GB∕T 15670.17-2017
基本信息
标准号： GB∕T 15670.17-2017
中文名称：农药登记毒理学试验方法 第17部分：哺乳动物精原细胞 精母细胞染色体畸变试验
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 农药 登记 试验 方法 哺乳动物 精原细胞 精母细胞 染色体 畸变
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标准简介
GB∕T 15670.17-2017 农药登记毒理学试验方法 第17部分：哺乳动物精原细胞 精母细胞染色体畸变试验
GB∕T15670.17-2017
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标准内容
ICS65.100
中华人民共和国国家标准
GB/T15670.17—2017
部分代替GB/T15670—1995
农药登记毒理学试验方法
第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验
Toxicological test methods for pesticides registration-Part 17: Mammalianspermatogonial/spermatocyte chromosome aberration test2017-07-12发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2018-02-01实施
GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则，
霍恩氏法；
第2部分：急性经口毒性试验
第3部分：急性经口毒性试验序贯法；第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；
第6部分：急性吸人毒性试验；
第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验；第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验；第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验；第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验；第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸染毒（28天）毒性试验；第13部分：业慢性毒性试验；
第14部分：细菌回复突变试验；第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验；第18部分：啮齿类动物显性致死试验；第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验；第21部分：休内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验；GB/T15670.17—2017
第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；第23部分：致畸试验；
第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验；
第27部分：致癌试验；
第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验。本部分为GB/T15670的第17部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分部分代替GB/T156701995《农药登记毒理学试验方法》本部分与GB/T15670—1995的小鼠睾丸精母细胞染色体畸变试验部分相比主要变化如下：修改了本部分的试验名称；
修改和调整了标准的总体结构和编排格式；增加了部分章节内容（见第1章、第2章、第3章、第4章、第5章、7.1和第9章）；修改了动物要求（见7.2，1995年版的14.6.2）：I
GB/T15670.17—2017
修改了剂量及分组要求（见7.3，1995年版的14.6.3）；修改了染毒方法（见7.4.1，1995年版的14.6.4）；修改了操作步骤（见7.4，1995年版的14.6.5），本部分由中华人民共和国农业部提出并归口。本部分起草单位：农业部农药检定所。本部分主要起草人李宁、张丽英、陶传江。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T15670—1995。
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1范围
农药登记毒理学试验方法
GB/T 15670.17—2017
