GB/T 33807-2017
基本信息
标准号： GB/T 33807-2017
中文名称：玉米中转基因成分的测定 基因芯片法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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标准简介
GB/T 33807-2017 玉米中转基因成分的测定 基因芯片法
GB/T33807-2017
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标准内容
ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T33807-—2017
玉米中转基因成分的测定
基因芯片法
Detection of genetically modified components in maize-Genechipmethod
2017-05-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2017-12-01实施
中华人民共
国家标准
玉米中转基因成分的测定
基因芯片法
GB/T33807—2017
中国标准出版社出版发行
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029)北京市西城区三里河北街16号（100045）网址spc.net.cn
总编室：（010)68533533发行中心：(010)51780238读者服务部：(010)68523946
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销
开本880×12301/16印张1字数26千字2017年6月第一版2017年6月第一次印刷书号：155066·1-55842定价
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由全国生物芯片标准化技术委员会（SAC/TC421）提出并归口。GB/T33807—2017
本标准主要起草单位：四川华汉三创生物科技有限公司、国家农业标准化监测与研究中心（黑龙江）、广东产品质量监督检验研究院、黑龙江省粮油卫生检验监测站。本标准主要起草人：黄广平、彭丽萍、余之蕴、张金龙、王志强、王勇强、孔鲁裔、魏民伟、张春红、尹志坚、王海宽
Hii KAoi KAca
HiiKAoNiKAca
1范围
玉米中转基因成分的测定
基因芯片法
本标准规定了玉米及玉米加工产品中转基因成分的检测方法。GB/T33807—2017
本标准适用于转EPSPS基因、PAT基因、BAR基因耐除草剂玉米和转Bt基因（Cry1A105、Cry1Ab)抗虫玉米中转基因成分的定性检测，也适用于玉米加工产品中转基因成分的定性检测，本标准规定的转基因成分最低检测限量是0.1%。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.3转基因产品检测
GB/T19495.6转基因产品检测
GB/T19495.7转基因产品检测
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
核酸提取纯化方法
基因芯片检测方法
抽样和制样方法
GB/T19495.1.GB/T19495.6界定的术语和定义适用于本文件。3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BAR：来源于杆菌Bacillusamyloliquefaciens草丁胖乙酰转移酶基因（phosphinothricinacetyltransferase gene)
bp：碱基对(basepair）
CaMV35S-P：来自于花椰菜花叶病毒的35S启动子（Promoterfromcauliflouermosaicvirus）CaMV35S-T：来自于花椰菜花叶病毒的35S终止子（Terminationsequencefromcauliflowermo-saic virus)
CrylAb：苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白CrylAb基因（BacillusthuringiensisInsecticidaltoxinCrylAb gene,
CrylA105：苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白CrylA105基因（BacillusthuringiensisInsecticidaltoxinCrylA105 gene)
HiiKAoNiKAca
GB/T33807—2017
dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate）dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate）dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate）DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid）dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate）dUTP：脱氧尿苷三磷酸（deoxyuridinetriphosphate）EPSPS：5-烯醇丙酮酰葬草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphatesynthase）FMV35S-P：玄参花叶病毒35S启动子LpromoterfromFigwortmosaicvirus（FMV35S））Ivrl：玉米转化酶I基因[Zeamaysinvertase（Ivrl）gene]NC：阴性对照（Negativecontrol)NOS-3'：胭脂碱合成酶基因终止子（Termination sequenceof thenopalinesynthasegene）PAT，草丁麟乙酰转移酶基因（phosphinothricinN-acetyltransferasegene)PC：阳性对照（Positivecontrol)Taq酶：来自于栖热水生菌的DNA聚合酶（ThermusaquaticusDNAPolymerase）UNG酶：尿嘧啶-N-糖基化酶（uracilN-glycosylase）4防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施应按照GB/T19495.2的规定执行。5
抽样与制样
抽样与制样方法应符合GB/T19495.7的相关规定。6原理
待检样品经DNA模板提取和核酸定量，采用多重PCR扩增体系，扩增其中可能含有的转基因玉米转基因特异性扩增序列。PCR扩增产物与固定有目标转基因特异性探针的基因芯片进行杂交后，检测结果可以用肉眼直接判断，或用芯片识读仪对杂交芯片进行扫描并判定结果。7试剂与标准品
7.1试剂
除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。7.1.1玉米转基因检测膜芯片法试剂组分应符合7.1.3～7.1.22的规定。7.1.2试剂组分规格和存放条件参见附录A。7.1.3PCR反应使用的引物序列应符合表1的规定。2
HiiKAoNiKAca
目标基因
CrylA105
CrylAb
FMV35S-P
CaMV35S-P
CaMV35S-T
NOS-3”
引物名称
Forward
Reverse
Forward
Reverse
Forward
Reverse
Forward
Reverse
Forward
Reverse
Forward
Reverse
Forward
Reverse
Forward
Reverse
Forward
Reverse
Forward
Reverse
表1PCR反应使用的引物序列
5\-GCGCGATCATACGGAAAAGAT-3
5\-biotin-TCGATGACTTGGCCGGTGAG-3\5°-TGATATGGCCGCGGTTTGTGAT-3*5\-biotin-GGCCCAGCGTAAGCAATACC-3\5\-CACCTGCTGAAGTCCCTGGA-3\5*\-biotin-GTACCGGCAGGCTGAAGTCCA-3\5\-ACTCGATCAGGTACAATGCCA-3\5\-biotin-GCATCTGTTAGGCTCTCCAC-3\5\-GACATGAACAGCGCCTTGAC-3\5\-biotin-TTGATGGTTGCAGCATCGAA-3\5\-AGTCCAAAGCCTCAACAAGG-3
5\-biotin-CCCACTAACTTTAAGTCTTCGGTG-35′-GGCCATCGTTGAAGATGCCTC-3\5'-biotin-TCATCCCTTACGTCAGTGGA-3\5'-CCAGATAAGGGAATTAGGGTTC-3\5*-biotin-ACTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGA-35*-TGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTT-35'-biotin-GCGCGCGATAATTTATCCTAGTTT-35-GCTCCTAGCATTCCACGTCC-3*
5*-biotin-CCCTTGTGATACAGCGGACCT-3膜芯片表面包被的目标基因探针序列应符合表2的规定。表2
CrylA105
CrylAb
FMV35S-P
目标基因探针序列
GB/T33807—2017
扩增片段大小/bp
修饰基团
