GB/T 35024-2018
基本信息
标准号： GB/T 35024-2018
中文名称：常见畜禽动物成分检测方法 液相芯片法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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相关单位信息
标准简介
GB/T 35024-2018 常见畜禽动物成分检测方法 液相芯片法
GB/T35024-2018
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标准内容
ICS67.120.10
中华人民共和国国家标准
GB/T350242018
常见畜禽动物成分检测方法
液相芯片法
Detection method of mammals and poultry ingredients-Suspended bead array
2018-05-14发布
国家市场监督管理总局
中国国家标准化管理委员会
2018-12-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由全国生物芯片标准化技术委员会（SAC/TC421)提出并归口。GB/T35024—2018
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：陈颖、吴亚君、杨艳歌、韩建勋、刘鸣畅、王斌、黄文胜、曹际娟、王、张舒亚、高宏伟。
1范围
常见畜禽动物成分检测方法
液相芯片法
本标准规定了畜禽产品中常见动物物种成分的液相芯片检测方法GB/T35024—2018
本标准适用于肉及加工品、乳、皮张、内脏，动物饲料等奋禽产品中哺乳动物和反负动物成分，和13种常见肉品或掺杂成分（骆驼、马、驴、耗牛、水牛、狗、猪、马鹿、羊、鸡、鸭、大鼠、小鼠）动物物种成分的定性检测。方法的最低检出限为（质量百分比）：水牛5%，哺乳、反台、狗、羊、鸡、大鼠、小鼠为1%，骆驼、耗牛、马鹿、猪、马、驴、鸭的最低检测限为0.1%。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样
GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T3561国境口岸卫生监督食品采样、送样规程3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
suspendedbeadarray
液相芯片技术
通过液相杂交将偶联有探针的微球与样品中靶基因序列结合，通过流式细胞技术对样品中的多种目标成分进行同时检测。
液相芯片探针
suspended array probe
固定于微球表面，能与目标成分亲和结合用于探测目标成分信息的核酸或蛋白分子。3.1.3
+quality control probe
质控探针
用来监控芯片反应是否正常的探针。注：本标准使用的是人工合成的一段赛核苷酸探针（polyTzopolyAz。,5'端氮基标记）。3.1.4
median fluoresence intensity荧光强度中位值
液相芯片检测仪检测到的样品荧光信号值，即软件自动读取与样品结合的微球数量，并进行背景值校正后得到的数值。
GB/T35024—2018
值cutoff value
判定阳性信号的最低荧光强度中位值。通过实验数据统计分析后得出，要求防止假阳性结果，同时保证灵敏度需求。
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid)dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate)dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate）dGTP：脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphate)dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidine triphosphate）EDC:1-乙基
二甲基氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐[N-(3-dimethylaminodipropyl）-N'-ethylcar-3
bodiimade]
EDTA:Z
二胺四乙酸（ethyle
MES：2-吗咻Z磺酸[2N-morpholino-cthaneulfonicacid]SA-PF链君亲和素-藻红素（-treptavidnphycoerythrobilinSDS：
完基硫酸钠（sodiumdad
Taq：水生
兰栖热荫（Thermi
aquaticu)
TE：由
和EDTA配制
buffersolution)
而成的缓冲溶
(Tris-EDT
TMAC.四月
甲基氯化铵（teramethylamnoniumchiloride)Tris：主（羟用基）氨基甲烷tris(hydroxyrethyl）aninometh4方法提要
对样品中的靶基因进行PCR扩增，通过液相杂交将偶联探针的微球与PCR扩增产物结合，采用流式细胞技术对目标成分进行检测。每一种带有独特色彩编号的微球固定一种探针特异结合一种目标核酸序列。该核酸序列连接荧光标记物。单个的微球通过检测通道时被两束不同波长激光检测，一束激光检测微球的色标编码，另一束激光检测目标核酸序列荧光标记物。检测单一成分时，将该成分PCR产物与相应微球进行反应；检测多种成分时可以将名个成分的PCR产物与微球混合物进行反应。检测实验室需达到GB/T27403-2008的要求。5检测用引物和探针
质控探针及检测用哺乳动物通用引物探针，反动物通用引物探针，以及13种特异性引物和探针序列参见附录A中表A.1。
6试剂
6.1Taq DNA聚合酶。
6.210×PCR缓冲液。
6.3dNTPs(dATP、dCTPdGTPdTTP)。6.4琼脂糖。
TTTKAoNrKAca
溴化乙锭。
6.6酚。
6.7三氯甲烷。
6.8异丙醇。
6.9无水乙醇。
6.10异戊醇。
6.11分子量标准品（最小片段≥20bp，最大片段≤2000bp）。6.12TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl,pH8.0,1mmol/LEDTA)。GB/T35024—2018
6.13电泳缓冲液(10×TBE:Tris54g，硼酸27.5g，20mL0.5mol/LEDTA·Tris-HCl,pH8.0,加水至 1 000 mL;50XTAE:Tris 242 g,100 mL0.5 mol/L EDTA.pH 8.0,冰乙酸,57.1 mL,加水至1 L)。6.14加样缓冲液（0.25%溴酚蓝：40%薰糖水溶液）6.15非磁性微球（微球直径5.6μm，羧基修饰，按比例掺入660-nm和730nm两种分类荧光染色，每种荧光有10种浓度，根据比例不同可以把球型基质分类为100种）。6.16 0.1 mol/L MES 溶液
6.17EDC溶液(
O mg/mL).
