GB/T 35880-2018
基本信息
标准号： GB/T 35880-2018
中文名称：银耳菌种质量检验规程
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
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标准简介
GB/T 35880-2018 银耳菌种质量检验规程
GB/T35880-2018
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标准内容
ICS65.020
中华人民共和国国家标准
GB/T35880—2018
银耳菌种质量检验规程
Regulations for quality inspection of tremella culture2018-02-06发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2018-09-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华全国供销合作总社提出。本标准由全国银耳标准化工作组（SAC/SWG9)归口。GB/T35880—2018
本标准起草单位：全国银耳标准化工作组、福建农林大学生命科学学院、古田县食用菌研发中心、古田县食用菌产业管理局。
本标准主要起草人：张琪辉、温志强、雷银清、余新敏、龚宽俊、金珊珊、彭冬祥、林铃。1范围
银耳菌种质量检验规程
GB/T35880—2018
本标准规定了银耳菌种质量检验的术语和定义、抽样、检验内容与方法、质量要求、判定规则。本标准适用于银耳菌种质量的检验。2
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T29368银耳菌种生产技术规范GB/T30989
高通量基因测序技术规程
NY/T1284食用菌菌种中杂菌及害虫的检验3
3术语和定义
GB/T29368界定的以及下列术语和定义适用于本文件。为了便于使用，以下重复列出GB/T29368中的一些术语和定义。
tremella culture
银耳菌种
生长在适宜基质上具有结实性的银耳菌丝和香灰菌丝的混合培养物注：包括银耳母种、银耳原种和银耳栽培种。3.2
银耳母种
stockcultureof tremella
经混合培养或基内分离得到的具有结实性的银耳菌丝和香灰菌丝的混合培养物。注1：改写GB/T29368—2012，定义3.10。注2：也称银耳一级种。
motherspawnoftremella
银耳原种
由银耳母种移植、繁殖的培养物。注：也称银耳二级种。
spawn of tremella
银耳栽培种
由银耳原种移植、繁殖的培养物。注：也称银耳三级种。
银耳菌种真实性
genuineness of tremella culture同时含有银耳菌丝和香灰菌丝的菌种。1
-TTKAONIKAca
GB/T35880—2018
银耳菌种活力tremellacultureactivity银耳菌种生长、繁殖、形成子实体的能力。3.7
白毛团myceliumpellet
银耳菌丝与香灰菌丝混生在培养基表面形成的白色菌丝团。［GB/T29368—2012,定义3.4
银耳菌丝体myceliumoftremella由许多银耳菌丝联结在一起组成的营养体。注：银耳菌丝颜色白至黄色，红细，具分枝及分隔，镇状联合明显。3.9
香灰菌丝体
myceliumof cohabitantfungus
由许多香灰菌丝联结在
起组成的营养体。
，量羽毛状分枝，爬壁能力和分解纤维素能力强，能分泌黑色素，与银耳菌丝伴生。注：香灰菌丝细长，
accase
含四个铜离于的多酚氧化酶，属手铜蓝单花酶，以单体精蛋白的形式存在注：漆存在于菌类、植物电可存活手室气中其独特的催化特被广之应用手生物检测。4抽样
抽样方法
采用随机抽样法。银耳母种银耳原种银耳裁培种的拍样数量（瓶，袋）分别以每批生产的菌种数量（以每天的生产数量为一批）为单位，按式的详算捕样数量2
式中：
抽样数量：
每批数量。
计算结果保留整数。
样品的运输与保藏条件
+++(1)
样品在运输过程中容器内的温度应控制在18℃～23℃，湿度自然；待检样品应放置在18℃～23℃，湿度白然的环境中，24h内检测；保留样品应放置在18℃～23℃，湿度白然的环境中保藏备查，保藏时间20天。
5检验内容与方法
仪器设备和试剂
仪器设备
放大镜：10倍。
KAoNiKAca
5.1.1.2体视显微镜：50倍。
5.1.1.3灭菌锅：最大温度可达126C，最大压力可达0.155MPa。5.1.1.4
恒温水浴锅：土1℃C。