5'-ACCTTACCGTCGAGACGGATGCGGACGGCGTGCGCACCATCCGCCTGGAAGGCCGCGGC-3*5*-GCAAGATAGATACCCTTGGTTGGTTGCTGAGGTTGAGGGTGTTGTGGCTGGTATTGCTT-3\5'-CGCGGCATGCTGCGGGCGGCCGGCTTCAAGCACGGGAACTGGCATGACGTGGGTTTCTG-3'5'-GACCGTGAATGTCCCAGGTACTGGTTCCCTCTGGCCACTTTCTGCCCAATCTCCCATTG-3'5\-GCAGCTAATCTTCACCTCAGCGTGCTTCGAGACGTTAGCGTGTTTGGGCAAAGGTGGGG-3\5'-CAAAGTAAACTACTGTTCCAGCACATGCATCATGGTCAGTAAGTTTCAGAAAAAGACAT-3\5'-AGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATG-3*CaMV35S-P5
CaMV35S-T5
5'-AGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATCAATAAAAT-3NOS-3
5'-TTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGC-3*5'-AGATATTGTCCCATCAGCTGCTAGCTTTCGCGTATTGATGTCGTGACATTTTGCACGCA-3\5-AminolinkerC6
5'-AminolinkerC6
5\-AminolinkerC6
5\-AminolinkerC6
5'-AminolinkerC6
5\-AminolinkerC6
5\-AminolinkerC6
5'-AminolinkerC6
5*-AminolinkerC6
5*-AminolinkerC6
iiKAoiKAca
GB/T33807-2017
表2（续）
5\-GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAACGAGTGTCCAAAGTACCAG-3'5'-GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCCATGTTTGTTGGATGATCCTATTTTC-3修饰基团
5'-AminolinkerC6
5'-AminolinkerC6
注：阳性寡核苷酸单链DNA(Positive-Oligo，10μmol/L)：核苷酸序列与阳性对照核酸探针（PC)序列互补，用于膜芯片杂交过程质量控制，5'端带生物素（biotin)标记，序列如下：5\-biotin-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-37.1.5
乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na，CioHNzNazO）：分析纯。十二烷基磺酸钠（SDS，Ci2H25SO,Na)：分析纯。氢氧化钠(NaOH)：分析纯。
氯化钠（NaCI)：分析纯。
磷酸二氢钠（NaH.PO·H.O)：分析纯。碱性磷酸酶标记链霉亲和素（AP-streptavidin）。碱性磷酸酶化学显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑兰（NBT/BCIP)。多重PCR即用型预混液（MultiplexPCRMasterMix）。多重PCR引物预混液（MultiplexPCRPrimerMix）：每条引物2μmol/L。20XSSPE缓冲液：3mol/LNaCl，200mmol/LNaH,PO4，20mmol/LEDTA，pH7.4。去活化液：100mmol/LNaOH。
去活化清洗液：2XSSPE，0.1%SDS，杂交液：2XSSPE，0.1%SDS。bzxZ.net
杂交清洗液：2XSSPE，0.5%SDS。酶孵育液：2XSSPE，0.5%SDS。
孵育清洗液1:2XSSPE，0.5%SDS。孵育清洗液2：2XSSPE。
底物显色液：碱性磷酸酶化学显色底物NBT/BCIP显色液。7.2标准品
Bt11Maize转基因玉米标准品Bt11品系7.2.11
Bt11品系含待检测转基因Cry1Ab，PAT，CaMV35S-P，NOS-3。CBH-351Maize转基因玉米标准品CBH-351品系7.2.2
CBH-351品系含待检测转基因：BAR，CaMV35S-P，CaMV35S-T，NOS-3”。7.2.3TC1507Maize转基因玉米标准品TC1507品系TC1507品系含待检测转基因：PAT，CaMV35S-P，CaMV35S-T。7.2.4MON88017Maize转基因玉米标准品MON88017品系MON88017品系含待检测转基因：EPSPS，CaMV35S-P，NOS-3。7.2.5MON89034Maize转基因玉米标准品MON89034品系MON89034品系含待检测转基因：Cry1A105，FMV35S-P，CaMV35S-P，NOS-3'。4