6.18 0.02% T
ween-20
6.19 0.1% SDS
6.20SA-PE溶液
6.21TMAC溶液(5mol/L
EDTA,pH 8.0).
6.22CTAB提取液（20g/L
CTAB 1E mol/L
除另有规定外，所有试剂均为分析纯。6.23
7仪器设备
7.1 PCR 仪
7.2、液相芯片仪。
7.3恒温箱。
7.4离心机：离心力15000g。
月桂酰肌氨酸
实验用水符
rsHCl.pH8.00.5mol/L
Tris-HCL
0.02mol/LNazEDTA.pH8.0)。
SB/T6682
级水的要求。
微量移液器:0.5gL~18 μL,10μL~100μL,20μL~200 μL,200 ml-1 000μL。7.5
核酸蛋白分析仪。
天平：感量0.01mg。bzxz.net
8样品采集与制备
8.1样品采集与前处理
采样，送样要求应符合GB/T14699.1和SN/T3561的规定。按照8.1～8.2进行前处理，处理后的样品分成三等份，包括检样、复检样和贮存样。8.2肉、皮张、内脏等
先依次用70%乙醇和ddH20冲洗2次～3次，洗去外源成分和调料等，控干水分，搅碎，收集到干净50mL离心管或干净密封袋中，冻存于一20℃。8.3乳、饲料等
混勾后直接分装到干净50mL离心管或干净密封袋中，根据样品种类贮存于一20C或4℃。3
TKAONIKAca
GB/T35024—2018
9检验步骤
9.1DNA提取
称取1g～2g处理好的样品于50mL离心管中，加入2mL～5mLCTAB提取液，加人20μL～100μL的20mg/mL蛋白酶K，65℃温育1h，期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加人适量CTAB提取缓冲液。室温12000g离心10min，转移上清至2mL离心管中，加人等体积的室温酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1)颠倒混匀，室温12000g转速下离心10min。转移上清液至另一灭菌的离心管中，加人等体积的三氯甲烷/异戊醇（24：1），颠倒混勾，室温下12000g离心10min；转移上清至干净离心管中；加入等体积的CTAB沉淀液混匀，室温沉淀1h。加人0.8倍体积的异丙醇或2倍体积-20℃冰箱中预冷的无水乙酵混匀，-20℃放置30min~1h，12000g4℃离心10min.弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g4℃离心10min，弃上清，室温下晾干。加人50μL～100μL灭菌双蒸水，室温10min，混匀，一20℃保存。也可用等效DNA提取试剂盒提取模板 DNA。
9.2DNA定量
取10μLDNA溶液加蒸馅水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值。DNA的浓度按照式（1)计算，当OD26/OD2a比值在1.7～2.1之间时，适宜于PCR扩增。扩增前将所有样品DNA调至约5ng/μL～50ng/μL。AXNX50
式中：
C—DNA浓度，单位为纳克每微升（ng/μL）：A—260nm处的吸光值；
N核酸稀释倍数。
9.3PCR扩增
9.3.1PCR体系
反应体系总体积为25μL其中包含：10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mmol/LdNTP2μL，单一待检目标动物成分的上、下游引物（根据检测目标物种确定）各0.5μL(引物浓度10μmol/L)，5U/μLTaqDNA合酶0.2μL，5μLDNA模板（5ng/μL～50ng/μL），用灭菌双蒸水补足体积至25μL。9.3.2PCR参数
95℃预变性10min95℃30s60℃30s，72℃30s，30个循环（其中哺乳动物40个循环）72℃延伸5min；4C保存。
9.4液相芯片检测
9.4.1探针与微球偶联
取出微球存储管以最高转速涡旋30s，超声处理15s。选一种微球50μL1.5mL离心管中，10000g离心2min，弃上清，用50μL0.1mol/LMES（pH4.5）重悬微球，彻底涡旋使微球分散成均匀的悬浊液状态，加人一种0.5μL预先稀释好的（0.05nmol)探针。制备新鲜的EDC溶液（10mg/mL），取2.5μLEDC至微球中，彻底混匀，室温避光摇动30min，重复此步骤一次。加入1mL0.1%SDS.低速涡旋混勾，12000g离心2min，小心移除上清，再加人1mL0.02%Tween-20，低速涡旋重悬，4
TKAONIKAca
GB/T 35024—2018
12000g离心2min，小心移除上清，最后用75uLTE缓冲液重悬微球，4C避光保存。9.4.2杂交反应
9.4.2.1单微球探针
取样品的PCR产物5μL于45μL的无菌水中，涡旋混匀。将单一成分微球探针涡旋重悬，与PCR产物反应。反应体系为：微球0.5μL,PCR产物1μL，1.5×TMAC33μL.用1×TE15.5μL调至50μL，热反应条件为：95℃5min.60C10min，4℃保存。9.4.2.2多微球探针
