GB/T 34729-2017
基本信息
标准号： GB/T 34729-2017
中文名称：猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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标准简介
GB/T 34729-2017 猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法
GB/T34729-2017
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标准内容
ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T34729—2017
猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法Blocking ELISA method to detect antibody against classical swine fever virus2017-11-01发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2018-05-01实施
中华人民共和国
国家标准
猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法GB/T34729—2017
中国标准出版社出版发行
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（10C045）网址spc.net.cn
总编室：(010)68533533
发行中心：（010)51780238
读者服务部：（010)68523946
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销
开本880×12301/16
印张0.75
宇数20千字
2017年11月第一版2017年11月第一次印刷书号：155066·【-57910定价16.00元告由本社发行中心调换
如有印装差错
版权专有侵权必究
举报电话：（010)68510107
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国兽医药品监察所。本标准主要起草人：王琴、徐璐、范学政、赵启祖、朱元源、邹兴启、宁宜宝。GB/T34729—2017
-TKAOKAca
GB/T34729-2017
本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及4.1与猪瘟病毒E2蛋白表达及纯化相关的专利的使用。
本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可通过以下联系方式获得：
专利持有人姓名：中国兽医药品监察所地址：北京中关村南大街8号
请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
-TTKAONKAca
1范围
猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法本标准规定了猪瘟病毒抗体检测的阻断ELISA方法。本标准适用于猪瘟抗体检测，但无法区分疫苗免疫抗体和野毒感染抗体。规范性引用文件
GB/T34729—2017
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用义件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。兽医实验室生物安全技术管理规范农业部公告第302号3
缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CSFV：猪瘟病毒（ClassicalSwineFeverVirus）ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay）HRP：辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase）OD：光密度（OpticalDensity）4试剂
猪瘟病毒E2蛋白：见附录A。
酶结合物：参见附录B。