第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验
GB/T15670的本部分规定了哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验的基本原则、方法和要求。
本部分适用于为农药登记而进行的哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB14925实验动物环境及设施
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
染色单体型畸变chromatid-typeaberration染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。3.2
Echromosome-typeaberration
染色体型畸变
染色体结构损伤，表现为在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。3.3
裂隙gap
染色体和染色单体的损伤长度小于一个染色单体的宽度，为染色单体的最小的错误排列。3.4
多倍体polyploid
哺乳动物细胞染色体数目正常为二倍体，在化学诱变剂的作用下染色体数目成倍地增加，如三倍体、四倍体等。
染色体结构畸变chromosomalstructureaherration通过显微镜观察到的细胞分裂中期相的结构改变，如染色体缺失，染色体互换和内交换等。4试验目的
检测受试物引起哺乳动物生殖细胞染色体畸变的效应，以评价受试物引起生殖细胞遗传突变的可1
-TKAONrKAca
GB/T15670.17—2017
能性。
5试验概述
染色体是细胞核中具有特殊结构和遗传功能的小体，当化学物质作用于细胞周期G1期和S期时，诱发染色体型畸变，而作用于G2期时则诱发染色单体型畸变。以适当的染毒途径给动物染毒，并在染毒后适当的时间处死，在动物处死前，动物用中期相阻断剂（如秋水仙素）处理，制备睾丸细胞染色体并染色，对中期相细胞进行染色体畸变分析。6仪器与试剂
6.1仪器
实验室常用设
低渗液
1%柠檬酸三钠：取直名柠檬酸二钠（分析纯）加蒸罐水至1000.4%氯化钟取0.4家化钾（分析纯）加蒸酒水至100ml6.360%冰乙酸
取60ml冰乙酸（分析纯）加蒸馏水6.4固定液
冰酸=3?1.新鲜配制
6.5姬姆萨（Giemsa）染液
姬姆萨（Giemsa）染料
育新鲜配制
配制：将姬姆萨Giemsa染料和少量甲醇置于研钵单仔细研磨，再加入甲醇到375mL，待完全溶解后，再加入125mL代油，混合均勺。置37℃恒温箱中保温48h。保温期间振摇数次，促使染料充分溶解。取出过滤，两周后使用
磷酸盐缓冲液（pH6.8）
1/15mol/L磷酸氢二钠溶液：称取NazHPO9.47g溶于1000mL蒸馏水中。1/15mol/L磷酸二氢钾溶液：称取KH,PO9.cC7g溶于100CmL蒸馏水中。将磷酸氢二钠溶液50mL与磷酸二氢钾溶液50mL混合，用pH计测定并调节至pH6.8。6.7姬姆萨（Giemsa）应用液
取1份姬姆萨（Giemsa)染液与9份磷酸盐缓冲液（pH6.8)混合而成，临用时现配。2
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7试验方法
7.1受试物配制
GB/T 15670.17—2017
受试物应新鲜配制，固体受试物应溶于或悬浮于适当的溶剂或介质中，液体受试物可直接使用或稀释后使用。溶剂和介质在所用剂量下不应产生毒性，也不与受试物发生反应。通常首选溶剂为水，不溶于水的受试物可使用食用油（如橄榄油、玉米油等），不溶于水或油的受试物可使用羧甲基纤维素钠、淀粉等配成混悬液。
实验动物
首选健康成年雄性小鼠，周龄为7周～12周，所用动物起始体重不能超过平均体重的土20%，动物应随机分组，每组至少包括5只可用于分析的动物。如试验设有几个采样的时间点，则要求每个采样时间点都有5只能用于分析的动物，动物试验前适应环境3d~5d。实验动物饲养环境应符合GB14925的有关规定。
7.3剂量及分组
7.3.1如果没有合适的参考资料应在间实验室利用同 品系，性别和染毒方式进行顶试验来确定剂量范围。
如果有毒性，正式试验的第
全来样时问点应
个剂量组高剂量组原则上为动物出现严重中毒反应的剂量，即最大耐受剂量低剂量组或不表现出毒性，在第一不采样点可仅设高利量。但对较低的无毒剂量水平就有生物活性的受试物如减素），量设计可导循真他标准。高剂量也可选急性经口毒性Ds。的50%～80%作为高剂量，按等比级数2间下设置中，低剂量7.3.2限量试验如果单次架毒剂量或同一天2次染毒剂量为2000mg/kg体重，没有产生可观察到的毒性效应，并且根据结构等相关资科推断其无遗传每性，则可不必进在个剂量水平的完整试验，可以2000mg/kg体重剂量进行限量试验：如果大群预期暴露水平较高，应以6000mg/kg休体重剂量进行限量试验或设计更高的剂量
7.3.3每次试验均应设置相应的
其他处理与受试物组
应另设空白对照