取样品的PCR产物5uL于45uL的无菌水中，涡旋混勾。将每一种微球探针均涡旋重悬，与PCR产物反应。反应体系为：每一种微球探针0.5L，每一种PCR产物1μL，1.5×TMAC33μL.用1×TE15.5μL调至50μL。热反应条件为：95℃5min，60℃10min，4C保存。9.4.3上机检测
将杂交产物转到无菌抽滤板中，抽干，同时记录杂交体系对应孔位置。将SA-PE用1XTE稀释到4ng/μL，每孔加入50μL，避光震荡2min，再室温需荡5min。抽干滤孔板，用125μLTE洗三次，用125μLTE重悬。用矫正液矫正液相芯片仪，将上述处理好的样品上机检测。10质量控制
检测过程中分别设阳性对照、阴性对照、质控对照、空白对照。分别以目标引物探针对应的动物物种的肌肉或DNA溶液作为阳性对照，以提取的植物组织（大豆等任一植物）或DNA溶液作为阴性对照，用质控探针作检测体系的质控对照，用无菌双蒸水作空白对照。对照样品按照9.1步骤提取DNA，也可使用购买的DNA溶液作为阳性或阴性对照。所有样品设3个重复.以荧光强度中位值的平均值作为样品读数。
11结果判定与表述
11.1结果判定
质控探针荧光强度中位值大于或等于空白对照20倍。阳性对照荧光强度中位值大于阅值（各成分阅值设定参见附录A中表A,2)。11.1.2
阴性对照荧光强度中位值低于阈值。11.1.4在满足上述结果条件下，如果样品荧光强度中位值大于或等于阀值，判定为阳性；如果低于阈值，判定为阴性。
11.2结果表述
样品检测结果阳性，表述为该样品中含有某某成分。11.2.2样品检测结果阴性，表述为该样品中某某成分含量低于检测线。12
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403—2008中附录D的规定执行。TKANrKAca
GB/T35024—-2018
附录A
（资料性附录）
常见畜禽动物成分液相芯片扩增引物探针序列及检测阅值表A.1注明了本标准所使用的哺乳动物、反动物、骆驼、马、驴、耗牛、水牛、狗、猪、马鹿、羊、鸡、鸭、大鼠、小鼠成分检测的引物探针序列，以及靶基因名称。表A，2规定了各靶标的检测信号國值。表A1引物和探针序列
序列（5-+3）
F.Biotin-CATCCTCATGTGCTATGTCAGTARGCACGATGTACATAGGGTATTA
P.NH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTTGAGCTGATATGGTGTTGTGCGGGGF:Biotin-CACCCTCATGTGCTATGTCAGTAR.GCACGATGTACATAGGCCATTC
P.NH,-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTCAGGTGGGTATGGTGTTATGTGGGGF:CAGACGGATGGGGCACCAACC
R.Biotin-GCCGCATATCTAGGAGTAGATATCP:NH:-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGGCTTTGGGGCTTCCGAATGTGAGF:GACTAATATTCGAAAATCC
R.Biotin-CTCCTAGGAGGGAGCCGAAGTTTCACP.NH.-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAACGCATTCATTGACCTTCCAGCTCCATFCACCATCARCACCCAAAGCTG
R.Biotin-CTTGCTTATATGCATGGGGCATAP.NH.-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGGAGTGGTAAGACCATATGTTGTATGCCGTACATGCGAGG
F:AACACGTGATATAACCTTATGCGC
R:Biotin-TATGTCCTATACACTAACTCATGTGCP:NH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGCTAGAACACGCATGTATAACAGCACF:AGCCTTCTCTTCAGTCGCAC
R.Biotin-TGGGAGGACATAGCCCATGAP.NH.-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATCTGCCGAGATGTCAATTACGGCTF:ACACAACTTCTACCACAACCC
RBiotin-AAACAATGAGGGTAACGAGGGP.NH,-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACACCGAAACAAAATACTCCTTGAGAAACAF:TATTTGGAGCATGAGCCGGT
R·Biotin-AGTAAAGTACCGGGCTGACCP.NH,-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGCCTCCTCATCCGAGCCGAA基因
线粒体基因
tRNA-Thr及
D-loop区
线粒体基因
tRNA-Thr及
D-loop区
growth hormone
(GH)gene
icytochromeb
(eytb)gene
线粒体基因
tRNA-Pro及
D-loop区
