GB/T 34750-2017 副猪嗜血杆菌检测方法 GB/T34750-2017 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T34750—2017
副猪嗜血杆菌检测方法
Detection methods for haemophilus parasuis2017-11-01发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2018-05-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。GB/T34750—2017
本标准起草单位：河南省动物疫病预防控制中心、河南省农业科学院畜牧兽医研究所、河北农业大学动物科技学院、山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准起草人：吴志明、闫若潜、张健、赵明军、赵雪丽、宋勤叶、徐引弟、王东方、王淑娟、安春霞刘梅芬、张盼盼、谢彩华、高风山、方先珍、吴家强、拜廷阳、王一、刘淑敏I
1范围
副猪嗜血杆菌检测方法
GB/T34750—2017
本标准规定了副猪嗜血杆菌的分离与鉴定、巢式PCR检测和实时荧光PCR检测方法。本标准适用于对猪的肺脏、心脏、脑等组织，胸腔、腹腔、心包积液或关节液，抗凝血，细菌培养物等样品中副猪嗜血杆菌的检测。
缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp：碱基对（BasePair）
DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid)dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（DeoxyribonucleosideTriphosphates）MGB：小沟结合（MinorGrooveBinder)NAD：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NicotinamideAdenineDinucleotide）PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSolution）PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）Taq酶：TagDNA聚合酶（TaqDNAPolymerase)）TE：Tris-EDTA缓冲液(Tris-EDTABuffer)TSA：胰蛋白陈大豆琼脂（TrypticSoyAgar）TSB：胰蛋白陈大豆肉汤（TrypticSoyBroth）3仪器
生物安全柜。
恒温培养箱。
光学显微镜。
全自动微生物鉴定仪。
PCR扩增仪。
高速冷冻离心机(12000×g以上）。核酸电泳仪和水平电泳槽。
恒温水浴锅。
单道微量移液器（0.5μL~10μL；2μ~20μ；20u200μL；100μ1000μL）。组织匀浆器或研钵。
凝胶成像系统（或紫外投射仪）。实时荧光定量PCR仪。
4耗材
4.11.5mL无菌离心管。
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GB/T34750—2017
4.20.2mLPCR薄壁管或八联管。
5试剂
5.1TSA培养基和TSB培养基（见附录A)。5.2NAD贮存液（见附录A），2C～8℃条件下保存。5.3革兰氏染色试剂：含草酸铵结晶紫染液、卢戈氏（Lugol)碘液、95%乙醇和沙黄（蕃红）染液，常温条件下保存。
5.4葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖、木糖等微量生化鉴定管，2C~8C条件下保存。5.53%过氧化氢，0.8%磺胺酸冰酷酸溶液、0.5%茶胺乙醇溶液、0.1%盐酸二甲基对苯二胺（见附录A)，常温条件下保存。Www.bzxZ.net