HiiKAoNiKAca
7.2.6Non-ModifiedMaize非转基因玉米标准品仪器与设备
基因扩增仪。
超净工作台。
消毒灭菌锅。
8.4制冰机。
核酸蛋白分析仪。
冷藏冷冻冰箱。
纯水仪。
研磨仪。
分析天平。
膜芯片识读仪。
台式离心机：最高转速12000r/min。Mini个人离心机。
涡旋混合器。
恒温水浴锅。
分子杂交炉。
膜芯片自动杂交仪。
GB/T33807—2017
微量移液器（量程0.2μ～2μL，1μL～10μ，20μL～100μ，100μ~1000μ）及枪头。9
试验方法
9.1样品
实验室样品代表性应符合GB/T19495.7的规定。标准品、实验室样品及测试样品的保存应按照GB/T19495.1的规定执行。9.1.2
所有测试样品的制备操作应按照GB/T19495.2的规定执行，小心操作确保防止任何的污染和9.1.3
样品组分的改变。
2膜芯片的制作和检测步骤
试验用膜芯片按照附录B的方法进行制作。9.2.1
9.2.2膜芯片检测步骤按照附录C进行。3样品制备
9.3.1DNA的提取
样品中DNA的提取，应按照GB/T19495.3中的规定执行。每个测试样品提取时应做两个重复，并按照GB/T19495.3中规定的DNA定量方法对提取后的DNA进行定量。9.3.2PCR扩增
将9.3.1的核酸提取物加人到PCR反应体系进行扩增。5
HiiKAoNiKAca
GB/T33807—2017
PCR反应体系
按照表3配制PCR反应体系。每次试验中，利用转基因玉米标准品的基因组DNA作为阳性质控，非转基因玉米标准品的基因组DNA作为阴性质控，核酸提取空白作为空白质控，以对后续的PCR扩增体系、膜芯片杂交反应进行质控。3PCR反应体系体积（50μL）
反应液组成
Multiplex PCR Master Mix
MultiplexPCRprimerMix
检测样品基因组DNA
转基因玉米标准品基因组DNA
非转基因玉米标准品基因组 DNA核酸提取空白
无核酸酶灭菌水
检测反应
25 μL
至50μL
阳性质控
25 μL
至50μL
阴性质控
25 μL
至50μL
空白质控
25 μL
10 μL
至50μL
注：PCR体系最终含有MgCl21.5mmol/L，dATP，dCTP.dGTP、dTTP和dUTP各0.2mmol/L，UNG酶1U，Taq酶2U，每条引物0.2μmol/L
4PCR反应循环参数
按照表4设计PCR反应参数
表4PCR反应参数
膜芯片杂交
杂交体系
按照表5配制杂交体系液。
95 ℃
55 ℃
72 ℃
3.4.5循环40次
72 ℃
反应时间
杂交液（2XSSPE，0.1%SDS）
PCR扩增产物
阳性寡核苷酸单链DNA
(Positive-Oligo,lo μmol/L)
总体积
酶孵育体系
表5杂交体系
按照表6配制酶孵育体系液，用前新鲜配制。表6
孵育液（2XSSPE，0.5%SDS）
碱性磷酸酶标记链霉亲和素
(AP-streptavidin)
总体积
杂交，酶联及显色
手动过程
酶孵育体系
体积/μL
体积/μL
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将膜芯片置于杂交盒内，按表7进行手动杂交。杂交过程在分子杂交炉中进行，也可选择满足试验要求的类似产品。
过程名称
去活化
去活化清洗
杂交清洗（2次）
酶孵育
孵育清洗1(2次）
解育清洗2(2次）
显色清洗（2次）
结果判读
膜芯片手动杂交过程
加人去活化液，37℃，8min，吸除去活化液骤
加入去活化清洗液，60℃，5min，吸除去活化清洗液加人杂交体系液，42C，45min，吸除杂交体系液加人杂交清洗液，52℃，5min，吸除杂交清洗液，该过程重复2次加人酶孵育体系液，42℃，30min，吸除酶孵育体系液加人孵育清洗液1.42℃，5min，吸除孵育清洗液1，该过程重复2次加入孵育清洗液2.37℃，5min，吸除孵育清洗液2.该过程重复2次加人显色液，37℃，静止显色15min，吸除显色液加人去离子水，37℃，5min，吸除去离子水，该过程重复2次根据杂交点显色情况进行结果判读GB/T33807-2017
9.4.3.2自动杂交仪测定过程
按膜芯片自动杂交仪操作说明书开机，预热，之后将包装有膜芯片的杂交盒放人自动杂交仪中开始杂交过程，依次自动完成去活化、杂交、清洗、酶孵育、显色等步骤。具体过程如表8所示。
程序名称
去活化
去活化清洗
杂交清洗
杂交清洗
酶孵育
孵育清洗1
孵育清洗1
孵育清洗2
孵育清洗2
显色清洗
显色清洗
结果判读
膜芯片结果判读
目测判读
试剂名称
去活化液
去活化清洗液
杂交液
杂交清洗液
杂交清洗液
孵育液
孵育清洗液1
孵育清洗液1
孵育清洗液2
孵育清洗液2
显色液
去离子水
去离子水
自动杂交仪测定过程
温度/℃
根据杂交点显色情况进行结果判读时间/min
显色后的膜芯片可以用肉眼直接判读检测结果。阳性杂交信号为肉眼明显可见的蓝色斑点。如果杂交点部位没有显色，和膜芯片背景相同，则判读为阴性杂交信号。9.5.2