标准阳性血清：猪瘟疫苗免疫仔猪制备，经荧光抗体病毒中和试验检测为阳性，标准阴性血清：无母源抗体、未免疫猪瘟疫苗的仔猪血清，经荧光抗体病毒中和试验检测为阴性。包被液：见C.1。
磷酸盐缓冲液：见C.2。
封闭液：见C.3。
20倍浓缩洗液：见C.4。
稀释液：见C.5。
底物液A：见C.6。
底物液B:见C.7。
终止液：见C.8。
商品化试剂盒：可选择同类的商品化试剂盒。器材和设备
37℃温箱。
KAoNiKAca
GB/T34729—2017
酶联读数仪
微量移液器（200uL、1000uL）和吸头。5.4
多道移液器（200μL)。
5.5酶联反应板。
一次性注射器（5mL、10mL)。
血清样本的处理
样本采集及处理
采集静脉血时，每头猪使用一个注射器，不同猪的注射器不能混用。进行前腔静脉或耳静脉无菌采血，不少于2mL。室温静置于斜面2h，待自然凝固后，置于2℃~-8℃冰箱中放置不少于2h，4000r/min离心10min。用移液器小心吸出上层血清。6.2血清样本的存放与运送
血清样本在
一周内检测，可置2℃～8℃条件下保存，超过一周，应置一20℃以下冷冻保存。运输
时注意冷藏，确保样品有效
采集的血清样本时用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输，运输时间应尽量缩短。按照兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识7检测步骤
7.1抗原包被：用包被液将亲和层2蛋白稀释不0.2μg/ml
析纯化的E2
2℃~8包被16h，即为抗原包被板。7.2抗原包被板的封闭：包被结束后奔去孔中液体海孔加人
新鲜配制的封闭液3002℃8二封闭24h。300μL，漂洗1次，于吸水滤纸上拍7.3在抗原包被板中加人稀释液50乳被酶联反应板，100μL/孔，
洗液300L，漂洗1次。每孔加人
封闭结束后去孔中液体，海孔加人1倍洗液将待检血清按顺序加人到抗原包被板壳，50μL/孔。同时加入阳性对照及阴性对照血清各2孔，50μL/孔。37℃温箱中反应1h。7.4弃去反应液每孔加人1×洗液300μL，漂洗3次7.5用稀释液将酶结合物稀释100倍，每孔加入100L。37℃温箱中度应1h7.6重复7.4步骤。
将底物液A和B按等体积进行混合，混合后立即加到抗原包被板中，每孔100uL，避光显色10min。
7.8每孔加人100μL终止液。
酶标仪上读取450nm吸光值。
7.10结果计算「见式（1)式（3)：式中：
阴性对照孔平均值；
阴性对照孔1的OD值；
阴性对照孔2的OD值。
N(N,+N,)
(P,+P)
·（2)
KAoNiKAca
式中：
式中：
阳性对照孔平均值；
阳性对照孔1的OD值；
阳性对照孔2的OD值。
阻断率；
阴性对照孔平均值；
样本OD值。
GB/T34729—2017
..·（3)
7.11试验成立条件：标准阴性对照血清OD450.5，标准阳性对照的阻断率大于50%，该检验结果成立。若试验不成立，应进行重复检测。8结果判定下载标准就来标准下载网
样本的阻断率一40，则该样本可以判为阳性，即有猪瘟抗体存在，如被检样本的阻断如果被检
率≥32%，则该样本可以判为阴性，即无猪度抗体在在如果该样本的阻断率在32%—-40%，则应在14d后对动物进行重新检测
8.2若采用商品化试剂盒，可根据说班书进行操作及结果判定9
注意事项
所有操作应严格遵守生物安全规定9.1
9.2用于加样的移液器应进行校准以免误差过大影响检测结果9.320倍浓缩洗涤液在低温保存时可能会产生百色结晶，应加热使其溶解后再使用9.4底物溶液和终止波对眼晴，皮肤以及呼吸道有刺激作用，使用过程中应穿戴相应的防护用具，防止接触和吸人，
9.5底物溶液应避光保存避免与氧化剂接触，盛装底物溶液的容器应保持干净。9.6所有试剂一律于℃～C保存，使用前恢复至室温。血清稀释板只能使用一次，没用完的血清稀释板应将用过的孔充分洗涤销千，并进行标记，避免下9.7
次检测时发牛混淆。在进行多板检测时，反应板不能善放在37℃温箱中，以免导致各反应板受热不均。37℃反应时，反应板可平放于湿盒内或加封板膜后直接平放于温箱中，但不能采用密封袋，以免导致受热不均。
-KAoNIKAca
GB/T34729—2017
A.1材料和试剂
附录A
（规范性附录）
猪瘟病毒E2蛋白的表达及纯化