D-loopregion
cytochromeb
(cytb)gene
synthaseFo
subunit8
CATPg)gene
eytochrome
(oxidase subunit
I(COD)gene
TTTKAONIKAca
F.TGCCGAGACGTAAACTACGG
表A.1（续）
序列（5-3）
R;Biotin-CTCGTCCCACATGGAGGAATP.NH.-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACTGATCCGATACCTACACGCCAACCF:TGTCGAGACGTAAATTACGG
R.CTCGTCCGACATGAAGGAAT
PNH:-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACTAATCCGATATATACACGCAAACGF:CACCATCARCACCCAAAGCTG
R;Biotin-CTTGCTTATATGCATGGGGCATA反
P:NH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCIGTGGTCTGTGTATGGGCGTGTTATGTTGGCTAGTGGTG
F:CCTCAGCAGGGTCTTCACCA
R:Biotin-TTCAGCTTCTCGTAGACNCGPNH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCCTGGTGTTTGGCACCTCGGAF:CAGGCTCAAACAACCCCCTA
R.Biotin-GGGCTAGTGTTAGGAATGGGGP:NH,-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACTACTCCTTCAAAGACATTCTGGGCTF:CAGGCTCAAACAACCCCCTA
R:Biotin-GGGCTAGTGCTATGAGGGGGGP.NH,-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACTTCTCCTTTAAGGACATCCTAGGATP-R,Bioun-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTP.NH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGB/T35024-2018
cytochromeb
(cytb)gene
cytochromeb
(cytb)gene
线粒体基因
tRNA-Pro及
D-loop区
growthhormone
(GH)gene
cytochromeb
(cytb)gene
cytochromeb
(cytb）gene
注：P表示探针，所有探针5'端氨基化修饰，便于与羧基微球进行偶联：F表示正向引物：R表示反向引物：Biotin表示生物素标记，便于与荧光报告分子结合。表A.2
蘭值（荧光值与
空白的倍数）
探针检测阅值
GB/T35024-2018
中华人民共和
国家标准
常见畜禽动物成分检测方法
液相芯片法
GB/T35024—2018
中国标准出版社出版发行
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）网址spc.net.cn
总编室：（010）68533533
发行中心：（010)51780238
读者服务部：（010)68523946
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印剧各地新华书店经销
开本880×1230
2018年5月第一版
印张0.75字数16千字
2018年5月第一次印刷
书号：155066·1-60013
如有印装差错
由本社发行中心调换
版权专有
侵权必究
举报电话：（010）68510107
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中华人民共和国国家标准
GB/T350242018
常见畜禽动物成分检测方法
液相芯片法
Detection method of mammals and poultry ingredients-Suspended bead array
2018-05-14发布
国家市场监督管理总局
中国国家标准化管理委员会
2018-12-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由全国生物芯片标准化技术委员会（SAC/TC421)提出并归口。GB/T35024—2018
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：陈颖、吴亚君、杨艳歌、韩建勋、刘鸣畅、王斌、黄文胜、曹际娟、王、张舒亚、高宏伟。
1范围
常见畜禽动物成分检测方法
液相芯片法
本标准规定了畜禽产品中常见动物物种成分的液相芯片检测方法GB/T35024—2018