膜芯片识读仪判读
膜芯片显色后，使用膜芯片识读仪进行扫描分析，根据杂交点的灰度值判断检测结果，阳性杂交信号的判断阅值是3倍背景灰度值加上3倍背景灰度值标准差。结果判断
10.1质量控制
核酸提取空白对照和多重PCR扩增试剂空白对照10.1.1
膜芯片上内源基因探针点杂交信号阴性，转基因探针点杂交信号阴性，阳性对照探针点杂交信号阳性，阴性对照探针点杂交信号阴性。8
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2017-05-31发布
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2017-12-01实施
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国家标准
玉米中转基因成分的测定
基因芯片法
GB/T33807—2017
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北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029)北京市西城区三里河北街16号（100045）网址spc.net.cn
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本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由全国生物芯片标准化技术委员会（SAC/TC421）提出并归口。GB/T33807—2017
本标准主要起草单位：四川华汉三创生物科技有限公司、国家农业标准化监测与研究中心（黑龙江）、广东产品质量监督检验研究院、黑龙江省粮油卫生检验监测站。本标准主要起草人：黄广平、彭丽萍、余之蕴、张金龙、王志强、王勇强、孔鲁裔、魏民伟、张春红、尹志坚、王海宽
Hii KAoi KAca
HiiKAoNiKAca
1范围
玉米中转基因成分的测定
基因芯片法
本标准规定了玉米及玉米加工产品中转基因成分的检测方法。GB/T33807—2017
本标准适用于转EPSPS基因、PAT基因、BAR基因耐除草剂玉米和转Bt基因（Cry1A105、Cry1Ab)抗虫玉米中转基因成分的定性检测，也适用于玉米加工产品中转基因成分的定性检测，本标准规定的转基因成分最低检测限量是0.1%。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.3转基因产品检测
GB/T19495.6转基因产品检测
GB/T19495.7转基因产品检测
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
核酸提取纯化方法
基因芯片检测方法
抽样和制样方法
GB/T19495.1.GB/T19495.6界定的术语和定义适用于本文件。3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BAR：来源于杆菌Bacillusamyloliquefaciens草丁胖乙酰转移酶基因（phosphinothricinacetyltransferase gene)
bp：碱基对(basepair）
CaMV35S-P：来自于花椰菜花叶病毒的35S启动子（Promoterfromcauliflouermosaicvirus）CaMV35S-T：来自于花椰菜花叶病毒的35S终止子（Terminationsequencefromcauliflowermo-saic virus)
CrylAb：苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白CrylAb基因（BacillusthuringiensisInsecticidaltoxinCrylAb gene,
CrylA105：苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白CrylA105基因（BacillusthuringiensisInsecticidaltoxinCrylA105 gene)
HiiKAoNiKAca
GB/T33807—2017
dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate）dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate）dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate）DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid）dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate）dUTP：脱氧尿苷三磷酸（deoxyuridinetriphosphate）EPSPS：5-烯醇丙酮酰葬草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphatesynthase）FMV35S-P：玄参花叶病毒35S启动子LpromoterfromFigwortmosaicvirus（FMV35S））Ivrl：玉米转化酶I基因[Zeamaysinvertase（Ivrl）gene]NC：阴性对照（Negativecontrol)NOS-3'：胭脂碱合成酶基因终止子（Termination sequenceof thenopalinesynthasegene）PAT，草丁麟乙酰转移酶基因（phosphinothricinN-acetyltransferasegene)PC：阳性对照（Positivecontrol)Taq酶：来自于栖热水生菌的DNA聚合酶（ThermusaquaticusDNAPolymerase）UNG酶：尿嘧啶-N-糖基化酶（uracilN-glycosylase）4防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施应按照GB/T19495.2的规定执行。5
抽样与制样
抽样与制样方法应符合GB/T19495.7的相关规定。6原理
待检样品经DNA模板提取和核酸定量，采用多重PCR扩增体系，扩增其中可能含有的转基因玉米转基因特异性扩增序列。PCR扩增产物与固定有目标转基因特异性探针的基因芯片进行杂交后，检测结果可以用肉眼直接判断，或用芯片识读仪对杂交芯片进行扫描并判定结果。7试剂与标准品
7.1试剂
除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。7.1.1玉米转基因检测膜芯片法试剂组分应符合7.1.3～7.1.22的规定。7.1.2试剂组分规格和存放条件参见附录A。7.1.3PCR反应使用的引物序列应符合表1的规定。2
HiiKAoNiKAca
目标基因
CrylA105
CrylAb
FMV35S-P
CaMV35S-P
CaMV35S-T
NOS-3”
引物名称
Forward
Reverse
Forward
Reverse
Forward
Reverse
Forward
Reverse
Forward
Reverse
Forward
Reverse
Forward
Reverse
Forward
Reverse
Forward
Reverse
Forward
Reverse
表1PCR反应使用的引物序列
5\-GCGCGATCATACGGAAAAGAT-3
5\-biotin-TCGATGACTTGGCCGGTGAG-3\5°-TGATATGGCCGCGGTTTGTGAT-3*5\-biotin-GGCCCAGCGTAAGCAATACC-3\5\-CACCTGCTGAAGTCCCTGGA-3\5*\-biotin-GTACCGGCAGGCTGAAGTCCA-3\5\-ACTCGATCAGGTACAATGCCA-3\5\-biotin-GCATCTGTTAGGCTCTCCAC-3\5\-GACATGAACAGCGCCTTGAC-3\5\-biotin-TTGATGGTTGCAGCATCGAA-3\5\-AGTCCAAAGCCTCAACAAGG-3
5\-biotin-CCCACTAACTTTAAGTCTTCGGTG-35′-GGCCATCGTTGAAGATGCCTC-3\5'-biotin-TCATCCCTTACGTCAGTGGA-3\5'-CCAGATAAGGGAATTAGGGTTC-3\5*-biotin-ACTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGA-35*-TGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTT-35'-biotin-GCGCGCGATAATTTATCCTAGTTT-35-GCTCCTAGCATTCCACGTCC-3*
5*-biotin-CCCTTGTGATACAGCGGACCT-3膜芯片表面包被的目标基因探针序列应符合表2的规定。表2
CrylA105
CrylAb
FMV35S-P
目标基因探针序列
GB/T33807—2017
扩增片段大小/bp
修饰基团
5'-ACCTTACCGTCGAGACGGATGCGGACGGCGTGCGCACCATCCGCCTGGAAGGCCGCGGC-3*5*-GCAAGATAGATACCCTTGGTTGGTTGCTGAGGTTGAGGGTGTTGTGGCTGGTATTGCTT-3\5'-CGCGGCATGCTGCGGGCGGCCGGCTTCAAGCACGGGAACTGGCATGACGTGGGTTTCTG-3'5'-GACCGTGAATGTCCCAGGTACTGGTTCCCTCTGGCCACTTTCTGCCCAATCTCCCATTG-3'5\-GCAGCTAATCTTCACCTCAGCGTGCTTCGAGACGTTAGCGTGTTTGGGCAAAGGTGGGG-3\5'-CAAAGTAAACTACTGTTCCAGCACATGCATCATGGTCAGTAAGTTTCAGAAAAAGACAT-3\5'-AGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATG-3*CaMV35S-P5
