GB∕T 15670.14-2017 农药登记毒理学试验方法 第14部分：细菌回复突变试验 GB∕T15670.14-2017 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

ICS65.100
中华人民共和国国家标准
GB/T15670.14—2017
部分代替GB/T15670—1995
农药登记毒理学试验方法
第14部分：细菌回复突变试验
Toxicological test methods for pesticides registration-Part 14:Bacterial reverse mutation test2017-07-12发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2018-02-01实施
中华人民共
国家标准
农药登记毒理学试验方法
第14部分：细菌回复突变试验
GB/T15670.14—2017
中国标准出版社出版发行
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）网址spc.net.cn
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2017年7月第一版 2017年7月第一次印刷*
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GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则；
金霍恩氏法；
第2部分：急性经口毒性试验
序贯法；
第3部分：急性经口毒性试验
第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；
第6部分：急性吸入毒性试验；
第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验；第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验；第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验；第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验；第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸入染毒（28天）毒性试验；第13部分：亚慢性毒性试验；
第14部分：细菌回复突变试验；第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验；第18部分：啮齿类动物显性致死试验；第19部分：体外哺乳动物细胞染色休畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验；第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验；GB/T15670.14—2017
第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；第23部分：致畸试验；
第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验；
第27部分：致癌试验；
第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验。本部分为GB/T15670的第14部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分部分代替GB/T15670—1995《农药登记毒理学试验方法》。本部分与GB/T15670—1995的鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验部分相比主要变化如下：修改和调整了标准的总体结构和编排格式；增加了一些章节内容（见第1章、第2章、第4章、5.6、5.7、6.3、7.3.2、7.3.3和第9章）；修改了部分试剂配制的内容（见5.3，1995年版的14.3.3)：修改了对试验菌株要求的内容（见6.1，1995年版的14.3.1)；1
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修改了剂量和分组的内容（见7.2，1995年版的14.3.4）；修改「结果判定的内容（见8.2,1995年版的14.3.8）。本部分由中华人民共和国农业部提出并归口。本部分起草单位：农业部农药检定所。本部分主要起草人：肖杭、环飞、张丽英、陶传江。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T15670-1995。
-TKAONIKAca
1范围
农药登记毒理学试验方法
第14部分：细菌回复突变试验