猪瘟兔化弱毒疫苗株：大肠杆菌感受态细胞、pFastBac1质粒、DH10Bac感受态细胞，Sf9细胞、质粒提取试剂盒、转染试剂、无血清培养基均为商品化试剂：A.2引物序列
P1-1：5ATAGGATCCACCATGGCATTCCTCATCTGCTTGATAAAAGTATTAAG<3P2-1:5>TAAGCTTACTTGGTACCGTGATGGTGATGGTGATGTCCCATACCAGCGGCGAGTTGTTCTGTTAGAACTACGTAGGTCACTATCAGC<3M13F：5>GTTTTCCCAGTCACGAC<3
M13R：5>CAGGAAACAGCTATGAC<3
A.3方法
A.3.1重组转移载体的构建
猪瘟免化弱毒疫苗株RNA的提取、反转录合成病毒cDNA。再用引物P11和P21扩增猪瘟免化弱毒疫苗株基因，琼脂糖凝胶纯化，将纯化产物和载体pFastbacl分别用BainHI/HindⅢ酶切、连接，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选获得的重组转移载休。A.3.2重组杆粒的构建
将重组转移载体转化DH10Bac感受态细胞，在筛选培养基上行蓝白斑筛选，取白斑培养，用PCR方法进行鉴定，引物为M13F/M13R，月的片段长度为3500bp。A.3.3转染及病毒鉴定
将鉴定正确的克隆菌在培养基中扩大培养，用质粒提取试剂盒提取重组杆粒DNA，用转染试剂转染Sf9细胞，转染后28℃培养96h，获得重组病毒。将病毒液在Sf9细胞上传3代后，以1%的比例感染Sf9细胞，28℃培养96h后，收集培养上清A.3.4猪瘟病毒E2蛋白的纯化
将收集的培养上清12000r/m离心10min，除去细胞碎片，然后将上清用离心超滤法浓缩；浓缩的上清在镍离了亲和层析洗液（50mmol/L磷酸钠、300mmol/L氯化钠，pH7.0）中4C透析过夜。平衡过的上清加入洗液平衡过镍离子亲和层析柱，4吸附30min后，用40mmol/L咪唑洗脱，收集洗脱液。用SDS-PAGE电泳检测纯化效果。A.3.5蛋白浓度测定
用BCA法测定蛋白浓度，按说明配制BSA蛋白标准250pg/mL、125ug/mL、50μg/mL、4
KAoNrKAca
GB/T34729—2017
25μg/mL、5μg/ml、0μg/mL，将E2蛋白稀释10倍，其他均按说明书操作。测定OD592nm，绘制标准曲线，计算E2蛋白浓度。纯化后的E2蛋白浓度应≥0.1mg/nL。A.3.6蛋白纯度测定和特异性测定取5μL、2μL、1μL纯化产物进行SDS-PAGE电泳，用凝胶成像仪中成像并用薄层扫描法测定蛋白纯度，蛋白纯度应90%。同时用猪瘟阳性血清对纯化后的E2蛋白进行Westernblot鉴定和ELISA鉴定，猪瘟阳性血清应仪与日的蛋白发生特异性反应，杂蛋白无反应。TYKAONIKAca
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B.1材料
附录B
（资料性附录）
酶结合物的制备
猪瘟病毒E2蛋白：制备及纯化见附录A。B.1.1
B.1.2弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、6~8周龄BalB/C小鼠、青链霉素混合液（100x），小鼠骨髓瘤细胞（SP2/o）、改良Eagle培养基（Dulbecco'smodificationofEagle'smediumDulbecco，DMEM）、胎牛血清（FetalBovineSerum，FBS）、50%聚乙二醇1000、次黄嘌呤-氨噗呤-胸苷培养基添加物（50×）（HYPOXANTHINE-THYMIDINEMEDIASUPPLEMENT，HT）、次黄嘌岭-氨噪岭-胸苷培养基添加物（5OX）（HYPOXANTHINE-AMINOPTERIN-THYMIDINEMEDIASUPPLEMENT，HAT)蛋白G亲和层析柱，辣根过氧化物酶标记试剂盒，细胞培养板、细胞培养瓶等均为商品化产品。B.1.3基础培养液：DMEM培养基，含1%青链霉素混合液。B.1.4HAT培养液：含10%FBS的DMEM培养液，加HAT至终浓度为2%，含1%青链霉素混合液。B.1.5HT培养液：含10%FBS的DMEM培养液，加HT至终浓度为2%，含1%青链霉素混合液。B.2方法
B.2.1免疫
首免：将猪瘟病毒E2蛋白稀释至100μg/mL，与弗氏完全佐剂等量混合，颈背部皮下多点注射，1mL/只，二免：4~6周后，将浓度为100μg/mL的E2蛋白与弗氏不完全佐剂等量混合，腹腔注射，0.5mL/只；三免：方法同二免；四免：三免2周后，取0.5mL浓度为100μg/mL的E2蛋白直接腹腔免疫小鼠。3d后进行细胞融合。