5.6消化液I和TE缓冲液（见附录B），常温条件下保存。5.71XTAE核酸电泳缓冲液、酚-氯仿-异戊醇混合液（25+24+1).0.01mol/L(pH7.2）的PBS、阿氏液等试剂（见附录B，6×电泳上样缓冲液，75%乙醇，以上试剂2℃~8条件保存。5.8组织悬液销化液Ⅱ（见附录B），异丙醇，DNA标准分子量，置一20℃保存。5.9阳性对照、阴性对照（见附录B)。5.10巢式PCR扩增用下游时物序列（见附录5.11副猪皆血杆菌巢式PCR检测反应体系见附录D5.12副猪嗜血杆菌实时炭光PCR护增用上游引物及探序列（见附录
5.13副猪嗜血杆菌实时荧光PCR检测反应体系（参见附录E）6细菌分离与鉴定
6.1样品的采集
无菌采集疑似副猪嗜血杆菌感染病死猪的肺肌心脏，脑等新鲜组织，胸腔、腹腔、心包积液或关节液，抗凝血等样品。采集或处理的样品在2（：条件下保存应不超过24h。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加水密封，运送到实验室。6.2分离培养
6.2.1在生物安全柜中用接种环无菌蘸取样品划线接种于TSA固体培养基上，37℃培养24h~48h，使之形成菌落，以供鉴定用。
6.2.2取6.2.1中培养的针尖人小（直径约1mm～2mm）圆形、降起、光滑湿润、无色透明、边缘整齐的小菌落，在TSA固体培养基上进行划线接种纯增养，37C培养24h~48h后，出现上述小菌落，6.3涂片染色镜检
6.3.1涂片在载玻片上滴加1～2滴灭菌蒸馏水后，挑取纯培养的小菌落与灭菌蒸馏水混匀并涂成薄菌膜。
6.3.2干燥将涂片于空气中白然晾干。6.3.3固定将已干燥的载玻片涂面朝上，在酒精灯火焰上通过5次～6次进行固定。6.3.4染色采用革兰氏染色法进行染色，具体操作按照革兰氏染色试剂盒说明书进行，置1000倍（10×100）光学显微镜下观察。6.3.5镜检副猪嗜血杆菌为革兰氏染色阴性短杆状或球杆状小杆菌，菌体大小不等，约0.5μm×（1.5um～2.0um），以纤细杆状居多、无鞭毛，不形成芽孢。2
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6.4“卫星生长现象”试验
GB/T34750—2017
在生物安全柜中无菌挑取纯化培养后的单个菌落，平行划线于无NAD的绵羊鲜血平板上，再挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线，37℃条件下培养24h～48h后，观察菌落生长情况，副猪嗜血杆菌无溶血，并具有“卫星生长现象”（金黄色葡萄球菌周围的副猪嗒血杆菌菌落较大，而远离葡萄球菌的副猪嗜血杆菌菌落较小)。
6.5增殖培养
在生物安全柜中无菌挑取具有“卫星生长现象”且不溶血的单菌落在TSA固体培养基上进行再次纯培养后，挑取单个菌落接种于5mLTSB液体培养基中，37C培养24h~48h后，液体变混浊，判为增殖培养成功
6.6生化鉴定
6.6.1糖类发酵试验
在生物安全柜中无菌将生化鉴定管打开，每管按10μ/mL终浓度加入NAD，用接种针无菌挑取6.5中增殖培养的菌液分别接种于葡萄糖、乳糖、半乳糖、甘露醇、木糖等微量生化鉴定管中，37℃培养24h，观察结果，发酵葡菊糖、半乳糖，不发酵乳糖甘露醇、木糖者为阳性，否则为阴性。6.6.2触酶试验
吸取6.5中增殖培养的菌液1滴于洁净玻片上，然后滴加1滴3%过氧化氢混匀，30s内观察反应结果，立即出现大量气泡者判为阳性，无气泡者判为阴性。6.6.3硝酸盐还原试验
将0.8%磺胺酸冰醋酸溶液和0.5%α-茶胺乙醇溶液各0.2mL混合，取混合试剂0.1mL加至6.5中增殖培养菌液中，立即观察结果，呈现红色者为阳性，无红色出现者为阴性6.6.4尿素酶试验
吸取6.5中增殖培养的菌液100L按种于尿素酶试验液体培养基管中，摇勾，于37℃培养10min，60min和120min后分别观察结果，粉红色者判为阳性，不变色者判为阴性。6.6.5氧化酶试验
吸取6.5中增殖培养菌液1滴丁洁净载玻片上，加盐酸二甲基对苯二胺溶液1滴，2min内观察结果，呈现鲜蓝色者判为阳性，2min内不变色者判为阴性。6.6.6全自动微生物鉴定仪鉴定
按照全自动微生物鉴定仪使用说明书将6.5中增殖培养的细菌进行微生物鉴定。6.6.7结果判定
糖类发酵试验结果为发酵葡萄糖、半乳糖，不发酵乳糖、甘露醇、木糖；触酶、硝酸盐还原试验结果均为阳性；尿素酶、氧化酶试验结果均为阴性的判定为副猪嗜血杆菌阳性；或全自动微生物鉴定仪鉴定结果为副猪嗜血杆菌阳性的，判定为副猪嗜血杆菌阳性，3