CaMV35S-T5
5'-AGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATCAATAAAAT-3NOS-3
5'-TTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGC-3*5'-AGATATTGTCCCATCAGCTGCTAGCTTTCGCGTATTGATGTCGTGACATTTTGCACGCA-3\5-AminolinkerC6
5'-AminolinkerC6
5\-AminolinkerC6
5\-AminolinkerC6
5'-AminolinkerC6
5\-AminolinkerC6
5\-AminolinkerC6
5'-AminolinkerC6
5*-AminolinkerC6
5*-AminolinkerC6
iiKAoiKAca
GB/T33807-2017
表2（续）
5\-GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAACGAGTGTCCAAAGTACCAG-3'5'-GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCCATGTTTGTTGGATGATCCTATTTTC-3修饰基团
5'-AminolinkerC6
5'-AminolinkerC6
注：阳性寡核苷酸单链DNA(Positive-Oligo，10μmol/L)：核苷酸序列与阳性对照核酸探针（PC)序列互补，用于膜芯片杂交过程质量控制，5'端带生物素（biotin)标记，序列如下：5\-biotin-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-37.1.5
乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na，CioHNzNazO）：分析纯。十二烷基磺酸钠（SDS，Ci2H25SO,Na)：分析纯。氢氧化钠(NaOH)：分析纯。
氯化钠（NaCI)：分析纯。
磷酸二氢钠（NaH.PO·H.O)：分析纯。碱性磷酸酶标记链霉亲和素（AP-streptavidin）。碱性磷酸酶化学显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑兰（NBT/BCIP)。多重PCR即用型预混液（MultiplexPCRMasterMix）。多重PCR引物预混液（MultiplexPCRPrimerMix）：每条引物2μmol/L。20XSSPE缓冲液：3mol/LNaCl，200mmol/LNaH,PO4，20mmol/LEDTA，pH7.4。去活化液：100mmol/LNaOH。
去活化清洗液：2XSSPE，0.1%SDS，杂交液：2XSSPE，0.1%SDS。bzxZ.net
杂交清洗液：2XSSPE，0.5%SDS。酶孵育液：2XSSPE，0.5%SDS。
孵育清洗液1:2XSSPE，0.5%SDS。孵育清洗液2：2XSSPE。
底物显色液：碱性磷酸酶化学显色底物NBT/BCIP显色液。7.2标准品
Bt11Maize转基因玉米标准品Bt11品系7.2.11
Bt11品系含待检测转基因Cry1Ab，PAT，CaMV35S-P，NOS-3。CBH-351Maize转基因玉米标准品CBH-351品系7.2.2
CBH-351品系含待检测转基因：BAR，CaMV35S-P，CaMV35S-T，NOS-3”。7.2.3TC1507Maize转基因玉米标准品TC1507品系TC1507品系含待检测转基因：PAT，CaMV35S-P，CaMV35S-T。7.2.4MON88017Maize转基因玉米标准品MON88017品系MON88017品系含待检测转基因：EPSPS，CaMV35S-P，NOS-3。7.2.5MON89034Maize转基因玉米标准品MON89034品系MON89034品系含待检测转基因：Cry1A105，FMV35S-P，CaMV35S-P，NOS-3'。4
HiiKAoNiKAca
7.2.6Non-ModifiedMaize非转基因玉米标准品仪器与设备
基因扩增仪。
超净工作台。
消毒灭菌锅。
8.4制冰机。
核酸蛋白分析仪。
冷藏冷冻冰箱。
纯水仪。
研磨仪。
分析天平。
膜芯片识读仪。
台式离心机：最高转速12000r/min。Mini个人离心机。
涡旋混合器。
恒温水浴锅。
分子杂交炉。
膜芯片自动杂交仪。
GB/T33807—2017
