GB∕T 34748-2017 水产种质资源基因组DNA的微卫星分析 GB∕T34748-2017 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

ICS65.150
中华人民共和国国家标准
GB/T34748—2017
水产种质资源基因组DNA的微卫星分析Genetic diversity analysis on aquatic germplasm by genomic DNA microsatellitemarkers
2017-11-01发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2018-05-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草GB/T34748—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国水产标准化技术委员会淡水养殖分技术委员会（SAC/TC156/SC1)归口。本标准起草单位：中国水产科学研究院黑龙江水产研究所。本标准主要起草人：匡友谊、孙效文、郑先虎、梁利群。1
1范围
水产种质资源基因组DNA的微卫星分析GB/T347482017
本标准规定了水产种质资源基因组DNA的微卫星分析的试剂与材料、仪器与设备，分析步骤及数据分析。
本标准适用于水产种质资源基因组DNA的微卫星分析。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18654.15养殖鱼类种质检验第15部分：RAPD分析3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
微卫星
microsatellite
真核生物基因组中由两个或多个核苷酸重复排列形成的短串联重复序列。3.2
Fmicrosatelliteanalysis
微卫星分析
用微卫星标记引物对基因组DNA进行扩增，扩增产物经凝胶电泳检测后，分析电泳图谱并计算其中蕴涵的遗传多态性信息。
4试剂与材料
除GB/T18654.15规定的试剂与材料外，以下试剂和材料是本标准所需的。除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和双蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。4.1去离子超纯水：须高压灭菌。4.2
TEMED：于4℃C冰箱中保存。
微卫星标记引物：配制方法符合附录A。4.4
丙烯酰胺：DNA测序级。
4.5甲叉双丙烯酰胺：DNA测序级。4.6尿素。
去离子甲酰胺。
聚丙烯酰胺凝胶存储液：配制方法符合附录A，4.8
10%（质量体积比）过硫酸铵（APS）溶液：配制方法符合附录A4.10
聚内烯酰胺凝胶固定液：配制方法符合附录A。聚丙烯酰胺凝胶染色液：配制方法符合附录A。1
GB/T34748—2017
4.12聚丙烯酰胺凝胶显色液：配制方法符合附录A。4.13电泳载样液：配制方法符合附录A。4.14基因组DNA提取试剂盒：从生物试剂供应商处购买。1XTrisEDTA（TE)：配制方法符合附录A。4.15
5仪器与设备
除GB/T18654.15规定的仪器与设备外，以下仪器与设备是本标准所需的。扫描仪或光密度扫描成像仪。
垂直电泳槽1套。
DNA测序电泳槽1套，
高压恒功率电泳仪1套。
自动测序仪或遗传分析仪。
水平转动脱色摇床。
6抽样
试验生物抽样按照GB/T18654.15的规定执行，样本量宜40个以上。7分析步骤
基因组DNA提取
可用基因组DNA提取试剂盒或已被验证可以抽提到高质量基因组DNA的方法或按GB/T18654.15的规定提取基因组DNA。若用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA按说明书操作。基因组DNA纯度及浓度测定
按GB/T18654.15的规定执行
7.3微卫星标记的选择
从受检测物种或近缘种中筛选出扩增稳定、重复性好且具有多态性的微卫星标记用于基因组DNA的微卫星分析。微卫星标记应遵循哈代温博格平衡，微卫星标记所含等位基因数宜在4个以上，微卫星标记数量应遵循标记数量增加而有效等位基因、期望杂合度、多态性信息含量等不发生显著变化时最少标记的数量，一般为25个～30个。7.4基因组DNA的PCR扩增
7.4.1基因组DNA的准备
根据7.2基因组DNA纯度和浓度测定结果，取部分DNA用灭菌的超纯水稀释至50ng/uL，于4℃中保存备用，其余放一20℃冰箱中保存7.4.2微卫星标记引物的准备
根据7.3的原则选择微卫星标记，将合成的引物配制成100umol/μL的保存液，于一20℃冰箱中保存备用。使用时取部分保存液，配制成10umol/μL使用液，也可按所需倍数稀释后使用，保存液仍2
放回一20℃冰箱中保存。
7.4.3PCR体系