B.2.2细胞融合
无菌摘取免疫小鼠脾脏，磨碎后，分别用150um和200μm铜网过滤，将收集的细胞用1000r/min离心5min。充上清，沉淀用无血清DMEM重悬，进行细胞计数。将培养好的SP2/O细胞从细胞培养瓶上轻轻吹下，用无血清DMEM培养液重悬，进行细胞计数。将制备的脾细胞和SP2/O细胞按照5：1~8：1的比例混合，1000r/min离心10min，弃上清。吸取1mL50%聚乙二醇1000溶液，缓慢加人（60s内）至细胞中。然后立即在5min内滴加25mL无血清DMEM。1000r/min离心10min，弃上清，加入30mLHAT培养液重悬，分装于96孔细胞培养板中，置含5%二氧化碳37C温箱中培养7d。
B.2.3抗体检测及筛选
定期观察融合后细胞，待细胞培养液上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取100μL细胞上清进行抗体检测。采用有限稀释法对阳性克降孔进行亚克隆，所有操作采用HT培养液进行。置含5%二氧化碳的37C温箱中培养，定期观察，采用相同方法进行抗体检测。亚克隆过程应进行3次~4次。
B.2.4单克隆抗体腹水的制备与纯化GB/T34729—2017
将筛选的杂交瘤细胞进行扩大培养后，收集细胞，进行计数，将细胞浓度调整至1×10°细胞/mL~2×10°细胞/mL，每只老鼠腹腔接种0.5mL。定期观察，待小鼠腹部膨大且有波动感时，用注射器吸取腹水。将采集的腹水于5000r/nin离心10min，取上清，用0.01mol/LpH7.2的磷酸盐缓冲液将腹水稀释10倍，用蛋白G亲和层析柱进行纯化B.2.5酶结合物的制备
将纯化后的单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记试剂盒进行标记，操作步骤按照说明书进行。6酶结合物效价的确定
将酶结合物进行100倍稀释后，再进行2倍梯度稀释。用7.2中制备的抗原包被板进行酶结合物效价测定，将OD值最接近1.0的稀释度作为酶结合物效价。调整酶结合物浓度至终效价的100倍，一20℃分装备用。
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C.1包被液的配制
（规范性附录）
试剂配制
称取碳酸钠1g和碳酸氢钠3g，溶于1000mL去离子水，调节pH至9.4~9.6。C.2磷酸盐缓冲液的配制
称取十二水合磷酸氢二钠3.5g、二水合磷酸二氢钠0.25g和氯化钠8.5g，溶于800mL去离子水中，调节pH至7.2～7.6，用去离子水定容至1000mL。C.3封闭液的配制
称取牛血清白蛋白3g，溶丁100mL磷酸盐缓冲液中。20倍浓缩洗液的配制
称取十二水合磷酸氢二钠70g，二水合磷酸二氢钠5g，氯化钠170.0g，吐温-2016.0mL，加去离子水至800mL，调pH至7.4~7.6，定容至1000mL。121C15min高压灭菌后，室温存放备用。使用前，将20倍浓缩洗液用蒸馏水或去离子水按1：19的比例混合即可。C.5稀释液的配制
量取5.0mL马血清溶于95.0mL磷酸盐缓冲液中。C.6底物液A的配制
称取TMB200mg，无水乙醇（或二甲基亚矾）100mL，加双蒸水至1000mL。C.7底物液B的配制
十二水合磷酸氢二钠14.60g，柠檬酸9.33g0.75%过氧化腺6.4mL，加三蒸水至1000ml，调至pH5.0~-5.4。
终止液的配制
将去离子水与浓盐酸（36%～38%)以9：1的比例混合即可，室温保存。版权专有侵权必究
GB/T 34729-2017
书号：155066：1-57910
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缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CSFV：猪瘟病毒（ClassicalSwineFeverVirus）ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay）HRP：辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase）OD：光密度（OpticalDensity）4试剂