月性对照组除不使用受试物外，如果有资料表明所使用的溶剂或介质无致突变作用，可不设空白对照，否则阳性对照组应预期在精原细胞和精母细胞观察到高于背景的染色体畸变的增加。阳性对照组的染毒途径可不同于受试物的染毒途径，可仅在一个时间点采样，如可能，最好选用与受试物化学分类相关的阳性对照物，常用的阳性对照物有环磷酰胺（参考剂量为40mg/kg休重）和丝裂霉素C(参考剂量为2mg/kg体重2.5mg/kg体重），
7.4操作步骤
7.4.1实验动物的处理和采样时间点染毒途径可选用经口灌胃或腹腔注射，一般为一次染毒或两次染毒（间隔24h）给予受试物。受试物溶液一次给予的最大容量不应超过0.2mL/10g体重。如果给予的剂量较大，也可将剂量在一天内分两次给予。
精原细胞：高剂量组应于末次给予受试物后的第21h和48h处死动物采样，中、低剂量组均在末次给予受试物后24h处死动物采样。精母细胞：于第一次染毒后12d～14d采样。动物处死前3h~6h腹腔注射秋水仙素4mg/kg体重～6mg/kg体重（注射体积：0.1mL/10g体3
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GB/T15670.17-—2017
重~0.2mL/10g体重）。秋水仙素宜当天新鲜配制。7.4.2标本制备
7.4.2.1取材
用颈椎脱白法处死小鼠，打开腹腔，取出两侧學丸，去净脂肪，于低渗液中洗去毛和血污，放人盛有适量1%柠像酸三钠或0.4%氯化钾溶液的小平中。7.4.2.2低渗
7.4.2.2.1精原细胞
以眼科镀撕开被膜，轻轻地分离曲细精管，加人低渗液10mL，用滴管吹打曲细精管，静置2min，使曲细精管下沉，将含有许多精子和减数分裂精母细胞的上清液仔细吸去。留下的曲细精管，重新用10mL低渗液处理10min
7.4.2.2.2精母细胞
以眼科镊撕开被膜，轻轻地分离曲细精管，加人低渗液10mL，用滴管吹打曲细精管，室温下静置一定时间，一般20min。
7.4.2.3固定
仔细吸尽低渗液，加固定液10mL固定。第一次不超过15min，倒掉固定液后，再加入新的固定液固定20min以上，如在冰箱（0℃~4℃）过夜固定更好。7.4.2.4离心
吸尽固定液，加60%冰乙酸1mL～2mL，待大部分曲细精管软化完后，立即加人倍量的固定液，打勾、移人离心管，以1000r/min离心10min。7.4.2.5滴片
弃去大部分上清液，留下约0.5mL~1.0mL，充分打勾制成细胞混悬液，将细胞混悬液均匀地滴于冰水玻片上。每个样本制得2张～3张。空气干燥或微热烘干。7.4.2.6染色
用姬姆萨（Gicmsa）应用液（pH6.8）染色约20min（根据室温不同染色时间有所不同），用蒸馏水冲洗晾干。
7.4.3阅片
7.4.3.1编号
所有玻片，包括阳性对照和阴性对照，在镜检前均要分别编号。7.4.3.2镜检
在低倍镜下按顺序寻找背景清晰、分散良好、染色体收缩适中的中期分裂相，然后在油镜下进行分析。
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7.4.3.3确定有丝分裂指数
记数1000个细胞中的有丝分裂数（仅限于精原细胞）。7.4.3.4染色体分析
GB/T15670.17-2017
每个动物至少记数100个中期相细胞，每个剂量组至少观察500个中期分裂相。当观察到的畸变细胞数量较多时，可以减少观察的细胞数，由于固定方法常导致染色体的丢失，所以计数的细胞应含染色体数为2n土2的中期相细胞
7.4.3.5精原细胞
7.4.3.5.1染色体数目改变
正常精原细胞中期分裂相中常见到多倍体，阐明多倍体的意义时应慎重。7.4.3.5.2染色体结构畸变
染色体的结构畸变中，包括断裂、断片、微小体、无着丝点环、环状染色体、双或多着丝点染色体、单体互换等。
7.4.3.6精母细胞
除了可见到裂隙、断片、微小体外，还应分析相互易位、X-Y和常染色体的单价体。相互易位：相互易位涉及非同源染色体间末端断片的交换。它需要二次断裂和修复。有常染色体间的易位和性染色体与常染色体间的易位。常染色体易位时能产生环状的多价体，或链状多价体。如一次易位可形成环状四价体、链状四价休、三价体加上一个单价休（eⅢ十I），若二次、三次或四次易位，则可观察到六价体，八价体或十价体。性染色体的易位，可以有X染色体或Y染色体与常染色体易位。在对照成年动物中自发易位率极低，低于0.01%。老年动物可稍有增加。X-Y和常染色体的单价体：办称早熟分离。对照动物X-Y单价体较常见，约有0～10%。因X和Y染色体是长臂的远端，非同源的片段相接。X、Y的分离常可引起不育。常染色体的单价体是由于不联会（同源片段间配对合子的缺失），或联会消失（由于交叉失败而分离）而造成，它们在对照组动物中较少见，因为交叉在双线期形成，正常配对的联会一直到中期I末。常发生于最小一对常染色体中。8试验结果和评价