按照GB/T18654.15的规定执行。7.4.4PCR程序
GB/T34748—2017
按下列程序进行扩增：第一个程序94℃预变性3min～10min后，第二个程序94℃30s，退火30s（根据不同引物的退火温度设定），72℃30s，20个～38个循环，第三个程序72℃延伸5min～10min。可根据具体反应调节PCR程序，使扩增效果送到最优。扩增产物直接电泳或于4℃暂时保存（一般不超过6h）至电泳。如需长时间保存，可在一20℃冰箱中保存。
7.5PCR产物凝胶电泳检测
7.5.1电泳检测方法
使用非变性聚丙烯酰胺凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶进行PCR产物凝胶电泳检测，或用自动测序仪或遗传分析仪进行PCR产物检测。7.5.2非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测7.5.2.1非变性聚丙烯酰胺凝胶制备将胶模玻璃板清洗干净，自然晾干后根据电泳槽设备说明书安装胶模根据检测PCR产物大小的范围，选择合适的非变性聚内烯酰胺凝胶浓度，一般使用6%～12%浓度的凝胶。量取适量聚内烯酰胺凝胶存储液，加人TBE缓冲液，用去离子水定容至所需体积，使TBE缓冲液终浓度为1X。每毫升加人7uL10%APS溶液和1uLTEMED，搅拌均匀后，迅速灌胶.插人梳子，在灌胶及插人梳子时注意不要产生气泡。于室温放置30min～60min，待凝胶完全凝固后进行预电泳。
7.5.2.2电泳样品的准备
取PCR产物10μL，加人2μL5μL电泳载样液，混勾，放于4℃备用，其余的PCR产物放于一20℃中保存，以备复查。
7.5.2.3电泳
将凝固好的非变性聚丙烯酰胺凝胶装人垂直电泳槽中，倒入1XTBE电泳缓冲液.清洗加样孔.220V恒压4℃～10℃下预电泳30min。之后关闭电泳仪电源，取1μL～8pL电泳样品上样到凝胶的样品孔中，样品孔的两边和凝胶中间各加一个DNAMARKER作为计算分子量的标准样，在1V/cm～8V/cm恒压4℃~10℃下电泳。
在电泳载样液中的指示剂到达合适的位置时，关闭电泳仪。7.5.2.4染色
聚丙烯酰胺凝胶一般采用银染，在染色的各步骤操作中，凝胶均应置于水平转动摇床上使之缓慢摇动。
固定：将凝胶从玻璃板的胶模中取出，用蒸馏水冲洗2次～3次，放人盛有固定液的盘中浸泡10 min~30 min。
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染色：倒掉固定液，用去离子水冲洗凝胶3次，每次5min，倒人染色液，浸泡10min30min。显色：染色结束后，将染色液倒人回收瓶中（可重复使用1次～2次）。凝胶用去离子水冲洗3次～5次，倒入预冷的显色液，浸泡2min～5min。当出现明显的条带后倒掉显色液，用去离子水冲洗2次~3次，即可进行成像拍照。
7.5.2.5成像
利用扫描仪或光密度扫描仪扫描凝胶成像，或用数码相机进行拍照，记录图像和处理信息。成像后可将凝胶制成干胶保存，以备建档和复查。7.5.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测7.5.3.1变性聚丙烯酰胺凝胶制备将胶模玻璃板清洗十净，自然晾十后根据电泳槽设备说明书安装胶模。根据检测PCR产物大小的范围，选择合适的变性聚丙烯酰胺凝胶浓度，一般使用4%～12%浓度的凝胶。量取适量聚丙烯酰胺凝胶存储液，加人TBE缓冲液，和质量体积比为42%的尿素，也可根据需要加人体积比为25%或40%的去离子甲酰胺，用去离子水定容至所需体积，使TBE缓冲液终浓度为1×。每毫升加人7μL10%APS溶液和1μLTEMED，搅拌均勾后，迅速灌胶，插人梳子，在灌胶及插人梳子时注意不要产生气泡。于室温放置2h以上，待凝胶完全凝固后进行预电泳。7.5.3.2电泳样品的准备
取PCR产物2uL～5uL，按PCR产物和去离子甲酰胺载样液比例为1：1～1：5的体积比加人适量的去离子甲酰胺电泳载样液，混匀，在95℃下变性10min，迅速放人冰水中冷却10min后立即加样。其余的PCR产物放于一20℃中保存，以备复查。7.5.3.3电泳
将凝固好的变性聚丙烯酰胺凝胶装人垂直电泳槽中，倒人1XTBE电泳缓冲液，清洗加样孔，30W~80W恒功率下预电泳30min，使凝胶温度上升至45℃～50℃。之后关闭电泳仪电源，再次清洗加样孔，取3μL8μL样品上样到凝胶的样品孔中，样品孔的两边和凝胶中间各加一个DNAMARKER作为计算分子量的标准样。在30W～80W恒功率下电泳，保持凝胶温度在45℃～50℃。7.5.3.4染色
变性聚丙烯酰胺凝胶采用银染法进行染色，按7.5.2.4的规定执行。7.5.3.5成像
按7.5.2.5的规定执行。
7.5.4自动测序仪或遗传分析仪基因分型分析利用自动测序仪或遗传分析仪进行PCR产物基因型检测具体操作按自动测序仪或遗传分析仪操作手册或说明书执行。
8图象处理及数据分析