高速冷冻离心机：转速可达10000r/min。超净工作台：洁净等级100级@≥0.5μm。5.1.1.7
PCR仪。
5.1.1.8电泳仪：可电压6V~600V，电流4mA~400mA。5.1.1.9
凝胶成像系统。
紫外可见分光光度计。
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的三级水。5.1.2.1
三羟甲基氨基甲烷。
二水合乙二胺四乙酸钠。
盐酸。
氢氧化钠。
氯化钠。
三甲基溴化铵。
聚乙烯吡咯烷酮。
氯仿。
异戊醇。
饱和酚。
乙醇。
核糖核酸酶（RNase酶）。
硼酸。
引物ITS4。
引物ITS5。
PCR扩增缓冲液（10X，pH8.3）。脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）。TaqDNA聚合酶(1.5U)。
核酸染料。
分子标记(DNAmarker)：2000bp。琼脂糖。
重蒸水：应符合GB/T6682规定的二级水及以上标准。感官检验
母种、原种、栽培种感官检验内容和方法如表1所示。GB/T35880—2018
iKAoNiKAca
GB/T35880—2018
菌种级别
表1母种、原种、栽培种感官检验内容和方法检验内容
菌种容器外观
栽培种
菌种瓶和标签的完整性；菌种瓶塞（盖）的松紧度、干燥度、清洁度、气味、杂菌、害虫和其他污染物
杂菌及害虫检验
菌丝体外观
白毛团、香灰菌、子实体生长
白毛团、香灰菌生长状态
母种、原种、栽培种的杂菌及害虫检验按照NY/T1284的规定进行真实性检验
DNA的提取
检验方法
用眼睛观察、鼻闻、手触摸，必要时用放大镜或体视显微镜观察
母种、原
真种、栽培种DNA的提联按照附录A的方法进行也可以采用DNA提取试剂盒进行，要求得到的DA浓度不低于50ng/L1A260/A2802.0.琼脂糖凝胶电泳给果条带清晰不拖尾。用TE缓冲液将DNA浓度裤释创50定10ong/l
ITS序列分析
中ITS序列务析按照附录B的方法进行。银耳南菌种
5.5活力检验
银耳菌种活力检验按照附录的方法质量要求
母种、原种、裁培种感官要求应符合表2的规定。表2母种、原种、栽培种感官要求菌种级别
栽培种
菌种容器外观
标签应注明品种名称、菌种
级别、接种日期、保裁条件、
保质期、菌种生产单位名称
等，菌种瓶应无破损，菌种www.bzxz.net
瓶塞（盖）应干燥、洁净、无
脱落、无异味、无杂菌、无害
虫和其他污染物
杂菌及害虫
菌丝体外观
白毛团应结实圆润，香灰菌丝爬壁呈羽毛状，分泌的黑色素均匀无杂色；无桔抗线，原基表面分泌液清澈透明，子实体耳片整齐、无异状白毛团应结实圆润：香灰菌丝爬壁呈羽毛状，分泌的黑色素均勾无杂色：无拮抗线：原基表面分泌液清澈透明：子实体耳片整齐、无异状培养基表面出现许多小而紧实圆润的白毛团：香灰菌丝生长健壮、分布均勾、呈羽毛状；无抗线
银耳菌种杂菌及害虫检验应同时符合以下规定：TTKAONTKAca
GB/T35880—2018
用放大镜观察，培养物表面没有光滑、润湿的黏稠物；菌种瓶塞（盖）处或培养基面没有与正常颜色不同的霉菌斑点，没有害虫的卵、幼虫、蛹或成虫；用显微镜观察，培养物没有不同粗细菌丝或异样孢了存在，没有害虫的卵、幼虫、蛹或成虫；b)
NA培养液清澈无浑浊，PDA培养的菌种菌丝生长速度、菌落特征、孢子特征与正常菌种c
6.3真实性
母种、原种、栽培种真实性应符合以下规定：ITS序列分析过程中，电泳结果同时出现535bp和910bp两条片段，且测序结果满足其中a
535bp的片段序列和银耳的ITS序列相似性达98%以上：其中910bp的片段序列和香灰菌银耳和香灰菌的ITS序列参见附录D的ITS序列相似性达99%以上。
银耳菌种同时含有银耳ITS标记和香灰菌ITS标记。h)
6.4漆酶活力
母种、原种
裁培种的漆酶活力应符合表3的规定。表3母种，原种、栽培种漆酶的酶活力指标菌种级割
酶活力/（U/L）
判定规则
7.1合格菌种
感官、真实性、杂菌及害虫、活力巧符合要求的为合格菊种7.2不合格菌种
感官、真实性、杂菌及害虫、活力若有一项不符合要求即为不合格菌种裁培种
iiKAoNrKAca
GB/T35880—2018
A.1溶液配制
A.1.11.0mol/LpH8.0的Tris-HCI附录A
（规范性附录）
DNA提取方法
称取三羟甲基氨基甲烷（Tris)121.14g，用800mL蒸馏水溶解，然后用1.0mol/L的HCl溶液调节pH到8.0再用蒸馏水定容至1000mLA.1.20.5mol/LpH8.0的EDTA溶液称取二水合乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na·2HzO)186.1g，用800mL蒸馏水溶解，然后用1.0mol/L的NaOH溶液调节pH到8.0，再用蒸留水定容至1000mL。A.1.3提取缓冲液（SDEB）