对每个动物记录含染色体结构畸变的细胞数和每个细胞的染色体畸变数，并列表给出各组不同类型的染色休结构畸变数目和频率。试验组与阴性对照组的断片、易位、畸变细胞率、常染色体单价体、性染色体单价体等分别按Kastenbaum和Bowman所述方法或二项分布等方法进行统计处理，染色体裂隙应分别记录和报告，一般不计人畸变率。剂量组染色体畸变率或畸变细胞率与阴性对照组相比，统计学上有显著性差异，并有明显的剂量反应关系或在一个剂量组中出现染色体畸变率或畸变细胞率明显增高时即可认为染色体畸变阳性。若统计学上差异有显著性，但无剂量-反应关系，则需进行重复试验，结果可重复者定为阳性。9试验报告
试验报告至少应包括以下内容：5
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GB/T 15670.17—2017
试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号；试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期和封样情况；b)免费标准下载网bzxz
试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人，签发日期；试验摘要；
受试物名称、有效成分美国化学文摘登录号（CAS号）（如已知）、代码（如有）、纯度（或含量）e)
剂型、生产日期（批号）、理化性质、配制所用溶剂和方法；实验动物种属、品系、级别、数量、体重、性别、来源（供应商名称、实验动物质量合格证号、实验D
动物生产许可证号），检疫、适应情况，实验动物饲养环境，包括温度、相对湿度、饲料、单笼伺养或群饲、实验动物设施使用许可证号；g）
试验条件和方法，剂量分组，剂量选择依据，染毒途径和方式，受试物配制过程，采样时间点，中期阻断剂的名称，浓度及处理时间，标本制备方法，每只动物观察的细胞数，统计方法和判定标准；
h）试验结果：每只动物细胞染色体的瞻变类型和畸变细胞数，每组动物细胞染色体畸变类型和数量及有畸变的细胞数，剂量-反应关系，阴性对照的历史资料及范围，以列表方式报告受试物组、阴性对照组和阳性对照组的染色休畸变类型、数量和畸变细胞率，并写明结果的统计方法；1)
试验结论：根据试验结果，对受试物在试验条件下是否有致突变作用作出结论，必要时对有关问题进行讨论；
原始记录保存情况的说明
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中华人民共和国
国家标准
农药登记毒理学试验方法
第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验
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中国标准出版社出版发行
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）网址spc.net.cn
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中国标准出版社秦皇岛印刷厂印剧各地新华书店经销
开本880×12301/16印张0.75字数16千字2017年7月第一版
2017年7月第一次印刷
书号：155066·1-54020定价
由本社发行中心调换
如有印装差错
版权专有
侵权必究
举报电话：（010)68510107
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中华人民共和国国家标准
GB/T15670.17—2017
部分代替GB/T15670—1995
农药登记毒理学试验方法
第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验
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中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2018-02-01实施
GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则，
霍恩氏法；
第2部分：急性经口毒性试验
第3部分：急性经口毒性试验序贯法；第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；
第6部分：急性吸人毒性试验；
第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验；第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验；第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验；第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验；第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸染毒（28天）毒性试验；第13部分：业慢性毒性试验；