本标准适用于肉及加工品、乳、皮张、内脏，动物饲料等奋禽产品中哺乳动物和反负动物成分，和13种常见肉品或掺杂成分（骆驼、马、驴、耗牛、水牛、狗、猪、马鹿、羊、鸡、鸭、大鼠、小鼠）动物物种成分的定性检测。方法的最低检出限为（质量百分比）：水牛5%，哺乳、反台、狗、羊、鸡、大鼠、小鼠为1%，骆驼、耗牛、马鹿、猪、马、驴、鸭的最低检测限为0.1%。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样
GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T3561国境口岸卫生监督食品采样、送样规程3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
suspendedbeadarray
液相芯片技术
通过液相杂交将偶联有探针的微球与样品中靶基因序列结合，通过流式细胞技术对样品中的多种目标成分进行同时检测。
液相芯片探针
suspended array probe
固定于微球表面，能与目标成分亲和结合用于探测目标成分信息的核酸或蛋白分子。3.1.3
+quality control probe
质控探针
用来监控芯片反应是否正常的探针。注：本标准使用的是人工合成的一段赛核苷酸探针（polyTzopolyAz。,5'端氮基标记）。3.1.4
median fluoresence intensity荧光强度中位值
液相芯片检测仪检测到的样品荧光信号值，即软件自动读取与样品结合的微球数量，并进行背景值校正后得到的数值。
GB/T35024—2018
值cutoff value
判定阳性信号的最低荧光强度中位值。通过实验数据统计分析后得出，要求防止假阳性结果，同时保证灵敏度需求。
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid)dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate)dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate）dGTP：脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphate)dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidine triphosphate）EDC:1-乙基
二甲基氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐[N-(3-dimethylaminodipropyl）-N'-ethylcar-3
bodiimade]
EDTA:Z
二胺四乙酸（ethyle
MES：2-吗咻Z磺酸[2N-morpholino-cthaneulfonicacid]SA-PF链君亲和素-藻红素（-treptavidnphycoerythrobilinSDS：
完基硫酸钠（sodiumdad
Taq：水生
兰栖热荫（Thermi
aquaticu)
TE：由
和EDTA配制
buffersolution)
而成的缓冲溶
(Tris-EDT
TMAC.四月
甲基氯化铵（teramethylamnoniumchiloride)Tris：主（羟用基）氨基甲烷tris(hydroxyrethyl）aninometh4方法提要
对样品中的靶基因进行PCR扩增，通过液相杂交将偶联探针的微球与PCR扩增产物结合，采用流式细胞技术对目标成分进行检测。每一种带有独特色彩编号的微球固定一种探针特异结合一种目标核酸序列。该核酸序列连接荧光标记物。单个的微球通过检测通道时被两束不同波长激光检测，一束激光检测微球的色标编码，另一束激光检测目标核酸序列荧光标记物。检测单一成分时，将该成分PCR产物与相应微球进行反应；检测多种成分时可以将名个成分的PCR产物与微球混合物进行反应。检测实验室需达到GB/T27403-2008的要求。5检测用引物和探针
质控探针及检测用哺乳动物通用引物探针，反动物通用引物探针，以及13种特异性引物和探针序列参见附录A中表A.1。
6试剂
6.1Taq DNA聚合酶。
6.210×PCR缓冲液。
6.3dNTPs(dATP、dCTPdGTPdTTP)。6.4琼脂糖。
TTTKAoNrKAca
溴化乙锭。
6.6酚。
6.7三氯甲烷。
6.8异丙醇。
6.9无水乙醇。
6.10异戊醇。
6.11分子量标准品（最小片段≥20bp，最大片段≤2000bp）。6.12TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl,pH8.0,1mmol/LEDTA)。GB/T35024—2018
6.13电泳缓冲液(10×TBE:Tris54g，硼酸27.5g，20mL0.5mol/LEDTA·Tris-HCl,pH8.0,加水至 1 000 mL;50XTAE:Tris 242 g,100 mL0.5 mol/L EDTA.pH 8.0,冰乙酸,57.1 mL,加水至1 L)。6.14加样缓冲液（0.25%溴酚蓝：40%薰糖水溶液）6.15非磁性微球（微球直径5.6μm，羧基修饰，按比例掺入660-nm和730nm两种分类荧光染色，每种荧光有10种浓度，根据比例不同可以把球型基质分类为100种）。6.16 0.1 mol/L MES 溶液
6.17EDC溶液(
O mg/mL).