称取氯化钠0.585g，量取1mol/LpH8.0的Tris-HCl溶液25mL、0.5mol/LpH8.0的EDTA溶液10mL，用蒸馏水溶解定容至100mL，灭菌冷却后待用。A.1.42×CTAB缓冲液
称取十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)2.0g、氯化钠8.2g、聚乙烯吡咯烷酮1.0g，量取1mol/LpH8.0的Tris-HCI溶液10mL、0.5mol/LpH8.0的EDTA溶液4mL，用蒸馏水溶解定容至100mL，灭菌冷却后待用。
A.1.5TE缓冲液
量取的pH8.0的1.0mol/LTris-HCI溶液1.0mL与pH8.0的0.5mol/LEDTA溶液0.2mL混合后，用重蒸水定容至100mL。
A.1.65×TBE缓冲液
称取Tris54.0g，硼酸27.5g，用20mL0.5mol/LpH8.0的EDTA溶液溶解后用蒸馏水定容至1000mL
A.2DNA提取
DNA提取按照以下步骤进行：
称取白毛团0.1g～0.2g放人研钵中，加液氮研磨至粉状后转移到2mL离心管中，往离心管a)
中加人400μL提取缓冲液（SDEB），涡旋震荡，必要时用手弹离心管使粉末充分溶于SDEB：往离心管中加入2×CTAB缓冲液400uL；b）
在通风厨中，往离心管中加入饱和酚250μL和氯仿：异戊醇一24：1的溶液250μL，室温涡旋5min，
d）13000r/min，4℃条件下离心5min；6
rikANrkAca
吸取650μL上清液，转移到1.5mL离心管中；往上清液中加入455uL(0.7倍体积）的异丙醇，上下颠倒混匀；13000r/min，4℃条件下离心10min；GB/T35880—2018
倒掉上清液，13000r/min，4℃条件下离心10s，用200uL移液枪将离心管中残余的上清液弃除；
往离心管沉淀中加入70%乙醇900uμL，用手指弹离心管使白色沉淀悬浮；13000r/min，4℃条件下离心10min；用1mL移液枪吸取上清液弃除；
13000r/min，4℃条件下离心10s，用200μL的移液枪将离心管中残余的上清液弃除；m）在通风厨中，打开离心管盖子，放在96孔板上，让96孔板板面与通风厨台面成直角，放置10min;
往离心管中加人50μ山L~100μL含有RNase酶的TE缓冲液，55水浴30min；将溶解后的DMA暂有于冰上，分别采用超微量分光光度计和1%～1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和质量。
TiKAONrKAca
GB/T35880—2018
B.1ITS引物
（规范性附录）
ITS序列分析
引物选用ITS-基因间隔序列4（ITS4）和ITS基因间隔序列5（ITS5），引物序列为：ITS4：5°-TCCTCCGCT TAT TGA TATGC-3,ITS5:5-GGAAGT AAA AGT CGT AACAAGG-3。B.2
ITS反应体系和条件
PCR反应体系（25μL）
PCR反应的总体积为25μL，含有2.5μL10×PCR反应缓冲液，0.2mmol/LdNTP，引物4μmol/L，20ng～50ng模板DNA，1.5UTaq酶，双蒸无菌水补充体积到25μL。按上述比例将反应液各组分加入0.2mLPCR管中，混匀，放入PCR仪中，进行PCR扩增。B.2.2PCR反应条件
PCR扩增仪上进行以下循环：94℃预变性5min，然后94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，扩增35个循环，最后72C延伸10min，4℃保存。3测序分析
PCR产物经1%～1.5%琼脂糖检测后进行单一片段回收，对回收产物按照GB/T30989方法进行测序，测序结果在DNAman软件中同附录D中银耳和香灰菌的标准序列进行双链比对。8
C.1溶液准备
C.1.10.1mol/L邻苯二酚溶液
附录C
（规范性附录）
漆酶活力测定方法
称取邻苯二酚（CHOz，Mr=110.11)11g用蒸馏水溶解并定容至1000mLC.1.20.1mol/LpH4.5的醋酸-醋酸钠(HAc-NaAc)缓冲液称取醋酸钠4.1g，用蒸馏水溶解，再用冰醋酸调节pH至4.5，定容至500mL。C.1.31mmol/L的2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）溶液称取0.0274gABTS用pH4.5醋酸钠缓冲液定容至50mL。C.1.4粗酶液
GB/T35880—2018