第14部分：细菌回复突变试验；第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验；第18部分：啮齿类动物显性致死试验；第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验；第21部分：休内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验；GB/T15670.17—2017
第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；第23部分：致畸试验；
第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验；
第27部分：致癌试验；
第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验。本部分为GB/T15670的第17部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分部分代替GB/T156701995《农药登记毒理学试验方法》本部分与GB/T15670—1995的小鼠睾丸精母细胞染色体畸变试验部分相比主要变化如下：修改了本部分的试验名称；
修改和调整了标准的总体结构和编排格式；增加了部分章节内容（见第1章、第2章、第3章、第4章、第5章、7.1和第9章）；修改了动物要求（见7.2，1995年版的14.6.2）：I
GB/T15670.17—2017
修改了剂量及分组要求（见7.3，1995年版的14.6.3）；修改了染毒方法（见7.4.1，1995年版的14.6.4）；修改了操作步骤（见7.4，1995年版的14.6.5），本部分由中华人民共和国农业部提出并归口。本部分起草单位：农业部农药检定所。本部分主要起草人李宁、张丽英、陶传江。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T15670—1995。
-TYKAONTKAca
1范围
农药登记毒理学试验方法
GB/T 15670.17—2017
第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验
GB/T15670的本部分规定了哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验的基本原则、方法和要求。
本部分适用于为农药登记而进行的哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB14925实验动物环境及设施
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
染色单体型畸变chromatid-typeaberration染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。3.2
Echromosome-typeaberration
染色体型畸变
染色体结构损伤，表现为在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。3.3
裂隙gap
染色体和染色单体的损伤长度小于一个染色单体的宽度，为染色单体的最小的错误排列。3.4
多倍体polyploid
哺乳动物细胞染色体数目正常为二倍体，在化学诱变剂的作用下染色体数目成倍地增加，如三倍体、四倍体等。
染色体结构畸变chromosomalstructureaherration通过显微镜观察到的细胞分裂中期相的结构改变，如染色体缺失，染色体互换和内交换等。4试验目的
检测受试物引起哺乳动物生殖细胞染色体畸变的效应，以评价受试物引起生殖细胞遗传突变的可1
-TKAONrKAca
GB/T15670.17—2017
能性。
5试验概述
染色体是细胞核中具有特殊结构和遗传功能的小体，当化学物质作用于细胞周期G1期和S期时，诱发染色体型畸变，而作用于G2期时则诱发染色单体型畸变。以适当的染毒途径给动物染毒，并在染毒后适当的时间处死，在动物处死前，动物用中期相阻断剂（如秋水仙素）处理，制备睾丸细胞染色体并染色，对中期相细胞进行染色体畸变分析。6仪器与试剂
6.1仪器
实验室常用设
低渗液
1%柠檬酸三钠：取直名柠檬酸二钠（分析纯）加蒸罐水至1000.4%氯化钟取0.4家化钾（分析纯）加蒸酒水至100ml6.360%冰乙酸
取60ml冰乙酸（分析纯）加蒸馏水6.4固定液
冰酸=3?1.新鲜配制
6.5姬姆萨（Giemsa）染液
姬姆萨（Giemsa）染料
育新鲜配制
配制：将姬姆萨Giemsa染料和少量甲醇置于研钵单仔细研磨，再加入甲醇到375mL，待完全溶解后，再加入125mL代油，混合均勺。置37℃恒温箱中保温48h。保温期间振摇数次，促使染料充分溶解。取出过滤，两周后使用
磷酸盐缓冲液（pH6.8）