6.18 0.02% T
ween-20
6.19 0.1% SDS
6.20SA-PE溶液
6.21TMAC溶液(5mol/L
EDTA,pH 8.0).
6.22CTAB提取液（20g/L
CTAB 1E mol/L
除另有规定外，所有试剂均为分析纯。6.23
7仪器设备
7.1 PCR 仪
7.2、液相芯片仪。
7.3恒温箱。
7.4离心机：离心力15000g。
月桂酰肌氨酸
实验用水符
rsHCl.pH8.00.5mol/L
Tris-HCL
0.02mol/LNazEDTA.pH8.0)。
SB/T6682
级水的要求。
微量移液器:0.5gL~18 μL,10μL~100μL,20μL~200 μL,200 ml-1 000μL。7.5
核酸蛋白分析仪。
天平：感量0.01mg。bzxz.net
8样品采集与制备
8.1样品采集与前处理
采样，送样要求应符合GB/T14699.1和SN/T3561的规定。按照8.1～8.2进行前处理，处理后的样品分成三等份，包括检样、复检样和贮存样。8.2肉、皮张、内脏等
先依次用70%乙醇和ddH20冲洗2次～3次，洗去外源成分和调料等，控干水分，搅碎，收集到干净50mL离心管或干净密封袋中，冻存于一20℃。8.3乳、饲料等
混勾后直接分装到干净50mL离心管或干净密封袋中，根据样品种类贮存于一20C或4℃。3
TKAONIKAca
GB/T35024—2018
9检验步骤
9.1DNA提取
称取1g～2g处理好的样品于50mL离心管中，加入2mL～5mLCTAB提取液，加人20μL～100μL的20mg/mL蛋白酶K，65℃温育1h，期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加人适量CTAB提取缓冲液。室温12000g离心10min，转移上清至2mL离心管中，加人等体积的室温酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1)颠倒混匀，室温12000g转速下离心10min。转移上清液至另一灭菌的离心管中，加人等体积的三氯甲烷/异戊醇（24：1），颠倒混勾，室温下12000g离心10min；转移上清至干净离心管中；加入等体积的CTAB沉淀液混匀，室温沉淀1h。加人0.8倍体积的异丙醇或2倍体积-20℃冰箱中预冷的无水乙酵混匀，-20℃放置30min~1h，12000g4℃离心10min.弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g4℃离心10min，弃上清，室温下晾干。加人50μL～100μL灭菌双蒸水，室温10min，混匀，一20℃保存。也可用等效DNA提取试剂盒提取模板 DNA。
9.2DNA定量
取10μLDNA溶液加蒸馅水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值。DNA的浓度按照式（1)计算，当OD26/OD2a比值在1.7～2.1之间时，适宜于PCR扩增。扩增前将所有样品DNA调至约5ng/μL～50ng/μL。AXNX50
式中：
C—DNA浓度，单位为纳克每微升（ng/μL）：A—260nm处的吸光值；
N核酸稀释倍数。
9.3PCR扩增
9.3.1PCR体系
反应体系总体积为25μL其中包含：10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mmol/LdNTP2μL，单一待检目标动物成分的上、下游引物（根据检测目标物种确定）各0.5μL(引物浓度10μmol/L)，5U/μLTaqDNA合酶0.2μL，5μLDNA模板（5ng/μL～50ng/μL），用灭菌双蒸水补足体积至25μL。9.3.2PCR参数
95℃预变性10min95℃30s60℃30s，72℃30s，30个循环（其中哺乳动物40个循环）72℃延伸5min；4C保存。
9.4液相芯片检测
9.4.1探针与微球偶联
取出微球存储管以最高转速涡旋30s，超声处理15s。选一种微球50μL1.5mL离心管中，10000g离心2min，弃上清，用50μL0.1mol/LMES（pH4.5）重悬微球，彻底涡旋使微球分散成均匀的悬浊液状态，加人一种0.5μL预先稀释好的（0.05nmol)探针。制备新鲜的EDC溶液（10mg/mL），取2.5μLEDC至微球中，彻底混匀，室温避光摇动30min，重复此步骤一次。加入1mL0.1%SDS.低速涡旋混勾，12000g离心2min，小心移除上清，再加人1mL0.02%Tween-20，低速涡旋重悬，4
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GB/T 35024—2018
12000g离心2min，小心移除上清，最后用75uLTE缓冲液重悬微球，4C避光保存。9.4.2杂交反应