GB/T15670的本部分规定了细菌回复突变试验的基本原则、方法和要求本部分适用于为农药登记而进行的细菌回复突变试验。术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。2.1
回复突变试验
reversemutationtest
GB/T15670.14—2017
利用一组鼠伤寒沙门氏菌和/或大肠杆菌检测引起细菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的需要某种氨基酸的菌株（分别为组氨酸或色氨酸）成为不需要外源性供应氨基酸的菌株的突变，即是由营养缺陷型回变到野生型，
碱基置换型致突变物basepair suhstitutionmutagens引起DNA分子中一个或多个碱基对置换的物质。在回复突变试验，此改变可能发生在细菌基因组的原突变部位或另一个部位。2.3
移码型致突变物frameshiftmutagens引起DNA分子增加或丢失一个或多个碱基对的物质。3试验目的
检测受试物的诱变性，预测其遗传危害和潜在致癌作用的可能性。4试验概述
细菌回复突变试验利用鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌来检测点突变，涉及DNA的一个或几个碱基对的置换、插人或缺失。原埋是通过观察试验菌株在缺乏所需要氨基酸的培养基上的生长情况，检测试验菌株是否恢复合成必需氨基酸的能力，评价受试物诱发突变的能力。5培养基和试剂
注：培养基成分或试剂至少应是化学纯，无诱变性。避免重复高温处理，选择适当保存温度和期限，如肉汤保存于4℃不超过6个月，其他详见下述各培养基及落液说明1
KANKAca
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营养肉汤培养基
牛肉浸膏
氯化钠
磷酸氢二钾（KHPO·3H,O)
加蒸馏水至
1000mL
加热溶解，调节pH至7.4，分装后0.103MPa，20min灭菌，保存期不超过6个月。营养肉汤琼脂培养基
琼脂粉
加营养肉汤培养基至
加热溶解，调节pH至.40.103MPa，20min灭菌。底层培养基（即最低营养培养基）5.3
Vogel-Bonner(V-B）培养基
柠檬酸（C.HO·H.O
磷酸氢
（KHPO
磷酸氢铵钠（NaNH.H
硫酸（MgSO.·7H0)
加蒸馏水
逐个将化学物在少量蒸增水中单独溶解后硫酸镁水溶液在最后缓慢加人，加蒸馅水至200mL。0.103MPa20min灭菌，4
5.3.220%葡萄糖溶液
葡萄糖
C保存备用
加蒸馏水至700ml0.055MPa，20min灭菌。5.3.31.5%底层琼脂培养基
琼脂粉
加蒸馏水至
V-B培养基
20%葡萄糖溶液
首先将前两种成分于0.103MPa下高压灭菌20min后，再加入后两种成分，充分混勾倒底层平板。按每皿25mL（相对于90IⅡ平血）制备平板，冷凝固化后倒置于37℃培养箱中24h，备用。5.4顶层培养基
5.4.1顶层琼脂
琼脂粉
氯化钠
加蒸馏水至
TIKAONIKAca
0.103MPa，20min高压火菌。
0.5mmol/L组氨酸-生物素溶液
D-生物素（相对分子质量244）
L-组氨酸（相对分子质量155）
【或L-盐酸组氨酸（相对分子质量192）加蒸馏水至100mL，贮于4℃冰箱中。5.4.3顶层培养基制备
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加热融化顶层琼脂，临用时每100mL顶层琼脂中加10ml.0.5mmol/L组氨酸-生物素溶液（大肠杆菌则需配制0.5mmol/L色氨酸-组氨酸-生物素溶液），分装在三角烧瓶中，0.103MPa，20min灭菌。用时融化分装小试管，每管2mL，在45C水浴中保温。5.5S9辅助因子（混合液试剂）的配制5.5.1盐溶液［1.65mol/L氯化钾（KCI）+0.4mol/L氯化镁（MgCl2）氯化钾（KCI)
氯化镁（MgClz·6H,0）
蒸馏水
0.103MPa，20min高压灭菌或滤菌。5.5.20.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）磷酸氢二钠（Na2HPO)(14.2g/500mL）磷酸二氢钠（NaH2PO·HzO)（13.8g/500mL)0.103MPa，20min高压灭菌或滤菌。5.5.3辅酶-Ⅱ（氧化型）溶液
准确称取辅酶-Il，用无菌蒸馏水溶解配制成0.025mol/L溶液，低温保存（一20℃以下）。5.5.4葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液
称取葡萄糖-6-磷酸钠盐，用无菌蒸馏水溶解配制成0.05mol/L，低温保存（一20℃以下）。610%S9混合液配制
每10mL由以下成分组成，临用时配制：磷酸盐缓冲液(0.2mol/L，pH7.4)MgCl-KCI盐溶液
葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液（0.05mol/L）辅酶-Ⅱ溶液（0.025mol/L）
无菌蒸馏水
混匀，置冰浴中待用。