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GB/T34750——2017
7副猪嗜血杆菌巢式PCR检测
7.1样品的采集、处理、存放和运送7.1.1样品的采集和处理
组织样品
采取有明显病变的肺脏、心脏、脑等新鲜组织样品。用无菌剪刀和镊子剪取待检样品0.5g左右于组织匀浆器或研钵中充分勾浆或研磨，加入0.3mL~0.5mLPBS混匀，将组织悬液转人无菌离心管中，编号备用。
7.1.1.2积液
用无菌注射器采集胸腔，腹腔积液或关节液2mL～3mL，转至无菌离心管中，编号备用。7.1.1.3
抗凝血
用无菌注射器先吸人抗疑剂阿氏液后转入无菌离心管中，编号备用。7.1.1.4
增菌培养物
用无菌滴头吸取增菌磨养物500江于无菌离心管7.1.2存放和运送
采集或处理的样品在2
温桶加冰密封，运送到实验
2样品DNA的制备
8工条件下保
警示：酚-氯仿-异戊醇具有毒性，小心操作！手静脉或前腔静脉采集等量血液，快速混勺编号备用
采集的样品密封后，采用保温壶或保7.2.1取1.5mL无菌离心管，于各管中分别加人待测样品、阴性对照、阳性对照各100μL，再加入500L消化液I和1L消化液I，吸头反复吸打混匀（一份样品换用一个吸头）；置55℃水浴30min-1h.
7.2.2分别加人500uL酚-氯伤异戊醇混合液，混勾，于4℃条件下12000r/min离心10min。7.2.3分别吸取离心后的上清液转移至新的1mL无菌离心管中（注意不要碰到中间层），加入等体积一20℃预冷的异丙醇，混匀，室温放置15min。7.2.44℃条件下12000r/min离心15min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加人70075%乙醇，轻轻混匀。
7.2.54℃条件下12000r/min离心5min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）：轻轻倒去上清液：倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。7.2.64℃条件下12000r/min离心30s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样品换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀面，真空抽干3min5min或室温干燥10min。7.2.7加入10uLTE缓冲液，轻轻混勾，溶解DNA，2000r/min离心5s，置一20C冻存备用。7.2.8样品DNA的制备可采用上述提取方法也可采用商品化的试剂盒提取。4
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7.3巢式PCR扩增
7.3.1第一轮PCR扩增
GB/T34750—2017
7.3.1.1配制PCR反应体系I（见附录D），室温融化后，瞬时离心使液体全部聚集在管底部，向每管中加入7.2.7中相应DNA2μL，经充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底。7.3.1.2PCR扩增条件95℃预变性5min后，94℃45s，58℃45s，72℃45s共35个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后取出置于2℃～8℃条件下保存。7.3.2第二轮PCR扩增
7.3.2.1配制PCR反应体系Ⅱ室温融化后，瞬时离心使液体全部聚集在管底部，向每管中加人7.3.1.2中相应的PCR产物2μL，经充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底。7.3.2.2PCR扩增条件同7.3.1.2。7.4：PCR扩增产物的电泳检测