9.4.2.1单微球探针
取样品的PCR产物5μL于45μL的无菌水中，涡旋混匀。将单一成分微球探针涡旋重悬，与PCR产物反应。反应体系为：微球0.5μL,PCR产物1μL，1.5×TMAC33μL.用1×TE15.5μL调至50μL，热反应条件为：95℃5min.60C10min，4℃保存。9.4.2.2多微球探针
取样品的PCR产物5uL于45uL的无菌水中，涡旋混勾。将每一种微球探针均涡旋重悬，与PCR产物反应。反应体系为：每一种微球探针0.5L，每一种PCR产物1μL，1.5×TMAC33μL.用1×TE15.5μL调至50μL。热反应条件为：95℃5min，60℃10min，4C保存。9.4.3上机检测
将杂交产物转到无菌抽滤板中，抽干，同时记录杂交体系对应孔位置。将SA-PE用1XTE稀释到4ng/μL，每孔加入50μL，避光震荡2min，再室温需荡5min。抽干滤孔板，用125μLTE洗三次，用125μLTE重悬。用矫正液矫正液相芯片仪，将上述处理好的样品上机检测。10质量控制
检测过程中分别设阳性对照、阴性对照、质控对照、空白对照。分别以目标引物探针对应的动物物种的肌肉或DNA溶液作为阳性对照，以提取的植物组织（大豆等任一植物）或DNA溶液作为阴性对照，用质控探针作检测体系的质控对照，用无菌双蒸水作空白对照。对照样品按照9.1步骤提取DNA，也可使用购买的DNA溶液作为阳性或阴性对照。所有样品设3个重复.以荧光强度中位值的平均值作为样品读数。
11结果判定与表述
11.1结果判定
质控探针荧光强度中位值大于或等于空白对照20倍。阳性对照荧光强度中位值大于阅值（各成分阅值设定参见附录A中表A,2)。11.1.2
阴性对照荧光强度中位值低于阈值。11.1.4在满足上述结果条件下，如果样品荧光强度中位值大于或等于阀值，判定为阳性；如果低于阈值，判定为阴性。
11.2结果表述
样品检测结果阳性，表述为该样品中含有某某成分。11.2.2样品检测结果阴性，表述为该样品中某某成分含量低于检测线。12
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403—2008中附录D的规定执行。TKANrKAca
GB/T35024—-2018
附录A
（资料性附录）
常见畜禽动物成分液相芯片扩增引物探针序列及检测阅值表A.1注明了本标准所使用的哺乳动物、反动物、骆驼、马、驴、耗牛、水牛、狗、猪、马鹿、羊、鸡、鸭、大鼠、小鼠成分检测的引物探针序列，以及靶基因名称。表A，2规定了各靶标的检测信号國值。表A1引物和探针序列
序列（5-+3）
F.Biotin-CATCCTCATGTGCTATGTCAGTARGCACGATGTACATAGGGTATTA
P.NH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTTGAGCTGATATGGTGTTGTGCGGGGF:Biotin-CACCCTCATGTGCTATGTCAGTAR.GCACGATGTACATAGGCCATTC
P.NH,-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTCAGGTGGGTATGGTGTTATGTGGGGF:CAGACGGATGGGGCACCAACC
R.Biotin-GCCGCATATCTAGGAGTAGATATCP:NH:-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGGCTTTGGGGCTTCCGAATGTGAGF:GACTAATATTCGAAAATCC
R.Biotin-CTCCTAGGAGGGAGCCGAAGTTTCACP.NH.-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAACGCATTCATTGACCTTCCAGCTCCATFCACCATCARCACCCAAAGCTG
R.Biotin-CTTGCTTATATGCATGGGGCATAP.NH.-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGGAGTGGTAAGACCATATGTTGTATGCCGTACATGCGAGG
F:AACACGTGATATAACCTTATGCGC
R:Biotin-TATGTCCTATACACTAACTCATGTGCP:NH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGCTAGAACACGCATGTATAACAGCACF:AGCCTTCTCTTCAGTCGCAC