5.7活化系统（大鼠肝S9)的诱导和制备6.0mL
选健康雄性成年SD大鼠或Wistar大鼠，体重200g左右。将多氯联苯（Aroclor1254或国产PCB3
-KAoNiKAca
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五氯）溶于卡米油中，按500mg/kg体重一次腹腔注射，5d后处死动物，处死前12h禁食，但可自由饮水。
苯巴比妥钠和β-茶黄酮结合也可做为诱导剂，健康雄性大鼠体重200g左右，经口或腹腔注射80mg/kg体重苯巴比要钠和80mg/kg体重β-萘黄酮，连续3d。处死前16h停止饮食，但可自由饮水。由于化学物质经腹腔注射，容易引起肝脏形成外膜，不易剥离，推荐使用经口灌胃的方式，处死动物后取出肝脏称重，用新鲜冰浴的0.15mol/L氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次，以去除抑制微粒体酶活性的血红蛋白。每克肝（湿重）加0.15mol/L氟化钾溶液3mL，连同烧杯移入冰浴中，用消毒剪刀剪碎肝脏，在玻璃匀浆器（低于4000r/min，往复1min～2min）或组织匀浆器（20000r/min1min)中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。将制成的肝勺浆在低温（o℃～4℃)高速离心机，以9000g离心10min，吸出上清液为S9组分，分装于无菌冷冻管或安瓶中，每安瓶2mL左右，最好用液氮或干冰速冻后置一80C低温保存。上述全部操作均在冰水中和无菌条件下进行。制备肝S9所用一于术器械、器血等，均经灭菌消毒。S9制备后，其活力需经诊断性诱变剂进行鉴定。S9制成后，经无菌检查，蛋白含量测定（Lowry法），每毫升蛋白含量应不超过40mg，因过量蛋白将会抑制回复突变率，开经间接致癌物（诱变剂）鉴定其生物活性合格后贮存于深低温或冰冻干燥，保存期不超过1年
5.8特殊试剂和培养基的配制
氨卡青霉素溶液（8
10mL，无菌配制，保存于4c冰箱0.1%结晶紫溶液标取结品紫10
吉青特素
6mg:加人0.02ma/L氢氧化钠溶液加10mL无菌水。
四环素溶容液（8mL称取四环素40mg，加入c02mol/盐酸溶液5mL保存于4℃冰箱，用于四环素抗性试验和氨卡南霉素四环素平板。5.8.4L-组氨酸溶液和0.5mmol/L生物素浴液称取L组氮酸4043mg和D生物素12.2mg，分别溶于100mL蒸馏水，0.103MPa.20mm灭菌保存手4C冰箱5.8.5氨芊青霉素平板用作TA97TA98TA160菌株的主平板）和氨業青霍素-四环素平板（用作TA102菌株的主平板），每1000mL由以下成分组成：底层培养基
组氨酸水溶液
0.5mmol/L生物素
0.8%氨苄青霉素溶液
0.8%四环素溶液
四环素仅在使用对四环素有抗性的1A102时加入，以上成分均已分别火菌或无菌制备。5.8.6组氨酸-生物素平板（组氨酸试验用），每1000mL由以下成分组成：底层培养基
组氨酸水溶液
0.5mmol1/L生物素
以上成分均已分别灭菌。
5.8.7二甲基亚矾（DMS0）：0.103MPa，20min灭菌。4
-rrKAoNiKAca
6菌株及其鉴定与保存
6.1试验菌株
GB/T 15670.14—2017
6.1.1推荐使用鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102作为四株标准测试菌株。TA97和TA98可以检测各种移码型致突变物；TA100可检测碱基置换型致突变物，TA102能检测出其他测试菌株不能检出或极少检出的某些诱变剂，如甲醛、各种过氧化氢化合物和丝裂霉素C等交联剂。一般用来测试受试物诱变性时，应通过上述四个菌株的检测。必要时可增加TA1535、TA1537、TA97a、大肠杆菌WP2uvrA或大肠杆菌WP2uvrA(PKM101)任一菌株。试验菌株的基因型和检测类型见附录A中A.1。
6.1.2也可采用下列的菌株组合：鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98.TA100、TA102和TA1535，其中TA97可用TA97a或TA1587替换TA102可用大肠杆菌WPZuVIA（PKM101)或WP2uVrA替换。6.2菌株的鉴定
6.2.1应进行菌株鉴定的情况
应符合细菌回复突变试验的要求，见A2突变型菌株的某些特性易丢失或变异，遇到下菌株特性
列情况应鉴定菌株的基因型
a）在收到培养菌株后；
当制备
套新的冷冻保存株或冷冻干
当每血自发回变数不有正常范围时当对标准诱变剂丧失敏感性时；e）初次投人使用前。
6.2.2增菌培养
菌株时
在营养肉汤培养基巾接种购存菌株培养物：手振荡（100次/mim）墙养101或静置培养16h备用。
6.2.3组氨酸缺陷型和色氨酸缺陷型的鉴定6.2.3.1加热融化底层磨养基两瓶（一瓶不加组氨酸，一瓶加组氨酸），不加组氨酸者每100mL培养基中加0.5mmol/LD-生物素0.6mL：加组氨酸者每100mL培养基中加人L-组氨酸（每100mL中含404.3mg)1mL和0.5mmol/LD生物素0.6mL，冷却至50C左右，各倒两个平血。6.2.3.2接种：取有组氨酸和无组氨酸增养基各一，按菌株号顺序各取一白金耳菌液划线（直线），接种在培养基表面，37培养48h。