采用图谱分析软件分析电泳图谱，根据分子量标准计算出每条扩增条带的大小，确定每个引物扩增4
的等位基因数和样本的基因型，进行遗传参数的计算（符合附录B）。建档
对实验设计、方法、步骤、电泳图谱、分析结果等建立详细的档案（参见附录C）。GB/T34748—2017
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A.1微卫星标记引物
附录A
（规范性附录）
基因组DNA微卫星分析试验溶液的配制微卫星标记引物合成后，每OD加入适量体积的灭菌1×TE溶解，配制成100μmol/L的母液，放于一20C中保存备用。或采用自动测序仪或遗传分析仪进行PCR产物基因型分析，则合成引物时需按照自动测序仪或遗传分析仪的要求在5，未端进行荧光或其他标记物的修饰，若进行荧光修饰，则需避光保存。
A.2聚丙烯酰胺凝胶存储液
内烯酰胺和甲叉双内烯酰胺按照一定的交联度配制成质量浓度比为30%或45%或其他浓度的存液，需用孔径为0.45um的硝酸纤维素膜过滤。或直接购买预先混合好的丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺溶液或粉末，若为粉末，则按浓度比用去离子水直接溶解即可。45%的聚丙烯酰胺凝胶存储液配制为：丙烯酰胺434g，甲叉双丙烯酰胺16g，加人离子水600mL后加热至37C溶解，冷却至室温后用去离子水定容至1L，用孔径为0.45m的硝酸纤维素膜过滤，室温存储于棕色瓶中。
A.310%（质量体积比）过硫酸铵（APS）溶液称取0.1g过硫酸铵放人1.5mL离心管中，加人1mL去离子超纯水，震动，充分溶解，于4℃保有备用，一般现配现用
A.4聚丙烯酰胺凝胶固定液
体积比为10%乙醇和0.5%冰醋酸的混合液。配制500mL固定液，量取50mL乙醇，2.5mL冰乙酸，然后用去离子超纯水定容至500mL。也可根据各自实验室的经验配制：A.5聚丙烯酰胺凝胶染色液
0.1%（质量体积比）硝酸银：称取0.5g硝酸银，400mL去离子超纯水充分溶解后，定容至500mL，于棕色瓶于常温下密闭放置，可以重复使用2次一3次。也可根据各自实验室的经验配制。A.6聚丙烯酰胺凝胶显色液
配制500mL显色液：称取10gNaOH0.2gNaHCO3，加人400mL去离子超纯水，充分溶解后，加人5mL甲醛溶液，定容至500mL。显色液一般现配现用，配制好后放人一20℃冰箱中预冷30min若有未使用的显色液，放入4℃冰箱中保存，以供下次使用。也可根据各自实验室的经验配制。6
电泳载样液
GB/T34748—2017
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳一般使用蔗糖溴酚蓝溶液或者购买TaqDNA聚合酶时自带的载样液，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳一般采用去离子甲酰胺变性载样液蔗糖溴酚蓝溶液配制如下：0.25%溴酚蓝，40%（质量浓度）蔗糖，充分溶解后，过滤，分装4℃保存备用。
去离子甲酰胺变性载样液配方如下：98%
10mmol/L
去离子甲酰胺（体积比）
EDTA(pH8.0)
溴酚蓝
二甲苯氰
1×TrisEDTA(TE)
49mL（100%去离子甲酰胺溶液）1mL(0.5mol/LEDTApH8.0)
1mmol/LEDTA，10mmol/LTris-Cl溶液，调节pH值至7.5。7
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附录B
（规范性附录）
微卫星分析相关遗传参数计算公式微卫星电泳图谱经过软件分析后，得到各等位基因大小，及每个个体扩增的等位基因，以此获得个体的基因型数据。采用基因型数据分析软件或手工计算出每个位点各等位基因的基因频率、等位基因数量、有效等位基因数量、预测杂合度、期望杂合度、多态性信息含量及位点的哈代温博格平衡检验。以下公式假设群体共有N个个体的样品，每个座位检测出了m个等位基因。B.1基因频率(P,)：
P,=(2N.+N,)/2N
式中：
第；个等位基因的基因频率；
含有第1个等位基因的纯合个体数；含有第个等位基因的杂合个体数；总个体数。
B.2观测等位基因数（A。）：
A。=mwww.bzxz.net
式中：
观测等位基因数；
检测出的等位基因数。
B.3有效等位基因数（A。）：
式中：
有效等位基因数；
等位基因数量；
第个等位基因的频率，按式(B.1)计算。B.4观测杂合度（h。）：
h。=HN/N
式中：
观测杂合度；
某一位点上含有杂合基因型的个体数；个体数。
B.5期望杂合度（h。）：
式中：
期望杂合度；
等位基因数量；
第个等位基因的频率，按式(B.1)计算B.6多态性信息含量（PIC)：
1=11=1+1
+（B.3）
.....(B.5)
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