把银耳菌种里的子实体去除，然后将上层2cm的菌种用拌种器打碎搅拌均匀；取搅拌后的菌种5.0g，加人25mL蒸馏水并搅勾，浸提2h，在4℃下10000r/min离心10min后所得上清液即为粗酶液。设置3～5个重复。
C.2测定步骤
在5mL试管中分别加人0.1mol/LpH4.5的HAc-NaAc缓冲液2.7mL、1mmol/L的2'-联氨双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）溶液0.2mL、粗酶液100μL，28℃水浴保温30min，室温下用紫外分光光度计，在420nm波长测量反应液的OD值，设置3个～5个重复，最终结果取平均值。以沸水煮10 min灭活的粗酶液为对照。C.3结果计算
将C.2中测得的OD值代入式(C.1)计算得到漆酶活力：漆酶活力（U/L)
式中：
反应体系的总体积，单位为毫升（mL）；粗酶液的体积，单位为毫升（mL）；反应前后OD值变化；
反应时间，单位为秒(s)；
420nm处ABTS摩尔吸光系数为36000L·mol-1，cm-1。结果保留2位小数。
.(C.1)
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银耳的ITS序列
附录D
（资料性附录）
银耳和香灰菌的ITS序列
TCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAGCCCTACCTGATTTGAGGCCAGAGTGCAAAAGTAAAGGGGGTTGTGAGCGGCCCACAGTCGACGCGTAACTTACGACGTCTGCGTGAAACCACTAACGCATTTAAGGCCAGCCAGAGAGGCAGGGCCCAAATCCAACACCGCCGGGTCAGAAACCCAGGGGGTTGAGTCTACATGACACTCAAACAGGCATGCCTTTCGGAATACCAAAAGGCGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTTTCGCAATTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTGTTTCATGTTATGATGCATTACGTTCTTGACATATGTTTGTGTGAAGGCGGCCCGGCCCGGGGGCGCGGTCCGATGTGCACAGGTGTTTGGAAGGGCCTCGTGGCCCGGTGTAATCTCAAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCCD.2
香灰菌的ITS序列
TCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTAATCCGAGGTCAACCACTATAAGTTATAGGGGGTTTTACGGCAAGCAGCTACAGCCTCCCTGAAAGCGAGTTAAACTACTACGCTTAGAGTGTGCTATAACCCCGCCACTAAATTTAAGGAACTACCCCTCAGTGAGGGGTAGATTCCCAACGCTAAGCTACAAGGCTTAAGGGTTGTAATGACGCTCGAATAGGCATGCCCACTAGAATACTAATGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGTCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACGTATTTGGTTTTTAAAACCTTGGTTTGATCACCCCCTAAGAACCGTAGTTTATAGGTGGCTTTTGCCAATTTTATGAATTCATTCAGACCCCTCAGAGCTTTGAACAATTTTCGAGCAGATATTGTAGCTTGAAAACAAACGACTGCAGGGTAAAGAAATTATTATTTCGAGCAATAATTCCAACCAGGAAAGACGTTTTAGCGTAAAGAAAAAAAGCAAAAGCAGATTTTCGATAGTTGTTCAACGCGGGGTTGGATGCACTAGGTGCTTAAGTTTGGAGCGGTCCTACTCGGCGCCGCCGAGGCCTTGGTCAGCACCTTCACTGCACTAACCGTACCCCGAAGGATGGGTAGCACTCAGGCACCTCCCCAGCAGAACCCCCCCTTAGGGGAGCCCTGTGGGTAGGCTAAAGCGGTACGCCGGAGGAAACATAGGTAGGTTCACAAAGGGTTGGAGTTTTTGATAACTCAGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGACTTTTACTTCC。