猪瘟病毒E2蛋白：见附录A。
酶结合物：参见附录B。
标准阳性血清：猪瘟疫苗免疫仔猪制备，经荧光抗体病毒中和试验检测为阳性，标准阴性血清：无母源抗体、未免疫猪瘟疫苗的仔猪血清，经荧光抗体病毒中和试验检测为阴性。包被液：见C.1。
磷酸盐缓冲液：见C.2。
封闭液：见C.3。
20倍浓缩洗液：见C.4。
稀释液：见C.5。
底物液A：见C.6。
底物液B:见C.7。
终止液：见C.8。
商品化试剂盒：可选择同类的商品化试剂盒。器材和设备
37℃温箱。
KAoNiKAca
GB/T34729—2017
酶联读数仪
微量移液器（200uL、1000uL）和吸头。5.4
多道移液器（200μL)。
5.5酶联反应板。
一次性注射器（5mL、10mL)。
血清样本的处理
样本采集及处理
采集静脉血时，每头猪使用一个注射器，不同猪的注射器不能混用。进行前腔静脉或耳静脉无菌采血，不少于2mL。室温静置于斜面2h，待自然凝固后，置于2℃~-8℃冰箱中放置不少于2h，4000r/min离心10min。用移液器小心吸出上层血清。6.2血清样本的存放与运送
血清样本在
一周内检测，可置2℃～8℃条件下保存，超过一周，应置一20℃以下冷冻保存。运输
时注意冷藏，确保样品有效
采集的血清样本时用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输，运输时间应尽量缩短。按照兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识7检测步骤
7.1抗原包被：用包被液将亲和层2蛋白稀释不0.2μg/ml
析纯化的E2
2℃~8包被16h，即为抗原包被板。7.2抗原包被板的封闭：包被结束后奔去孔中液体海孔加人
新鲜配制的封闭液3002℃8二封闭24h。300μL，漂洗1次，于吸水滤纸上拍7.3在抗原包被板中加人稀释液50乳被酶联反应板，100μL/孔，
洗液300L，漂洗1次。每孔加人
封闭结束后去孔中液体，海孔加人1倍洗液将待检血清按顺序加人到抗原包被板壳，50μL/孔。同时加入阳性对照及阴性对照血清各2孔，50μL/孔。37℃温箱中反应1h。7.4弃去反应液每孔加人1×洗液300μL，漂洗3次7.5用稀释液将酶结合物稀释100倍，每孔加入100L。37℃温箱中度应1h7.6重复7.4步骤。
将底物液A和B按等体积进行混合，混合后立即加到抗原包被板中，每孔100uL，避光显色10min。
7.8每孔加人100μL终止液。
酶标仪上读取450nm吸光值。
7.10结果计算「见式（1)式（3)：式中：
阴性对照孔平均值；
阴性对照孔1的OD值；
阴性对照孔2的OD值。
N(N,+N,)
(P,+P)
·（2)
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式中：
式中：
阳性对照孔平均值；
阳性对照孔1的OD值；
阳性对照孔2的OD值。
阻断率；
阴性对照孔平均值；
样本OD值。
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7.11试验成立条件：标准阴性对照血清OD450.5，标准阳性对照的阻断率大于50%，该检验结果成立。若试验不成立，应进行重复检测。8结果判定下载标准就来标准下载网
样本的阻断率一40，则该样本可以判为阳性，即有猪瘟抗体存在，如被检样本的阻断如果被检
率≥32%，则该样本可以判为阴性，即无猪度抗体在在如果该样本的阻断率在32%—-40%，则应在14d后对动物进行重新检测
8.2若采用商品化试剂盒，可根据说班书进行操作及结果判定9
注意事项
所有操作应严格遵守生物安全规定9.1
9.2用于加样的移液器应进行校准以免误差过大影响检测结果9.320倍浓缩洗涤液在低温保存时可能会产生百色结晶，应加热使其溶解后再使用9.4底物溶液和终止波对眼晴，皮肤以及呼吸道有刺激作用，使用过程中应穿戴相应的防护用具，防止接触和吸人，
9.5底物溶液应避光保存避免与氧化剂接触，盛装底物溶液的容器应保持干净。9.6所有试剂一律于℃～C保存，使用前恢复至室温。血清稀释板只能使用一次，没用完的血清稀释板应将用过的孔充分洗涤销千，并进行标记，避免下9.7
次检测时发牛混淆。在进行多板检测时，反应板不能善放在37℃温箱中，以免导致各反应板受热不均。37℃反应时，反应板可平放于湿盒内或加封板膜后直接平放于温箱中，但不能采用密封袋，以免导致受热不均。