6.2.3.3结果：所有菌株（TA97、TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535、TA1537)在有组氨酸培养基平血表面各长出一条菌膜，无组氨酸培养基上除自发回变菌落外无菌膜，说明受试菌株确为组氨酸缺陷型。
色氨酸缺陷型的鉴定：在培养基上，倒上含有大肠杆菌WP2uvrA、大肠杆菌WP2uvrA6.2.3.4
(PKM101)的顶层培养基，再加极微量的结晶-L色氨酸，置37培养12h～24h后观察结果。在加色氨酸的区域生长，可见一白色圆形菌苔，表明其对色氨酸的依赖。6.2.4脂多糖屏障缺陷型的鉴定
6.2.4.1加热营养肉汤琼脂培养基。5
iKAoNiKAca
GB/T15670.14—2017
6.2.4.2接种：取菌液0.1mL移人平Ⅲ，迅速将营养肉汤琼脂培养基（50℃）适量倒入平血，混勾，平放凝固。将无菌滤纸一片放人已凝固的培养基平血中央，用移液器在滤纸片上滴加0.1%结晶紫溶液10μL，37℃培养24h，每菌做个平Ⅲ。6.2.4.3结果：阳性者在滤纸周围出现一个透明的抑制带，说明存在rfa（深粗型）突变。这种变化引起某些大分子物质进人细菌体内并抑制其生长。TA97、TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535和TA1537均有抑制带，野生型鼠伤寒沙门氏菌没有抑制带。6.2.5R因子的鉴定
6.2.5.1加热营养肉汤琼脂培养基，冷却至50℃左右，适量倒人平皿中，平放凝固，用移液器吸0.8%氨苄青霉素10L，在凝固的培养基表面沿中线涂成一条带，待氨青霉素溶液干后，用接种环与氨苄青霉素带相交叉划线接种要鉴定的菌株，并且接种一个不具有R因子的菌株作为氨芋青霉素抗性的对照（一个平血可同时鉴定几个菌株），37℃培养24h。6.2.5.2结果：菌株TA97、TA97a.TA98、TA100、TA102和大肠杆菌WP2uvrA（PKM101)经过24h培养，在氨芊青霉素带的周围依然生长不受抑制，即有抗氨青霉素效应，证明它们带有R因子。6.2.6四环素抗性的鉴定
6.2.6.1用移液器各吸5μL~10uL0.8%四环素溶液和0.8%氨芋青霉素溶液，在营养肉汤琼脂培养基平血表面依中线涂成一条带，待四环素和氨苄青霉素干后，用接种环与四环素和氨苄青霉素带相交叉划线接种TA102和一种有R因子的菌株（作四环素抗性的对照），37℃培养24h。6.2.6.2结果：TA102菌株生长不受抑制，对照菌株有一段生长抑制区，表明TA102菌株有抗四环系效应，其他菌株均无四环素抗性。6.2.7uvrB修复缺陷型的鉴定
6.2.7.1在营养肉汤琼脂培养基表面用接种环划线接种需要的菌株。6.2.7.2接种后的平皿一半用黑纸覆盖，在距15W紫外线灭菌灯33cm处照射8s37℃培养24h。6.2.7.3结果：对紫外线敏感的菌株（TA97、TA97a、TA98、TA100、TA1535、TA1537和WP2uvrA）仅在没有照射的一半生长，具有野生型切除修复酶的菌株TA102仍能生长。6.2.8自发回变率的测定
6.2.8.1准备底层培养基平皿。
6.2.8.2融化项层培养基，每管2mL，在45℃水浴中保温。6.2.8.3在每管顶层培养基中分别加入待鉴定的测试菌株的菌液0.1mL，每株两份，轻轻摇匀，迅速将此试管中的内容物倾入已固化的底层培养平皿中，转动平皿，使顶层培养基均勾分布，平放固化，37℃培养48h计数菌落数。
6.2.8.4结果：每一株的自发回变率应落在正常范围内。6.3菌株保存
鉴定合格的菌种应保存在深低温（如一80℃）或加入9%色谱级二甲基亚砜作为冷冻保护剂，液氮条件下（一196℃），或者冷冻干燥制成干粉，4℃保存。除液氮条件外，一般不超过两年，主平板贮存在4℃，2个月后丢弃，TA102主平板2周应该丢充。6
7试验方法
7.1受试物配制
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受试物的溶剂首选无菌双蒸水，不溶于水的或水溶性低的受试物，首选二甲基亚砜（每平血加入二甲基亚砜的量不得超过0.4mL)，选用其他溶剂须说明理由。7.2剂量与分组
7.2.1剂量设计原则
对可溶性无细菌毒性的受试物，推荐的最高试验剂量是5mg/血或5μL/皿；否则，受试物最高剂量应为细菌毒性的剂量或出现沉提，沉淀不应干扰菌计数。最低剂量可考虑为0.1ug/皿。评价含有潜在致突变杂质的受试物时，试验剂量可高于5mg/Ⅲ或5μL/删，每一受试物至少设5个剂量组，可按0.5ug/血～5000/血剂量设定，也可根据预试验结果按等比组距设定需要的浓度范围。7.2.2对照组设定
7.2.2.1每次试验都应包括同时进行的有或无代谢活化的菌株特异性阳性对照和阴性（溶剂）对照组。阳性对照应选择适当的剂量，以证实每次试验的有效性7.2.2.2