微量移液器（量程0.2μ～2μL，1μL～10μ，20μL～100μ，100μ~1000μ）及枪头。9
试验方法
9.1样品
实验室样品代表性应符合GB/T19495.7的规定。标准品、实验室样品及测试样品的保存应按照GB/T19495.1的规定执行。9.1.2
所有测试样品的制备操作应按照GB/T19495.2的规定执行，小心操作确保防止任何的污染和9.1.3
样品组分的改变。
2膜芯片的制作和检测步骤
试验用膜芯片按照附录B的方法进行制作。9.2.1
9.2.2膜芯片检测步骤按照附录C进行。3样品制备
9.3.1DNA的提取
样品中DNA的提取，应按照GB/T19495.3中的规定执行。每个测试样品提取时应做两个重复，并按照GB/T19495.3中规定的DNA定量方法对提取后的DNA进行定量。9.3.2PCR扩增
将9.3.1的核酸提取物加人到PCR反应体系进行扩增。5
HiiKAoNiKAca
GB/T33807—2017
PCR反应体系
按照表3配制PCR反应体系。每次试验中，利用转基因玉米标准品的基因组DNA作为阳性质控，非转基因玉米标准品的基因组DNA作为阴性质控，核酸提取空白作为空白质控，以对后续的PCR扩增体系、膜芯片杂交反应进行质控。3PCR反应体系体积（50μL）
反应液组成
Multiplex PCR Master Mix
MultiplexPCRprimerMix
检测样品基因组DNA
转基因玉米标准品基因组DNA
非转基因玉米标准品基因组 DNA核酸提取空白
无核酸酶灭菌水
检测反应
25 μL
至50μL
阳性质控
25 μL
至50μL
阴性质控
25 μL
至50μL
空白质控
25 μL
10 μL
至50μL
注：PCR体系最终含有MgCl21.5mmol/L，dATP，dCTP.dGTP、dTTP和dUTP各0.2mmol/L，UNG酶1U，Taq酶2U，每条引物0.2μmol/L
4PCR反应循环参数
按照表4设计PCR反应参数
表4PCR反应参数
膜芯片杂交
杂交体系
按照表5配制杂交体系液。
95 ℃
55 ℃
72 ℃
3.4.5循环40次
72 ℃
反应时间
杂交液（2XSSPE，0.1%SDS）
PCR扩增产物
阳性寡核苷酸单链DNA
(Positive-Oligo,lo μmol/L)
总体积
酶孵育体系
表5杂交体系
按照表6配制酶孵育体系液，用前新鲜配制。表6
孵育液（2XSSPE，0.5%SDS）
碱性磷酸酶标记链霉亲和素
(AP-streptavidin)
总体积
杂交，酶联及显色
手动过程
酶孵育体系
体积/μL
体积/μL
GB/T33807—2017
将膜芯片置于杂交盒内，按表7进行手动杂交。杂交过程在分子杂交炉中进行，也可选择满足试验要求的类似产品。
过程名称
去活化
去活化清洗
杂交清洗（2次）
酶孵育
孵育清洗1(2次）
解育清洗2(2次）
显色清洗（2次）
结果判读
膜芯片手动杂交过程
加人去活化液，37℃，8min，吸除去活化液骤
加入去活化清洗液，60℃，5min，吸除去活化清洗液加人杂交体系液，42C，45min，吸除杂交体系液加人杂交清洗液，52℃，5min，吸除杂交清洗液，该过程重复2次加人酶孵育体系液，42℃，30min，吸除酶孵育体系液加人孵育清洗液1.42℃，5min，吸除孵育清洗液1，该过程重复2次加入孵育清洗液2.37℃，5min，吸除孵育清洗液2.该过程重复2次加人显色液，37℃，静止显色15min，吸除显色液加人去离子水，37℃，5min，吸除去离子水，该过程重复2次根据杂交点显色情况进行结果判读GB/T33807-2017
9.4.3.2自动杂交仪测定过程
按膜芯片自动杂交仪操作说明书开机，预热，之后将包装有膜芯片的杂交盒放人自动杂交仪中开始杂交过程，依次自动完成去活化、杂交、清洗、酶孵育、显色等步骤。具体过程如表8所示。
程序名称
去活化
去活化清洗
杂交清洗
杂交清洗
酶孵育
孵育清洗1
孵育清洗1
孵育清洗2
孵育清洗2
显色清洗
显色清洗
结果判读
膜芯片结果判读
目测判读
试剂名称
去活化液
去活化清洗液
杂交液
杂交清洗液
杂交清洗液
孵育液
孵育清洗液1
孵育清洗液1
孵育清洗液2
孵育清洗液2
显色液
去离子水
去离子水
自动杂交仪测定过程
温度/℃
根据杂交点显色情况进行结果判读时间/min
显色后的膜芯片可以用肉眼直接判读检测结果。阳性杂交信号为肉眼明显可见的蓝色斑点。如果杂交点部位没有显色，和膜芯片背景相同，则判读为阴性杂交信号。9.5.2
膜芯片识读仪判读
膜芯片显色后，使用膜芯片识读仪进行扫描分析，根据杂交点的灰度值判断检测结果，阳性杂交信号的判断阅值是3倍背景灰度值加上3倍背景灰度值标准差。结果判断
10.1质量控制
核酸提取空白对照和多重PCR扩增试剂空白对照10.1.1
膜芯片上内源基因探针点杂交信号阴性，转基因探针点杂交信号阴性，阳性对照探针点杂交信号阳性，阴性对照探针点杂交信号阴性。8
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