10-5mol/L氟尿嘧啶脱氧核昔的PBS缓冲液。5h后，处死动物，以每个试验组为单位，分离每只动物耳部的一对淋巴结，放入PBS缓冲液中，也可以每只动物为单位，分离一对淋巴结。6.5.3.2耳部淋巴结分离
通常采用腹侧解剖的方法分离淋巴结，将小鼠腹部暴露，用70%乙醇湿润腹部和颈部。在胸部和前肢之间剪开，再与此相垂直沿中线剪开，直至下颌部。剥离皮肤暴露外侧颈部静脉，避开中线部位的睡液腺和与之相连的淋巴结。淋巴结位于咀嚼肌远端，颈静脉分枝处。淋巴结为均勾的、半透明状的结节。
6.5.3.3细胞悬液的制备
上述分离的淋巴结组织经研磨，过200目（μm）筛，在PBS缓冲液中充分洗涤2遍，于5%的三氯乙酸（TCA）4℃放置18h。沉淀重悬于1mL的5%三氯乙酸（TCA)中，转移至含有1.0mLH闪烁液的闪烁管内或直接转移至含125I的计数管内。6.5.3.4细胞增生的检测（放射活性的结合测定）通过β闪烁计数，以每分钟的衰变计算\H-甲基脱氧胸腺嘧啶苷的结合率。通过12I的计数管，以每分钟的衰变计算125I-碘苷的结合率。6.5.4实验动物的观察
每天应观察一次实验动物的一般表现、局部的刺激性或系统毒性，认真记录。试验前和处死动物前记录体重。
6.5.5结果评价
结果以刺激指数（stimulationindex，SI)表示。试验以组为单位：
试验以每只动物为单位：
SI_试验组动物放射性结合率
溶剂组放射性结合率
试验组每只动物的DPM均值
溶液组每只动物的DPM均值
其中DPM(disintcgrationspcrminute）为每分钟的衰变率。（1）
··（2)bZxz.net
利用每只动物进行分析、计算SI值的方法，可以评价处理组和溶剂组的每个数据并进行统计学分析。
阳性结果的判断，SI值≥3，具有剂量-反应关系和统计学意义。为了阐明某些研究结果，要考虑不同受试物的特性，包括是否与已知的致敏物结构相似，是否可引起过度皮肤刺激，所见的剂量-反应特点。7试验报告
试验报告至少应包括以下内容：a）试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号：6
-iiKAoNiiKAca
试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期和封样情况；b)
GB/T15670.9—2017
试验开始和结束日期、试验项日负责人、试验单位技术负责人，签发日期；d)
试验摘要
受试物名称、有效成分美国化学文摘登录号（CAS号）（如已知）、代码（如有）、纯度（或含量）、剂型、生产日期（批号）、理化性质、配制所用溶剂和方法：实验动物的种属、品系、级别、数量、体重、性别、来源（供应商名称、实验动物质量合格证号、实验动物生产许可证号），检疫、适应情况，实验动物饲养环境，包括温度、相对湿度、伺料、单笼饲养或群伺、实验动物设施使用许可证号；剂量和组别，包括选择剂量的原则和依据、动物分组方式和每组每种性别动物数；试验条件和方法，包括主要仪器和设备、染毒途径、染毒方案、试验周期、观察指标等；试验结果：以文字描述和表格逐项进行汇总，报告各组动物皮肤反应情况和致敏率等；小鼠局部淋巴结分析试验报告每个剂量组平均或单个的DPM值和刺激指数；可信度的检查，包括最近的可信度试验结果，实验室目前或历史上阳性物和阴性物控制数据：试验结论：给出受试物在试验条件下是否引起变态反应的结论，必要时对有关间题进行讨论原始记录保存情况的说明。
GB/T15670.9-2017
中华人民共和国
国家标准
农药登记毒理学试验方法
第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验GB/T15670.9—2517
中国标准出版社出版发行
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）网址spc.net.cn
总编室：(010)68533533发行中心：(010)51780238读者服务部：（010)68523946
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销
开本880×12301/16印张0.75字数18千字2017年7月第一次印刷
2017年7月第一版
书号：155066·1-53764定价16.00元告由本社发行中心调换
如有印装差错
侵权必究
版权专有
举报电话：（010)68510107
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。