1/15mol/L磷酸氢二钠溶液：称取NazHPO9.47g溶于1000mL蒸馏水中。1/15mol/L磷酸二氢钾溶液：称取KH,PO9.cC7g溶于100CmL蒸馏水中。将磷酸氢二钠溶液50mL与磷酸二氢钾溶液50mL混合，用pH计测定并调节至pH6.8。6.7姬姆萨（Giemsa）应用液
取1份姬姆萨（Giemsa)染液与9份磷酸盐缓冲液（pH6.8)混合而成，临用时现配。2
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7试验方法
7.1受试物配制
GB/T 15670.17—2017
受试物应新鲜配制，固体受试物应溶于或悬浮于适当的溶剂或介质中，液体受试物可直接使用或稀释后使用。溶剂和介质在所用剂量下不应产生毒性，也不与受试物发生反应。通常首选溶剂为水，不溶于水的受试物可使用食用油（如橄榄油、玉米油等），不溶于水或油的受试物可使用羧甲基纤维素钠、淀粉等配成混悬液。
实验动物
首选健康成年雄性小鼠，周龄为7周～12周，所用动物起始体重不能超过平均体重的土20%，动物应随机分组，每组至少包括5只可用于分析的动物。如试验设有几个采样的时间点，则要求每个采样时间点都有5只能用于分析的动物，动物试验前适应环境3d~5d。实验动物饲养环境应符合GB14925的有关规定。
7.3剂量及分组
7.3.1如果没有合适的参考资料应在间实验室利用同 品系，性别和染毒方式进行顶试验来确定剂量范围。
如果有毒性，正式试验的第
全来样时问点应
个剂量组高剂量组原则上为动物出现严重中毒反应的剂量，即最大耐受剂量低剂量组或不表现出毒性，在第一不采样点可仅设高利量。但对较低的无毒剂量水平就有生物活性的受试物如减素），量设计可导循真他标准。高剂量也可选急性经口毒性Ds。的50%～80%作为高剂量，按等比级数2间下设置中，低剂量7.3.2限量试验如果单次架毒剂量或同一天2次染毒剂量为2000mg/kg体重，没有产生可观察到的毒性效应，并且根据结构等相关资科推断其无遗传每性，则可不必进在个剂量水平的完整试验，可以2000mg/kg体重剂量进行限量试验：如果大群预期暴露水平较高，应以6000mg/kg休体重剂量进行限量试验或设计更高的剂量
7.3.3每次试验均应设置相应的
其他处理与受试物组
应另设空白对照
月性对照组除不使用受试物外，如果有资料表明所使用的溶剂或介质无致突变作用，可不设空白对照，否则阳性对照组应预期在精原细胞和精母细胞观察到高于背景的染色体畸变的增加。阳性对照组的染毒途径可不同于受试物的染毒途径，可仅在一个时间点采样，如可能，最好选用与受试物化学分类相关的阳性对照物，常用的阳性对照物有环磷酰胺（参考剂量为40mg/kg休重）和丝裂霉素C(参考剂量为2mg/kg体重2.5mg/kg体重），
7.4操作步骤
7.4.1实验动物的处理和采样时间点染毒途径可选用经口灌胃或腹腔注射，一般为一次染毒或两次染毒（间隔24h）给予受试物。受试物溶液一次给予的最大容量不应超过0.2mL/10g体重。如果给予的剂量较大，也可将剂量在一天内分两次给予。
精原细胞：高剂量组应于末次给予受试物后的第21h和48h处死动物采样，中、低剂量组均在末次给予受试物后24h处死动物采样。精母细胞：于第一次染毒后12d～14d采样。动物处死前3h~6h腹腔注射秋水仙素4mg/kg体重～6mg/kg体重（注射体积：0.1mL/10g体3
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重~0.2mL/10g体重）。秋水仙素宜当天新鲜配制。7.4.2标本制备
7.4.2.1取材
用颈椎脱白法处死小鼠，打开腹腔，取出两侧學丸，去净脂肪，于低渗液中洗去毛和血污，放人盛有适量1%柠像酸三钠或0.4%氯化钾溶液的小平中。7.4.2.2低渗
7.4.2.2.1精原细胞
以眼科镀撕开被膜，轻轻地分离曲细精管，加人低渗液10mL，用滴管吹打曲细精管，静置2min，使曲细精管下沉，将含有许多精子和减数分裂精母细胞的上清液仔细吸去。留下的曲细精管，重新用10mL低渗液处理10min
7.4.2.2.2精母细胞
以眼科镊撕开被膜，轻轻地分离曲细精管，加人低渗液10mL，用滴管吹打曲细精管，室温下静置一定时间，一般20min。
7.4.2.3固定
仔细吸尽低渗液，加固定液10mL固定。第一次不超过15min，倒掉固定液后，再加入新的固定液固定20min以上，如在冰箱（0℃~4℃）过夜固定更好。7.4.2.4离心
吸尽固定液，加60%冰乙酸1mL～2mL，待大部分曲细精管软化完后，立即加人倍量的固定液，打勾、移人离心管，以1000r/min离心10min。7.4.2.5滴片
弃去大部分上清液，留下约0.5mL~1.0mL，充分打勾制成细胞混悬液，将细胞混悬液均匀地滴于冰水玻片上。每个样本制得2张～3张。空气干燥或微热烘干。7.4.2.6染色
用姬姆萨（Gicmsa）应用液（pH6.8）染色约20min（根据室温不同染色时间有所不同），用蒸馏水冲洗晾干。
7.4.3阅片
7.4.3.1编号
所有玻片，包括阳性对照和阴性对照，在镜检前均要分别编号。7.4.3.2镜检
在低倍镜下按顺序寻找背景清晰、分散良好、染色体收缩适中的中期分裂相，然后在油镜下进行分析。