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中华人民共和国国家标准
GB/T35880—2018
银耳菌种质量检验规程
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中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2018-09-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华全国供销合作总社提出。本标准由全国银耳标准化工作组（SAC/SWG9)归口。GB/T35880—2018
本标准起草单位：全国银耳标准化工作组、福建农林大学生命科学学院、古田县食用菌研发中心、古田县食用菌产业管理局。
本标准主要起草人：张琪辉、温志强、雷银清、余新敏、龚宽俊、金珊珊、彭冬祥、林铃。1范围
银耳菌种质量检验规程
GB/T35880—2018
本标准规定了银耳菌种质量检验的术语和定义、抽样、检验内容与方法、质量要求、判定规则。本标准适用于银耳菌种质量的检验。2
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T29368银耳菌种生产技术规范GB/T30989
高通量基因测序技术规程
NY/T1284食用菌菌种中杂菌及害虫的检验3
3术语和定义
GB/T29368界定的以及下列术语和定义适用于本文件。为了便于使用，以下重复列出GB/T29368中的一些术语和定义。
tremella culture
银耳菌种
生长在适宜基质上具有结实性的银耳菌丝和香灰菌丝的混合培养物注：包括银耳母种、银耳原种和银耳栽培种。3.2
银耳母种
stockcultureof tremella
经混合培养或基内分离得到的具有结实性的银耳菌丝和香灰菌丝的混合培养物。注1：改写GB/T29368—2012，定义3.10。注2：也称银耳一级种。
motherspawnoftremella
银耳原种
由银耳母种移植、繁殖的培养物。注：也称银耳二级种。
spawn of tremella
银耳栽培种
由银耳原种移植、繁殖的培养物。注：也称银耳三级种。
银耳菌种真实性
genuineness of tremella culture同时含有银耳菌丝和香灰菌丝的菌种。1
-TTKAONIKAca
GB/T35880—2018
银耳菌种活力tremellacultureactivity银耳菌种生长、繁殖、形成子实体的能力。3.7
白毛团myceliumpellet
银耳菌丝与香灰菌丝混生在培养基表面形成的白色菌丝团。［GB/T29368—2012,定义3.4
银耳菌丝体myceliumoftremella由许多银耳菌丝联结在一起组成的营养体。注：银耳菌丝颜色白至黄色，红细，具分枝及分隔，镇状联合明显。3.9
香灰菌丝体
myceliumof cohabitantfungus
由许多香灰菌丝联结在
起组成的营养体。
，量羽毛状分枝，爬壁能力和分解纤维素能力强，能分泌黑色素，与银耳菌丝伴生。注：香灰菌丝细长，
accase
含四个铜离于的多酚氧化酶，属手铜蓝单花酶，以单体精蛋白的形式存在注：漆存在于菌类、植物电可存活手室气中其独特的催化特被广之应用手生物检测。4抽样
抽样方法
采用随机抽样法。银耳母种银耳原种银耳裁培种的拍样数量（瓶，袋）分别以每批生产的菌种数量（以每天的生产数量为一批）为单位，按式的详算捕样数量2
式中：
抽样数量：
每批数量。
计算结果保留整数。
样品的运输与保藏条件
+++(1)
样品在运输过程中容器内的温度应控制在18℃～23℃，湿度自然；待检样品应放置在18℃～23℃，湿度白然的环境中，24h内检测；保留样品应放置在18℃～23℃，湿度白然的环境中保藏备查，保藏时间20天。
5检验内容与方法
仪器设备和试剂
仪器设备
放大镜：10倍。
KAoNiKAca
5.1.1.2体视显微镜：50倍。
5.1.1.3灭菌锅：最大温度可达126C，最大压力可达0.155MPa。5.1.1.4
恒温水浴锅：土1℃C。
高速冷冻离心机：转速可达10000r/min。超净工作台：洁净等级100级@≥0.5μm。5.1.1.7
PCR仪。
5.1.1.8电泳仪：可电压6V~600V，电流4mA~400mA。5.1.1.9
凝胶成像系统。
紫外可见分光光度计。
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的三级水。5.1.2.1
三羟甲基氨基甲烷。