称取1.2g琼脂糖加入100mL核酸电泳缓冲液中加热至沸腾，充分溶化后放凉至50℃左右，加人核酸染色剂10uL，混勾，倒人胶槽制备凝胶板。在电泳槽中加入1×TAE核酸电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。分别取样品PCR扩增产物、阴/阳性对照扩增产物10L和2μL6X电泳上样缓冲液混合后，分别加样到各凝胶孔中，取5μLDNA分子量标准加到一凝胶孔中。5V/cm恒压下电泳30min左右，将电泳好的凝胶置紫外投射仪或凝胶成像系统中观察结果，进行判定并做好试验记录。7.5结果判定
试验结果成立条件
副猪嗜血杆菌阳性对照的巢式PCR扩增产物电泳后在312bp位置出现特异性条带，同时阴性对照的PCR扩增产物电泳后没有任何条带（参见附录F），则试验结果成立；否则结果不成立。7.5.2阳性判定
在试验结果成立的前提下，如果样品的PCR产物电泳后在312bp位置上出现特异性条带，判定为副猪嗜血杆菌核酸检测阳性。
7.5.3阴性判定
在试验结果成立的前提下，如果样品在312bp位置未出现特异性条带，判定为副猪嗜血杆菌核酸检测阴性。
8副猪嗜血杆菌实时荧光PCR检测8.1样品的采集、处理、存放及运送样品的采集、处理、存放及运送应符合7.1的规定。8.2样品INA的制备
样品DNA的制备应符合7.2的规定。5
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8.3实时荧光PCR扩增
8.3.1在检测区配制与8.2中相同数量的实时荧光PCR反应体系，向每管中加人8.2中相应DNA2uL，充分混匀后并使液体全部聚集于管底，按照要加样品的顺序摆放好实时荧光PCR反应管8.3.2将8.3.1中加样后的实时荧光PCR反应管放入实时荧光定量PCR仪内并记录样本摆放顺序。8.3.3反应参数设置：第一阶段，预变性94℃/5min；第二阶段，94℃/30s，60℃/30s，40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号收集，荧光模式设为FAM/NONE双标记模式。8.4结果判定
8.4.1结果分析条件设定
读取检测结果，阅值设定原则以阅值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。
8.4.2质控标准
阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，且C.值>32.0或无；阳性对照的C，值应≤29.0，且出现特定的扩增曲线（参见附录F）：如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件，此次实验视为无效。8.4.3结果描述及判定
8.4.3.1阳性
C,值≤29.0，而且出现特定的扩增曲线，则判定为阳性。8.4.3.2
2阴性
C,值32.0或无，并月无特定的扩增曲线，则判定为阴性，8.4.3.3
3可疑
29.08.4.3.4无效扩增
如果阳性对照没有扩增曲线，或者阴性对照有C，值32.0的扩增曲线，判定本次实验无效，需要分析试验失败原因，并重新试验。6
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（规范性附录）
副猪嗜血杆菌分离培养和生化鉴定试剂的配制A.1TSA固体培养基的配制
GB/T34750—2017
称取TSA40g，加人940mL蒸馏水，充分摇匀后加热至充分溶解，121℃高压蒸汽灭菌A.1.1
A.1.2冷却至45C左右，加入50mL过滤除菌的小牛血清、10mL过滤除菌的1%NAD,充分摇匀后制备固体培养平板，2℃～8“C条件下保存。A.2TSB液体培养基的配制
称取TSB30g，加入949mL蒸馅水，加热至充分溶解后摇匀，121℃高压蒸汽灭菌15min，2℃～8℃条件下保存。
使用前，加人50mL过滤除菌的小牛血清、1mL过滤除菌的1%NAD，A.2.2
3NAD购备液的配制
称取1gNAD溶解于100mL蒸馏水中，充分摇勾溶解后，用0.22um的细菌滤器过滤，分装于无菌离心管中，置一20℃保存备用。A.4硝酸盐还原试验试剂的配制
称取磺胺酸0.8g·加入100mL冰醋酸配制成0.8%磺胺酸冰酷酸溶液；称取0.5gα茶胺，加入100mL乙醇，配制成0.5%α-茶胺乙醇溶液。50.1%二盐酸二甲基对苯二胺溶液的配制A.5
称取二盐酸二甲基对苯二胺0.1g，加人10mL蒸馏水，即可配制成0.1%二盐酸二甲基对苯二胺溶液。