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7.4.3.3确定有丝分裂指数
记数1000个细胞中的有丝分裂数（仅限于精原细胞）。7.4.3.4染色体分析
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每个动物至少记数100个中期相细胞，每个剂量组至少观察500个中期分裂相。当观察到的畸变细胞数量较多时，可以减少观察的细胞数，由于固定方法常导致染色体的丢失，所以计数的细胞应含染色体数为2n土2的中期相细胞
7.4.3.5精原细胞
7.4.3.5.1染色体数目改变
正常精原细胞中期分裂相中常见到多倍体，阐明多倍体的意义时应慎重。7.4.3.5.2染色体结构畸变
染色体的结构畸变中，包括断裂、断片、微小体、无着丝点环、环状染色体、双或多着丝点染色体、单体互换等。
7.4.3.6精母细胞
除了可见到裂隙、断片、微小体外，还应分析相互易位、X-Y和常染色体的单价体。相互易位：相互易位涉及非同源染色体间末端断片的交换。它需要二次断裂和修复。有常染色体间的易位和性染色体与常染色体间的易位。常染色体易位时能产生环状的多价体，或链状多价体。如一次易位可形成环状四价体、链状四价休、三价体加上一个单价休（eⅢ十I），若二次、三次或四次易位，则可观察到六价体，八价体或十价体。性染色体的易位，可以有X染色体或Y染色体与常染色体易位。在对照成年动物中自发易位率极低，低于0.01%。老年动物可稍有增加。X-Y和常染色体的单价体：办称早熟分离。对照动物X-Y单价体较常见，约有0～10%。因X和Y染色体是长臂的远端，非同源的片段相接。X、Y的分离常可引起不育。常染色体的单价体是由于不联会（同源片段间配对合子的缺失），或联会消失（由于交叉失败而分离）而造成，它们在对照组动物中较少见，因为交叉在双线期形成，正常配对的联会一直到中期I末。常发生于最小一对常染色体中。8试验结果和评价
对每个动物记录含染色体结构畸变的细胞数和每个细胞的染色体畸变数，并列表给出各组不同类型的染色休结构畸变数目和频率。试验组与阴性对照组的断片、易位、畸变细胞率、常染色体单价体、性染色体单价体等分别按Kastenbaum和Bowman所述方法或二项分布等方法进行统计处理，染色体裂隙应分别记录和报告，一般不计人畸变率。剂量组染色体畸变率或畸变细胞率与阴性对照组相比，统计学上有显著性差异，并有明显的剂量反应关系或在一个剂量组中出现染色体畸变率或畸变细胞率明显增高时即可认为染色体畸变阳性。若统计学上差异有显著性，但无剂量-反应关系，则需进行重复试验，结果可重复者定为阳性。9试验报告
试验报告至少应包括以下内容：5
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试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号；试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期和封样情况；b)免费标准下载网bzxz
试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人，签发日期；试验摘要；
受试物名称、有效成分美国化学文摘登录号（CAS号）（如已知）、代码（如有）、纯度（或含量）e)
剂型、生产日期（批号）、理化性质、配制所用溶剂和方法；实验动物种属、品系、级别、数量、体重、性别、来源（供应商名称、实验动物质量合格证号、实验D
动物生产许可证号），检疫、适应情况，实验动物饲养环境，包括温度、相对湿度、饲料、单笼伺养或群饲、实验动物设施使用许可证号；g）
试验条件和方法，剂量分组，剂量选择依据，染毒途径和方式，受试物配制过程，采样时间点，中期阻断剂的名称，浓度及处理时间，标本制备方法，每只动物观察的细胞数，统计方法和判定标准；
h）试验结果：每只动物细胞染色体的瞻变类型和畸变细胞数，每组动物细胞染色体畸变类型和数量及有畸变的细胞数，剂量-反应关系，阴性对照的历史资料及范围，以列表方式报告受试物组、阴性对照组和阳性对照组的染色休畸变类型、数量和畸变细胞率，并写明结果的统计方法；1)
试验结论：根据试验结果，对受试物在试验条件下是否有致突变作用作出结论，必要时对有关问题进行讨论；
原始记录保存情况的说明
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中华人民共和国
国家标准
农药登记毒理学试验方法
第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验
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开本880×12301/16印张0.75字数16千字2017年7月第一版
2017年7月第一次印刷
书号：155066·1-54020定价
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