阳性对照物根据菌株的类型选择·见附录B试验应包括阴性（溶制对照组阳性对照组的处理方法除无受试物处其他处理与剂量组相同。7.2.2.3
试验也应包活空自对照组，除非历更资料证实所选择的浴剂无毒性或无效突变作用。7.3试验方法
注：包括平板掺人法、预培养平板修人法及点试法
7.3.1平板掺入法
增菌培养将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内7℃振荡00次/min）培养10h至对数增长期，每草耳不少手交1本活陷数，培养瓶可用黑纸包裹，以防光线照射细菌。底层培养基平血，每个剂量加S9及不加S9均做3皿。融化顶层培养基分装于无菌小试管，每管2mL，在45℃水浴中保温在保温的项层培养基中依次加入测试菌株新鲜增菌液0.1mL，然后加0.1mL受试物和0.5mL灭菌缓冲液（需活化时则加人10%59混合液0.5mL），再混匀，迅速倾人底层培养基上，转动平血使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化，37增养48h观察结果。7.3.2预培养平板掺入法
预培养对某些受试物可取得较好效果，因此可根据情况确定是否进行预培养。在加入顶层琼脂前，先进行以下预培养步骤：在试验中，将受试物0.1mL（需活化时另加人10%S9混合液0.5mL）和菌液0.1mL，在37℃培养20min，或在30C中培养30min，然后再加2mL顶层琼脂，其他同上述平板掺人法。
7.3.3点试法
增菌培养：将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内，37℃振荡（100次/min）培养10h至对数增长期，每毫升不少于1X10°个活菌数，培养瓶可用黑纸包裹，以防光线照射细菌。底层培养基平皿，每个剂量加S9及不加S9均做3血。融化顶层培养基分装于无菌小试管，每管2mL，在45C水浴中保温7
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在水浴中保温的顶层培养基中加入测试菌株增菌液0.1mL（需活化时另加入10%S9混合液0.5mL），混勾，迅速倾入底层培养基上，转动平皿，使顶层培养基在底层上均匀分布。平放固化后取无菌滤纸圆片（直径6mm），小心放在已固化的顶层培养基的适当位置上，用移液器取适量受试物（如10μL)点在纸片上，或将少量固体受试物结晶加到纸片或琼脂表面，37℃培养48h观察结果。8试验结果和评价
8.1试验结果
应报告受试物各剂量组、阳性对照组、阴性（溶剂）对照组、空白对照组的各个平板回变菌落数，均数及标准差。
8.2试验结果的评价
8.2.1以直接计数培养基上回变菌落数的多少而定。如在背景生长良好条件下，测试菌株TA1535、工A1537及大肠杆菌的受试物组回变菌落数等于或大于阴性对照组的平均数值的3倍，其他测试菌株的受试物组回变菌落数等于或大于2倍阴性对照组回变菌落数，并有剂量-反应关系，可判定为阳性结果；若某一测试点菌落数增加是可重复的并有统计学意义的结果，也可判定为该受试物诱变试验阳性。8.2.2阳性结果不要求证实，可疑的结果应进行证实试验，阴性结果需要进行证实试验。如果认为阴性结果不需要进行证实试验，应提供依据。进行证实试验时应考虑改变研究参数，如剂量间距、试验方法（平板掺人法或预培养平板掺入法)和代谢活化条件等。8.2.3如在受试物点样纸片周围长出较密集的回变菌落，与空白对照相比有明显区别者，可初步判定该受试物诱变试验阳性，但应该用掺人法试验来确证。8.2.4细菌回复突变试验的阳性结果表明受试物对鼠伤寒沙门氏菌和（或）大肠杆菌的基因组诱发了点突变。阴性结果表明，在试验条件下，受试物对测试菌株不诱发基因突变。9试验报告
试验报告至少应包括以下内容：试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号；a）
b）试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期和封样情况；试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人，签发日期；e
试验摘要；
受试物名称、有效成分美国化学文摘登录号（CAS号）（如已知）、代码（如有）、纯度（或含量）、e）
剂型、生产日期（批号）、理化性质、配制所用溶剂和方法；选择的试验菌株名称、菌株特性；g）剂量和组别，包括选择剂量的原则或依据、剂量和组别；试验条件和方法，包括主要仪器设备、细菌染毒途径、染毒方案，代谢活化系统及所用诱导剂、h）
试验方法、操作步骤、阳性对照物名称等；试验结果：以文字描述和表格逐项进行汇总，样品对测试菌株的毒性、平血上是否有沉淀、各剂i
量组回变菌落数的均数和标准差、同时进行的阴性和阳性对照组结果，同一受试物应包括活化和非活化的试验结果，剂量单位为/血，特殊例外；j）试验结论：给出受试物在试验条件下是否有致突变作用的结论，必要时对有关间题进行讨论；k）原始记录保存情况的说明。
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