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GB/T34729—2017
A.1材料和试剂
附录A
（规范性附录）
猪瘟病毒E2蛋白的表达及纯化
猪瘟兔化弱毒疫苗株：大肠杆菌感受态细胞、pFastBac1质粒、DH10Bac感受态细胞，Sf9细胞、质粒提取试剂盒、转染试剂、无血清培养基均为商品化试剂：A.2引物序列
P1-1：5ATAGGATCCACCATGGCATTCCTCATCTGCTTGATAAAAGTATTAAG<3P2-1:5>TAAGCTTACTTGGTACCGTGATGGTGATGGTGATGTCCCATACCAGCGGCGAGTTGTTCTGTTAGAACTACGTAGGTCACTATCAGC<3M13F：5>GTTTTCCCAGTCACGAC<3
M13R：5>CAGGAAACAGCTATGAC<3
A.3方法
A.3.1重组转移载体的构建
猪瘟免化弱毒疫苗株RNA的提取、反转录合成病毒cDNA。再用引物P11和P21扩增猪瘟免化弱毒疫苗株基因，琼脂糖凝胶纯化，将纯化产物和载体pFastbacl分别用BainHI/HindⅢ酶切、连接，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选获得的重组转移载休。A.3.2重组杆粒的构建
将重组转移载体转化DH10Bac感受态细胞，在筛选培养基上行蓝白斑筛选，取白斑培养，用PCR方法进行鉴定，引物为M13F/M13R，月的片段长度为3500bp。A.3.3转染及病毒鉴定
将鉴定正确的克隆菌在培养基中扩大培养，用质粒提取试剂盒提取重组杆粒DNA，用转染试剂转染Sf9细胞，转染后28℃培养96h，获得重组病毒。将病毒液在Sf9细胞上传3代后，以1%的比例感染Sf9细胞，28℃培养96h后，收集培养上清A.3.4猪瘟病毒E2蛋白的纯化
将收集的培养上清12000r/m离心10min，除去细胞碎片，然后将上清用离心超滤法浓缩；浓缩的上清在镍离了亲和层析洗液（50mmol/L磷酸钠、300mmol/L氯化钠，pH7.0）中4C透析过夜。平衡过的上清加入洗液平衡过镍离子亲和层析柱，4吸附30min后，用40mmol/L咪唑洗脱，收集洗脱液。用SDS-PAGE电泳检测纯化效果。A.3.5蛋白浓度测定
用BCA法测定蛋白浓度，按说明配制BSA蛋白标准250pg/mL、125ug/mL、50μg/mL、4
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25μg/mL、5μg/ml、0μg/mL，将E2蛋白稀释10倍，其他均按说明书操作。测定OD592nm，绘制标准曲线，计算E2蛋白浓度。纯化后的E2蛋白浓度应≥0.1mg/nL。A.3.6蛋白纯度测定和特异性测定取5μL、2μL、1μL纯化产物进行SDS-PAGE电泳，用凝胶成像仪中成像并用薄层扫描法测定蛋白纯度，蛋白纯度应90%。同时用猪瘟阳性血清对纯化后的E2蛋白进行Westernblot鉴定和ELISA鉴定，猪瘟阳性血清应仪与日的蛋白发生特异性反应，杂蛋白无反应。TYKAONIKAca
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B.1材料
附录B
（资料性附录）
酶结合物的制备
猪瘟病毒E2蛋白：制备及纯化见附录A。B.1.1
B.1.2弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、6~8周龄BalB/C小鼠、青链霉素混合液（100x），小鼠骨髓瘤细胞（SP2/o）、改良Eagle培养基（Dulbecco'smodificationofEagle'smediumDulbecco，DMEM）、胎牛血清（FetalBovineSerum，FBS）、50%聚乙二醇1000、次黄嘌呤-氨噗呤-胸苷培养基添加物（50×）（HYPOXANTHINE-THYMIDINEMEDIASUPPLEMENT，HT）、次黄嘌岭-氨噪岭-胸苷培养基添加物（5OX）（HYPOXANTHINE-AMINOPTERIN-THYMIDINEMEDIASUPPLEMENT，HAT)蛋白G亲和层析柱，辣根过氧化物酶标记试剂盒，细胞培养板、细胞培养瓶等均为商品化产品。B.1.3基础培养液：DMEM培养基，含1%青链霉素混合液。B.1.4HAT培养液：含10%FBS的DMEM培养液，加HAT至终浓度为2%，含1%青链霉素混合液。B.1.5HT培养液：含10%FBS的DMEM培养液，加HT至终浓度为2%，含1%青链霉素混合液。B.2方法