R.Biotin-TGGGAGGACATAGCCCATGAP.NH.-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATCTGCCGAGATGTCAATTACGGCTF:ACACAACTTCTACCACAACCC
RBiotin-AAACAATGAGGGTAACGAGGGP.NH,-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACACCGAAACAAAATACTCCTTGAGAAACAF:TATTTGGAGCATGAGCCGGT
R·Biotin-AGTAAAGTACCGGGCTGACCP.NH,-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGCCTCCTCATCCGAGCCGAA基因
线粒体基因
tRNA-Thr及
D-loop区
线粒体基因
tRNA-Thr及
D-loop区
growth hormone
(GH)gene
icytochromeb
(eytb)gene
线粒体基因
tRNA-Pro及
D-loop区
D-loopregion
cytochromeb
(cytb)gene
synthaseFo
subunit8
CATPg)gene
eytochrome
(oxidase subunit
I(COD)gene
TTTKAONIKAca
F.TGCCGAGACGTAAACTACGG
表A.1（续）
序列（5-3）
R;Biotin-CTCGTCCCACATGGAGGAATP.NH.-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACTGATCCGATACCTACACGCCAACCF:TGTCGAGACGTAAATTACGG
R.CTCGTCCGACATGAAGGAAT
PNH:-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACTAATCCGATATATACACGCAAACGF:CACCATCARCACCCAAAGCTG
R;Biotin-CTTGCTTATATGCATGGGGCATA反
P:NH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCIGTGGTCTGTGTATGGGCGTGTTATGTTGGCTAGTGGTG
F:CCTCAGCAGGGTCTTCACCA
R:Biotin-TTCAGCTTCTCGTAGACNCGPNH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCCTGGTGTTTGGCACCTCGGAF:CAGGCTCAAACAACCCCCTA
R.Biotin-GGGCTAGTGTTAGGAATGGGGP:NH,-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACTACTCCTTCAAAGACATTCTGGGCTF:CAGGCTCAAACAACCCCCTA
R:Biotin-GGGCTAGTGCTATGAGGGGGGP.NH,-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACTTCTCCTTTAAGGACATCCTAGGATP-R,Bioun-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTP.NH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGB/T35024-2018
cytochromeb
(cytb)gene
cytochromeb
(cytb)gene
线粒体基因
tRNA-Pro及
D-loop区
growthhormone
(GH)gene
cytochromeb
(cytb)gene
cytochromeb
(cytb）gene
注：P表示探针，所有探针5'端氨基化修饰，便于与羧基微球进行偶联：F表示正向引物：R表示反向引物：Biotin表示生物素标记，便于与荧光报告分子结合。表A.2
蘭值（荧光值与
空白的倍数）
探针检测阅值
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中华人民共和
国家标准
常见畜禽动物成分检测方法
液相芯片法
GB/T35024—2018
中国标准出版社出版发行
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开本880×1230
2018年5月第一版
印张0.75字数16千字
2018年5月第一次印刷
书号：155066·1-60013
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