二水合乙二胺四乙酸钠。
盐酸。
氢氧化钠。
氯化钠。
三甲基溴化铵。
聚乙烯吡咯烷酮。
氯仿。
异戊醇。
饱和酚。
乙醇。
核糖核酸酶（RNase酶）。
硼酸。
引物ITS4。
引物ITS5。
PCR扩增缓冲液（10X，pH8.3）。脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）。TaqDNA聚合酶(1.5U)。
核酸染料。
分子标记(DNAmarker)：2000bp。琼脂糖。
重蒸水：应符合GB/T6682规定的二级水及以上标准。感官检验
母种、原种、栽培种感官检验内容和方法如表1所示。GB/T35880—2018
iKAoNiKAca
GB/T35880—2018
菌种级别
表1母种、原种、栽培种感官检验内容和方法检验内容
菌种容器外观
栽培种
菌种瓶和标签的完整性；菌种瓶塞（盖）的松紧度、干燥度、清洁度、气味、杂菌、害虫和其他污染物
杂菌及害虫检验
菌丝体外观
白毛团、香灰菌、子实体生长
白毛团、香灰菌生长状态
母种、原种、栽培种的杂菌及害虫检验按照NY/T1284的规定进行真实性检验
DNA的提取
检验方法
用眼睛观察、鼻闻、手触摸，必要时用放大镜或体视显微镜观察
母种、原
真种、栽培种DNA的提联按照附录A的方法进行也可以采用DNA提取试剂盒进行，要求得到的DA浓度不低于50ng/L1A260/A2802.0.琼脂糖凝胶电泳给果条带清晰不拖尾。用TE缓冲液将DNA浓度裤释创50定10ong/l
ITS序列分析
中ITS序列务析按照附录B的方法进行。银耳南菌种
5.5活力检验
银耳菌种活力检验按照附录的方法质量要求
母种、原种、裁培种感官要求应符合表2的规定。表2母种、原种、栽培种感官要求菌种级别
栽培种
菌种容器外观
标签应注明品种名称、菌种
级别、接种日期、保裁条件、
保质期、菌种生产单位名称
等，菌种瓶应无破损，菌种www.bzxz.net
瓶塞（盖）应干燥、洁净、无
脱落、无异味、无杂菌、无害
虫和其他污染物
杂菌及害虫
菌丝体外观
白毛团应结实圆润，香灰菌丝爬壁呈羽毛状，分泌的黑色素均匀无杂色；无桔抗线，原基表面分泌液清澈透明，子实体耳片整齐、无异状白毛团应结实圆润：香灰菌丝爬壁呈羽毛状，分泌的黑色素均勾无杂色：无拮抗线：原基表面分泌液清澈透明：子实体耳片整齐、无异状培养基表面出现许多小而紧实圆润的白毛团：香灰菌丝生长健壮、分布均勾、呈羽毛状；无抗线
银耳菌种杂菌及害虫检验应同时符合以下规定：TTKAONTKAca
GB/T35880—2018
用放大镜观察，培养物表面没有光滑、润湿的黏稠物；菌种瓶塞（盖）处或培养基面没有与正常颜色不同的霉菌斑点，没有害虫的卵、幼虫、蛹或成虫；用显微镜观察，培养物没有不同粗细菌丝或异样孢了存在，没有害虫的卵、幼虫、蛹或成虫；b)
NA培养液清澈无浑浊，PDA培养的菌种菌丝生长速度、菌落特征、孢子特征与正常菌种c
6.3真实性
母种、原种、栽培种真实性应符合以下规定：ITS序列分析过程中，电泳结果同时出现535bp和910bp两条片段，且测序结果满足其中a
535bp的片段序列和银耳的ITS序列相似性达98%以上：其中910bp的片段序列和香灰菌银耳和香灰菌的ITS序列参见附录D的ITS序列相似性达99%以上。
银耳菌种同时含有银耳ITS标记和香灰菌ITS标记。h)
6.4漆酶活力
母种、原种
裁培种的漆酶活力应符合表3的规定。表3母种，原种、栽培种漆酶的酶活力指标菌种级割
酶活力/（U/L）
判定规则
7.1合格菌种
感官、真实性、杂菌及害虫、活力巧符合要求的为合格菊种7.2不合格菌种
感官、真实性、杂菌及害虫、活力若有一项不符合要求即为不合格菌种裁培种
iiKAoNrKAca
GB/T35880—2018
A.1溶液配制
A.1.11.0mol/LpH8.0的Tris-HCI附录A
（规范性附录）
DNA提取方法
称取三羟甲基氨基甲烷（Tris)121.14g，用800mL蒸馏水溶解，然后用1.0mol/L的HCl溶液调节pH到8.0再用蒸馏水定容至1000mLA.1.20.5mol/LpH8.0的EDTA溶液称取二水合乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na·2HzO)186.1g，用800mL蒸馏水溶解，然后用1.0mol/L的NaOH溶液调节pH到8.0，再用蒸留水定容至1000mL。A.1.3提取缓冲液（SDEB）
称取氯化钠0.585g，量取1mol/LpH8.0的Tris-HCl溶液25mL、0.5mol/LpH8.0的EDTA溶液10mL，用蒸馏水溶解定容至100mL，灭菌冷却后待用。A.1.42×CTAB缓冲液