B.2.1免疫
首免：将猪瘟病毒E2蛋白稀释至100μg/mL，与弗氏完全佐剂等量混合，颈背部皮下多点注射，1mL/只，二免：4~6周后，将浓度为100μg/mL的E2蛋白与弗氏不完全佐剂等量混合，腹腔注射，0.5mL/只；三免：方法同二免；四免：三免2周后，取0.5mL浓度为100μg/mL的E2蛋白直接腹腔免疫小鼠。3d后进行细胞融合。
B.2.2细胞融合
无菌摘取免疫小鼠脾脏，磨碎后，分别用150um和200μm铜网过滤，将收集的细胞用1000r/min离心5min。充上清，沉淀用无血清DMEM重悬，进行细胞计数。将培养好的SP2/O细胞从细胞培养瓶上轻轻吹下，用无血清DMEM培养液重悬，进行细胞计数。将制备的脾细胞和SP2/O细胞按照5：1~8：1的比例混合，1000r/min离心10min，弃上清。吸取1mL50%聚乙二醇1000溶液，缓慢加人（60s内）至细胞中。然后立即在5min内滴加25mL无血清DMEM。1000r/min离心10min，弃上清，加入30mLHAT培养液重悬，分装于96孔细胞培养板中，置含5%二氧化碳37C温箱中培养7d。
B.2.3抗体检测及筛选
定期观察融合后细胞，待细胞培养液上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取100μL细胞上清进行抗体检测。采用有限稀释法对阳性克降孔进行亚克隆，所有操作采用HT培养液进行。置含5%二氧化碳的37C温箱中培养，定期观察，采用相同方法进行抗体检测。亚克隆过程应进行3次~4次。
B.2.4单克隆抗体腹水的制备与纯化GB/T34729—2017
将筛选的杂交瘤细胞进行扩大培养后，收集细胞，进行计数，将细胞浓度调整至1×10°细胞/mL~2×10°细胞/mL，每只老鼠腹腔接种0.5mL。定期观察，待小鼠腹部膨大且有波动感时，用注射器吸取腹水。将采集的腹水于5000r/nin离心10min，取上清，用0.01mol/LpH7.2的磷酸盐缓冲液将腹水稀释10倍，用蛋白G亲和层析柱进行纯化B.2.5酶结合物的制备
将纯化后的单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记试剂盒进行标记，操作步骤按照说明书进行。6酶结合物效价的确定
将酶结合物进行100倍稀释后，再进行2倍梯度稀释。用7.2中制备的抗原包被板进行酶结合物效价测定，将OD值最接近1.0的稀释度作为酶结合物效价。调整酶结合物浓度至终效价的100倍，一20℃分装备用。
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C.1包被液的配制
（规范性附录）
试剂配制
称取碳酸钠1g和碳酸氢钠3g，溶于1000mL去离子水，调节pH至9.4~9.6。C.2磷酸盐缓冲液的配制
称取十二水合磷酸氢二钠3.5g、二水合磷酸二氢钠0.25g和氯化钠8.5g，溶于800mL去离子水中，调节pH至7.2～7.6，用去离子水定容至1000mL。C.3封闭液的配制
称取牛血清白蛋白3g，溶丁100mL磷酸盐缓冲液中。20倍浓缩洗液的配制
称取十二水合磷酸氢二钠70g，二水合磷酸二氢钠5g，氯化钠170.0g，吐温-2016.0mL，加去离子水至800mL，调pH至7.4~7.6，定容至1000mL。121C15min高压灭菌后，室温存放备用。使用前，将20倍浓缩洗液用蒸馏水或去离子水按1：19的比例混合即可。C.5稀释液的配制
量取5.0mL马血清溶于95.0mL磷酸盐缓冲液中。C.6底物液A的配制
称取TMB200mg，无水乙醇（或二甲基亚矾）100mL，加双蒸水至1000mL。C.7底物液B的配制
十二水合磷酸氢二钠14.60g，柠檬酸9.33g0.75%过氧化腺6.4mL，加三蒸水至1000ml，调至pH5.0~-5.4。
终止液的配制
将去离子水与浓盐酸（36%～38%)以9：1的比例混合即可，室温保存。版权专有侵权必究
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书号：155066：1-57910
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