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B.1消化液I的配制
附录B
（规范性附录）
副猪嗜血杆菌巢式PCR和实时荧光PCR检测试剂的配制Tris-HCI(pH8.0)终浓度10mmol/L；EDTA（pH8.0）终浓度25mmol/L;SDS终浓度200μg/mL；NaCl终浓度100mmol/L。
B.2TE缓冲液的配制
Tris-HCl（pH8.0)终浓度为10mol/L，EDTA（pH8.0)终浓度为1mol/L，B.31×TAE核酸电泳缓冲液的配制Tris碱，24.2g：冰乙酸，5.71mL；0.5mol/LEDTA（pH8.0），10ml，加蒸馏水至100mL，使用时用蒸馏水作50倍稀释，即为1XTAE核酸电泳缓冲液。B.4
酚-氯仿-异戊醇溶液的配制
Tris饱和酚-氯仿-异戊醇按25：24：1的比例混合。0.01mol/L(pH7.2)的磷酸盐缓冲液（PBS)的配制B.5
B.5.1A液（0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液）：NaH,PO，·H.O27.6g，用适量蒸馏水溶解，定容至1000mL。
B.5.2B液（0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液）：Na,HPO，·12H2O71.6g，用适量蒸馅水溶解，定容至1000mL。
B.5.30.01mol/LPBS的配制：A液14mL，B液36mL，加NaCl8.5g，用蒸馏水定容至1000mL；121C高压火菌15min，4℃保存备用。B.6
阿氏液的配制
葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.8g，柠檬酸0.055g，氯化钠0.42g，加蒸馏水定容至100ml，溶解后调pH至6.1，69kPa，15min高压灭菌，4C保存备用。B.7
组织悬液的配制
在0.01mol/LPBS液中添加青霉素（2000IU/mL），链霉素（2mg/mL）、庆大霉素（50pg/mL）和制霉菌素（1000IU/mL），置一20℃保存备用。8
B.8消化液Ⅱ的配制
称取100Ing蛋白酶K溶解于5mL灭菌水中。B.9阳性对照
灭活的副猪嗜血杆菌标准菌株。B.10阴性对照
灭菌的TSB培养基
GB/T34750—2017
GB/T34750—2017
附录C
（规范性附录）
副猪嗜血杆菌巢式PCR和实时荧光PCR检测方法所用引物序列c.1
副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增用上、下游引物序列副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增用上、下游引物序列见表C.1。副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增用上、下游引物序列表c.1
引物名称
第一轮PCR扩增上游引物P1
第一轮PCR扩增下游引物P2
第二轮PCR扩增上游引物P3
第二轮PCR扩增下游引物P4
浓度/(μmol/L)
引物序列
5'-TCGGTGATGAGGAAGGGTGA-3
5TCGTCACCCTCTGTATGCAC3
5'-AGGGTGGTGTTTTAATAGAGCAC3
5'-CACATGAGCGTCAGTATTTTCC-3
副猪嗜血杆菌实时荧光PCR检测方法所用上、下游引物及探针序列c.2
副猪嗜血杆菌实时荧光PCR检测方法所用上，下游引物及探针序列见表C.2。表C.2副猪嗜血杆菌实时荧光PCR扩增用上、下游引物及探针序列引物名称
实时荧光PCR扩增上游引物
实时荧光PCR扩增下游引物
实时荧光PCR扩增MGB探针
浓度/(μmol/L)
引物序列
5'AGCAGCCGCGGTAATACG-3
5'-CCTTTACGCCCAGTCATTCC-3
FAM-5'-AGGGTGCGAGCGT-3'-MGB
扩增片段大小
P1/P2引物对
扩增片段
820bp;
P3/P4引物对
扩增片段
扩增片段大小
P1/P2引物对扩
增片段
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