称取十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)2.0g、氯化钠8.2g、聚乙烯吡咯烷酮1.0g，量取1mol/LpH8.0的Tris-HCI溶液10mL、0.5mol/LpH8.0的EDTA溶液4mL，用蒸馏水溶解定容至100mL，灭菌冷却后待用。
A.1.5TE缓冲液
量取的pH8.0的1.0mol/LTris-HCI溶液1.0mL与pH8.0的0.5mol/LEDTA溶液0.2mL混合后，用重蒸水定容至100mL。
A.1.65×TBE缓冲液
称取Tris54.0g，硼酸27.5g，用20mL0.5mol/LpH8.0的EDTA溶液溶解后用蒸馏水定容至1000mL
A.2DNA提取
DNA提取按照以下步骤进行：
称取白毛团0.1g～0.2g放人研钵中，加液氮研磨至粉状后转移到2mL离心管中，往离心管a)
中加人400μL提取缓冲液（SDEB），涡旋震荡，必要时用手弹离心管使粉末充分溶于SDEB：往离心管中加入2×CTAB缓冲液400uL；b）
在通风厨中，往离心管中加入饱和酚250μL和氯仿：异戊醇一24：1的溶液250μL，室温涡旋5min，
d）13000r/min，4℃条件下离心5min；6
rikANrkAca
吸取650μL上清液，转移到1.5mL离心管中；往上清液中加入455uL(0.7倍体积）的异丙醇，上下颠倒混匀；13000r/min，4℃条件下离心10min；GB/T35880—2018
倒掉上清液，13000r/min，4℃条件下离心10s，用200uL移液枪将离心管中残余的上清液弃除；
往离心管沉淀中加入70%乙醇900uμL，用手指弹离心管使白色沉淀悬浮；13000r/min，4℃条件下离心10min；用1mL移液枪吸取上清液弃除；
13000r/min，4℃条件下离心10s，用200μL的移液枪将离心管中残余的上清液弃除；m）在通风厨中，打开离心管盖子，放在96孔板上，让96孔板板面与通风厨台面成直角，放置10min;
往离心管中加人50μ山L~100μL含有RNase酶的TE缓冲液，55水浴30min；将溶解后的DMA暂有于冰上，分别采用超微量分光光度计和1%～1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和质量。
TiKAONrKAca
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B.1ITS引物
（规范性附录）
ITS序列分析
引物选用ITS-基因间隔序列4（ITS4）和ITS基因间隔序列5（ITS5），引物序列为：ITS4：5°-TCCTCCGCT TAT TGA TATGC-3,ITS5:5-GGAAGT AAA AGT CGT AACAAGG-3。B.2
ITS反应体系和条件
PCR反应体系（25μL）
PCR反应的总体积为25μL，含有2.5μL10×PCR反应缓冲液，0.2mmol/LdNTP，引物4μmol/L，20ng～50ng模板DNA，1.5UTaq酶，双蒸无菌水补充体积到25μL。按上述比例将反应液各组分加入0.2mLPCR管中，混匀，放入PCR仪中，进行PCR扩增。B.2.2PCR反应条件
PCR扩增仪上进行以下循环：94℃预变性5min，然后94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，扩增35个循环，最后72C延伸10min，4℃保存。3测序分析
PCR产物经1%～1.5%琼脂糖检测后进行单一片段回收，对回收产物按照GB/T30989方法进行测序，测序结果在DNAman软件中同附录D中银耳和香灰菌的标准序列进行双链比对。8
C.1溶液准备
C.1.10.1mol/L邻苯二酚溶液
附录C
（规范性附录）
漆酶活力测定方法
称取邻苯二酚（CHOz，Mr=110.11)11g用蒸馏水溶解并定容至1000mLC.1.20.1mol/LpH4.5的醋酸-醋酸钠(HAc-NaAc)缓冲液称取醋酸钠4.1g，用蒸馏水溶解，再用冰醋酸调节pH至4.5，定容至500mL。C.1.31mmol/L的2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）溶液称取0.0274gABTS用pH4.5醋酸钠缓冲液定容至50mL。C.1.4粗酶液
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把银耳菌种里的子实体去除，然后将上层2cm的菌种用拌种器打碎搅拌均匀；取搅拌后的菌种5.0g，加人25mL蒸馏水并搅勾，浸提2h，在4℃下10000r/min离心10min后所得上清液即为粗酶液。设置3～5个重复。
C.2测定步骤
在5mL试管中分别加人0.1mol/LpH4.5的HAc-NaAc缓冲液2.7mL、1mmol/L的2'-联氨双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）溶液0.2mL、粗酶液100μL，28℃水浴保温30min，室温下用紫外分光光度计，在420nm波长测量反应液的OD值，设置3个～5个重复，最终结果取平均值。以沸水煮10 min灭活的粗酶液为对照。C.3结果计算
将C.2中测得的OD值代入式(C.1)计算得到漆酶活力：漆酶活力（U/L)
式中：
反应体系的总体积，单位为毫升（mL）；粗酶液的体积，单位为毫升（mL）；反应前后OD值变化；
反应时间，单位为秒(s)；
420nm处ABTS摩尔吸光系数为36000L·mol-1，cm-1。结果保留2位小数。
.(C.1)
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银耳的ITS序列
附录D
（资料性附录）
银耳和香灰菌的ITS序列
TCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAGCCCTACCTGATTTGAGGCCAGAGTGCAAAAGTAAAGGGGGTTGTGAGCGGCCCACAGTCGACGCGTAACTTACGACGTCTGCGTGAAACCACTAACGCATTTAAGGCCAGCCAGAGAGGCAGGGCCCAAATCCAACACCGCCGGGTCAGAAACCCAGGGGGTTGAGTCTACATGACACTCAAACAGGCATGCCTTTCGGAATACCAAAAGGCGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTTTCGCAATTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTGTTTCATGTTATGATGCATTACGTTCTTGACATATGTTTGTGTGAAGGCGGCCCGGCCCGGGGGCGCGGTCCGATGTGCACAGGTGTTTGGAAGGGCCTCGTGGCCCGGTGTAATCTCAAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCCD.2
香灰菌的ITS序列
TCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTAATCCGAGGTCAACCACTATAAGTTATAGGGGGTTTTACGGCAAGCAGCTACAGCCTCCCTGAAAGCGAGTTAAACTACTACGCTTAGAGTGTGCTATAACCCCGCCACTAAATTTAAGGAACTACCCCTCAGTGAGGGGTAGATTCCCAACGCTAAGCTACAAGGCTTAAGGGTTGTAATGACGCTCGAATAGGCATGCCCACTAGAATACTAATGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGTCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACGTATTTGGTTTTTAAAACCTTGGTTTGATCACCCCCTAAGAACCGTAGTTTATAGGTGGCTTTTGCCAATTTTATGAATTCATTCAGACCCCTCAGAGCTTTGAACAATTTTCGAGCAGATATTGTAGCTTGAAAACAAACGACTGCAGGGTAAAGAAATTATTATTTCGAGCAATAATTCCAACCAGGAAAGACGTTTTAGCGTAAAGAAAAAAAGCAAAAGCAGATTTTCGATAGTTGTTCAACGCGGGGTTGGATGCACTAGGTGCTTAAGTTTGGAGCGGTCCTACTCGGCGCCGCCGAGGCCTTGGTCAGCACCTTCACTGCACTAACCGTACCCCGAAGGATGGGTAGCACTCAGGCACCTCCCCAGCAGAACCCCCCCTTAGGGGAGCCCTGTGGGTAGGCTAAAGCGGTACGCCGGAGGAAACATAGGTAGGTTCACAAAGGGTTGGAGTTTTTGATAACTCAGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGACTTTTACTTCC。
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